Штамм Х-вируса картофеля Х65 для вакцинации растений картофеля Советский патент 1991 года по МПК C12N7/00 

Изобретение относится к фитовирусо- логии, точнее к защите растений от вирусных болезней.

Цель изобретения - получение вакцинного штамма Х-вируса картофеля, обладающего большой генетической стабильностью, вакцинирующим эффектом повышенной длительности и способствующего сохранению высокого урожая картофеля.

Штамм Xes ВНИИЗР Ms 7 характеризуется следующими свойствами.

Морфологические признаки.

Размер вирио.нов 525 нм х 10 нм. Температурная точка инактивации (ТТИ) 76 ± 1°С. В клетках растений дурмана образует крупнозернистые круглые или овальные Х-тела.

Физиологические признаки.

Непатогенен для растений картофеля разных сортов и дурмана Datura stramonium L - растения-индикатора штаммов ХВК. Не

влияет на их рост и развитие, не вызывает симптомов заболевания. Концентрация штамма Xes в растениях картофеля и дурмана на 2-3 порядка ниже концентрации патогенных штаммов ХВК.

Обладает высокой защитной способностью против патогенных штаммов ХВК. Защищает растения картофеля от заражения сильнопатогенными штаммами ХВК начиная с седьмого дня после введения штамма Xes в эти растения.

Обладает высокой генетической стабильностью и длительным защитным вакцинирующим эффектом. В лабораторных условиях вакцинирующий эффект штамма Xes составляет 91 %.

Относится к группе слабопатогенных штаммов ХЕ по градации КбЫег (1962).

Серологические (антигенные) свойства.

Qs 09 XI О

О

о

Обладает высокой антигенной активностью. Титр моноштаммовых диагностиче ских сывороток равен 1:4096-1:8192.

По уровню РНК-азной активности штамм относится к слабопатогенным. РНК- азная активность его близка к уровню РНК- азной активности здоровых растений.

Штамм Хб5 не снижает урожай картофеля. Урожай картофеля, зараженного штаммом Хб5, выше на 7,9-20,4% в сравнении с контрольными (здоровыми) растениями.

Культивирование.

Штамм Хбб легко передается механически с помощью карборунда на растения картофеля, дурмана и др.

Штамм Xes сохраняется в лиофильно высушенных очищенных препаратах без потери инфекционности до трех лет, в листьях картофеля и дурмана, помещенных в насыщенный раствор сахарозы, - более года, в течение шести лет (время наблюдения) сохраняется в клубнях картофеля, передаваясь без изменения патогенности через клубневое потомство.

П р и м е р 1. Изучение симптоматологии штамма Хб5 ВНИИЗР № 7 в сравнении с другими различными по патогенности штаммами и изолятами ХВК проводили на двадцати различных видах и сортах растений, в том числе на десяти сортах картофеля.

Опыты проводили в условиях теплицы и на опытном участке в течение шести лет.

По 50-100 молодых растений в фазе 3-5 листьев Datura stramonium L.; Datura inermis L.; Datura mete) L; Datura tatula L.; Gomphrena globosa L.; Nicotiana tabacum, сортов Самсун, Nicotiana sylvestrls, сортов томата Украинский тепличный 285, Украинец, Волгоградский 5/95, сортов картофеля Искра, Невский, Зарево, Мавка, При- екульский ранний, Адретта, Чаривныця, Гатчинский, Домодедовский, Луговской заражали слабопатогенным штаммом Xes и другими различными по патогенности штаммами и изолятами ХВК. Контроль - здоровые (незараженные) растения. В течение вегетационного периода (двух-трех месяцев) проводили наблюдения за проявлением симптомов заболевания.

Установлено, что штамм Xes на всех исследованных видах и сортах растений не вызывает симптомов заболевания в течение всего вегетационного периода в отличие от патогенных штаммов ХВК, которые на этих растениях вызывают ярко выраженную мозаику с первичными и вторичными некротическими пятнами. Эти растения отстают в росте и развитии.

П р и м е р 2, Изучение влияния штамма Xes на рост и развитие растений картофеля и дурмана проводили в сравнении со здоровыми (незараженными) растениями и растениями, зараженными сильнопатогенным штаммом ХВК.

Молодые растения картофеля сорта Гатчинский первой клубневой репродукции и дурмана Datura stramonium L. в фазе 3-5

0 листьев заражали штаммами ХВК. В период максимального накопления вируса (на 21-й день после заражения) проводили определение.

В табл,1 показано влияние штаммов

5 ХВК различной патогенности на рост и развитие растений картофеля сорта Гатчинский и дурмана Datura stramonium L.

Установлено, что штамм Хбб не влияет отрицательно на рост и развитие растений

0 картофеля и дурмана, увеличивая по сравнению с контрольными (здоровыми) растениями их вес на 1,7 и 1,4% соответственно, тогда как сильнопатогенный штамм ХВК резко снижает вес этих растений в течение

5 месяца выращивания на 30 и 13% и высоту растений на 38,2 и 12,1% соответственно.

П р и м е р 3. Для сравнительной характеристики штамма Xes с более патогенными штаммами ХВК был применен биохимиче0 ский метод оценки их патогенности, основанный на определении активности РНК-азы у зараженных растений.

Использовали растения картофеля сорта Гатчинский в стадии пробирочной культу5 ры, выращенные из клубней первой репродукции (последействие первого года), и дурмана Datura stramonium L, которые в фазе трех-пяти листьев инокулировали штаммом Xes и сильнопатогенным штаммом

0 ХВК. Патогенность штамма Xes определяли по максимальному значению активности РНК-азы и сравнивали в процентном отношении с контролем (здоровые растения) и с сильнопатогенным штаммом ХВК. Исследо5 вания проводили в динамике развития инфекции в растениях в течение двух месяцев после заражения и в растениях, выращенных из клубневого потомства зараженного ХВК картофеля (табл.2).

0 Выявлено, что уровень РНК-азной активности под влиянием штамма Xes ниже по сравнению с сильнопатогенным штаммом ХВК на 230% (на картофеле) и на 127% (на дурмане) и приближается к уровню РНК-аз5 ной активности здоровых растений, превышая его на картофеле всего на 5%, а на дурмане на 11 %, что свидетельствует о низкой патогенности штамма Xes.

В табл.2 приведена активность РНК-азы в листьях растений картофеля сорта Гатчинский и дурмана Datura stramonium L, зараженных штаммами ХВК различной пэтоген- ности.

Положительная корреляция между па- тогенностью штаммов ХВК и активностью РНК-азы сохраняется в течение всего периода развития инфекции, а также передается через клубневое потомство зараженных ХВК растений картофеля.

П р и м е р 4. Реверсибельные свойства штамма Xes изучали в течение шести лет на растениях картофеля сорта Гатчинский, оздоровленного методом культуры меристемы, в течение первой-пятой клубневых репродукций, на растениях картофеля сорта Искра четвертой и пятой клубневых репродукций и на растениях дурмана Datura stramonium L. в течение 15 пассажей.

Исследования проводили на опытном участке и в условиях теплицы. По 10 мЬно- дых растений растения-индикатора штаммов ХВК Datura stramonium L. заражали инокулюмом от растений картофеля разных клубневых репродукций; растений дурмана с разными пассажами штамма Х0$; тьев растений картофеля и дурмана с Xes, хранившихся в течение четырех лет в насыщенном растворе сахарозы, а также в лиофильно высушенных очищенных препаратах штамма Xes, хранившихся три гада при4±1°С.

Выявлено, что растения дурмзна, зараженные штаммом Xes, во всех вариантах оставались бессимптомными в течение всего вегетационного периода, что характерно для симптоматологии штамма Хб5.

Следовательно, штамм Xes не изменяет своей патогенности в клубневом потомстве на картофеле в течение шести лет (время наблюдения), при 15 пассажах на дурмане и при хранении в лиофильно высушенных препаратах в течение трех лет, т.е. обладает высокой генетической стабильностью,

П р и м е р 5. Опыты по определению вакцинирующего эффекта штамма Xes про- водили в условиях теплицы на растениях картофеля сорта Гатчинский, выращиваемых в вазонах.

Схема опыта.

Вариант 1 - контроль (незараженные растения).

Вариант 2 - растения, зараженные штаммом Xes.

Вариант 3 - растения, зараженные штаммом Xes, и на 1-10 дни вторично зара- женные сильнопатогенным штаммом ХВК.

Вариант 4 - растения, зараженные сильнопатогенным штаммом ХВК.

В каждом варианте использовали по 100 растений картофеля (по 25 растений в

четырех повторностях). Растения зараляют в фазе 3-5 листьев механически с помощью карборунда. В течение трех месяцев наблюдают за ростом и развитием растений, симптомами, проводят серологический и электронно-микроскопический анализы на наличие вирусов.

В результате проведенных исследований выявлено, что заражение штаммом Xes предохраняет растения картофеля от сильнопатогенного штамма. Четко проявляется защитная способность штамма Хб5 начиная с седьмого дня после его введения в растения (табл.3). Растения, зараженные штаммом Xes (вариант 2), остаются бессимптомными в течение всего периода проведения опыта.

На растениях картофеля, зараженных сильнопатогенным штаммом ХВК (вариант 4), через две недели появляются ярко выраженные симптомы в виде крапчатой пятнистости, морщинистости листьев, первичной и вторичной некротизации. Растения отстают в росте и развитии.

В табл.3 дано определение вакцинирующего эффекта штамма Xes в растениях картофеля сорта Гатчинский.

В варианте 3 на 100 исследованных растений, зараженных вначале штаммом Xes, а затем на седьмой день - массированно патогенным штаммом, выявляют только 9 растений с симптомами крапчатой мозаики, остальные оставались бессимптомными. Следовательно, вакцинирующий эффект штамма Xes равен 91 %,

Штамм Xes обладает длительным вакцинирующим эффектом. Растения картофеля, зараженные этим штаммом, в течение всего вегетационного периода остаются бессимптомными. Бессимптомными остаются также растения картофеля, содержащие штамм Xes, и в шестой клубневой репродукции (время наблюдения).

П р и м е р 6. Изучение влияния штамма Xes на урожай картофеля проводили на сорте Гатчинский в течение трех лет с 1984 по 1986 г.

Схема опыта.

Вариант 1 - контроль (здоровые растения).

Вариант 2 - растения, зараженные штаммом Xes.

Вариант 3 - растения, зараженные сильнопатогенным штаммом ХВК.

В качестве исходного материала берут пробирочные меристемные растения сорта Гатчинский, которые в количестве 75 штук были высажены в трехлитровые вазоны в январе 1984 г. в условиях теплицы.

По 25 растений вфозе трех-пяти листьев заражали (08 02.84)слабопатогенным штаммом XGS и сильнопагогенным штаммом ХВК 25 растении были оставлены в качестве контроля.

Способ заражения штаммами ХВК состоял в однократном опрыскивании растений картофеля разбавленными вирусными суспензиями с карборундом с помощью ранцевого опрыскивателя при давлении 3,5 атм на расстоянии 10-15 см от поверхности листьев.

В течение трех месяцев проводили наблюдение за ростом и развитием растений. Растения, зараженные XGS, оставались бессимптомными, а на растениях картофеля, зараженных сильнопатогенным штаммом ХВК, проявилась ярко выраженная мозаика. Серологические анализы показали наличие ХВК во всех зараженных растениях, В конце апреля 1984 г. клубни от меристемных растений собирали и обрабатывали стимуляторами для прерывания периода покоя с целью использования их в полевом опыте по изучению влияния последействия штаммов ХВК на урожай картофеля в 1984 г.

В опыте 1984 г. использовали 206 проросших после стимуляции меристемных клубней, из них здоровыми (контроль) были 61 клубень; со штаммом Хб5 - 73 клубня; с сильнопатогенным штаммом - 72 клубня. Клубни высаживали для размножения на опытный участок в условиях тщательной изоляции.

В течение вегетационного периода проводили наблюдение за ростом и развитием опытных растений, учет симптомов на них и серологический анализ на наличие вирусов. Такие наблюдения и учеты проводили также в дальнейшем при выращивании картофеля в последующие годы

При выращивании растений картофеля в полевых условиях в 1984 г отмечали, что растения, содержащие штамм Xes, оставались бессимптомными, ;i растения, содержащие сильнопатогенный штамм ХВК, были с симптомами ярко выраженной мозаики и отставали в росте и развитии. В итоге пол учали первую полевую клубневую репродукцию, учет урожая котором был проведен по клонам

Результаты опыта приведены в табл.4.

Как видно из данных таблицы, вес клонов от растений, содержащих штамм Xes, на 7,9% больше веса клонов в контроле (здоро- зые растения). Сильноплтогенный штамм КВК снизил вес клонов нэ 41,7%. Получен- 1ые клубни были использованы для закладки опыта в 1985 г

Для получения данных последействия второго года 609 клубней первой полевой клубневой репродукции высаживали на опытный участок, в том числе в контроле - 178 клубней, содержащих штамм Хб5 - 315 клубней и содержащих сильнопатогенный штамм ХВК - 116 клубней .

Установлено, что растения, содержащие штамм Xes,оставались бессимптомны0 ми, а растения с сильнопатогенным штаммом ХВК - с симптомами ярко выраженной крапчатой мозаики. Учет урожая показал превышение веса клонов со штаммом Хб5 на 11,7% по сравнению с контролем,

5 тогда как сильнопатогенный штамм ХВК снизил урожай клонов на 50,4%. Полученные клубни были использованы для закладки опыта в 1986 г.

Затем для получения данных последей0 ствия штаммов ХВК третьего года использовали клубни второй полевой клубневой репродукции. Всего использовано 600 клубней, по 200 клубней в каждом варианте. Опыт проводили в четырехкратной повтор5 ности на двухрядковых делянках по 25 растений в рядке. Схема посадки 70x35 см. Наблюдения и учет те же, что и в прошлые годы.

Установлено, что штамм Хб5 не влияет

0 на рост и развитие растений картофеля, не вызывает на них симптомов заболевания, тогда как сильнопатогенный штамм ХВК вызывает ярко выраженную крапчатую мозаику, растения отстают в росте и развитии.

5 При учете урожая установлено, что вес клонов со штаммом Xes больше на 14,5% по сравнению с контролем. Сильнопатогенный штамм ХВК снижает вес клонов на 31,7%. Пример 7, Повышение урожая карто0 феля, зараженного штаммом Xes, отмечали в опыте на растениях картофеля сорта Гатчинский, где в качестве исходного материала брали меристемные клубни, полученные в полевых условиях,

5 Опыт проводили в соответствии со схемой, изложенной в примере 6. Проводили такие же наблюдения и учеты.

В табл.4 показано влияние штаммов ХВК на урожай картофеля сорта Гатчинский.

0

При учете урожая картофеля установлено, что вес клонов растений, зараженных штаммом Xes, больше на 20,4% по сравнению с контролем. Сильнопатогенный штамм

5 ХВК снижает вес клонов на 46,5% (табл.4). Таким образом, установлено, что штамм Хб5 не оказывает отрицательного влияния на урожай картофеля сорта Гатчинский в течение трех лет (время наблюдения), а наоборот, четко проявляется тенденция стимуляции урожая на 7,9-20,4% по сравнению с контролем (здоровыми растениями).

Примере. Сравнительное испытание свойств штаммов ХВ К проводили в 1989 году на меристемных растениях картофеля пробирочной культуры сорта Невский в теплице в зимне-весенний период и в полевых условиях.

Схема опыта.

Вариант 1 - контроль (здоровые, без заражения, растения картофеля).

Вариант 2 - растения картофеля, зараженные штаммом ХВК Xes.

Вариант 3 - растения картофеля, зараженные штаммом ХВК Ху.

В каждом варианте использовали инфекционный сок растений дурмана Datura stramonium L, зараженных штаммом ХВК Xes или Ху. Заражение растений проводили механически с помощью карборунда.

В течение вегетационного периода проводили наблюдения за ростом и развитием растений, учет симптомо в, серологический анализ на наличие вирусов картофеля.

Выявлено, что штамм ХВК Xes ВНИИЗР №7 не вызывает симптомов заболевания на растениях картофеля, не влияет на их рост

и развитие как в вегетационном, так и в полевых опытах.

Данные учета урожая показывают, что урожай картофеля, зараженного штаммом Xes, в сравнении с контрольными растениями выше в вегетационном опыте на 22,5% и в полевом на 20,4%. Урожай картофеля, содержащего штамм Ху, выше урожая с контролем в вегетационном опыте на 6,3% ив полевом опыте на 7,5% (табл.5). В табл.5 показано влияние штаммов ХВК Хб5 и Ху на урожай картофеля сорта Невский (в опыте использованы меристем- ные растения пробирочной культуры).

Таким образом, сравнительное изучение штаммов ХВК Xes и Ху показывает, что урожай картофеля, зараженного штаммом Xes, выше урожая картофеля, содержащего штамм Ху, в вегетационном опыте на 16,2% и в полевом опыте на 12,9%.

Следовательно, штамм ХВК Xes обладает более высокими вакцинными свойствами, чем штамм Ху.

Формула изобретения Штамм Х-вируса картофеля Xes ВНИИЗР № 7 для вакцинации растений картофеля.

Таблица 1

Изобретение относится к фитовирусо- логии, точнее к защите растений от вирусных болезней. Цель изобретения - получение вакцинного штамма Х-вируса картофеля, обладающего большой генетической стабильностью, вакцинирующим эффектом повышенной длительности и способствующего сохранению высокого урожая картофеля. Указанная цель достигается использованием в качестве вакцинного штамма Хб5, депонированного в коллекции штаммов ВНИИЗР под Ms 7. Этот штамм обладает высокой защитной способностью против патогенных штаммов Х-вируса картофеля. 5 табл.

Картофель

25 25

25

ман

40

40

40

69,3 70,5

43,5

+ 1,2

-20,3

34,7

35,2 +0,5

30,2

-4,5

+ 1,2

56,0 + 1,7 58,7 +3,7 +6,6

-20,3 -30,0 34,6 -21,4 -38,2

40,5 +1,4 40,5

-13,0 35,6 -4,7 -12,1

Т а 6 /i и ц а 2

Таблица 3

яя клубневая репродукция)

61 73

161,5 174,5

7294,2

ая клубневая р«продукция)

+ 12,8 -67,3

178 315

1270 1418

116 630 -640 я клубневая репродукция)

73 41

109Э 1316

+ 223

65 585 -508 тья клубневая репродукция)

Контроль (здоровые растения)200

Растения, зараженные штаммом X(J200

Растения, зараженные

скльнопатогенным

штаммом ХЗК200

Были высажены меристемные клубни, полученные в теплице из пробирочных мсрнстемных растений.

Редактор М. Петрова

Техред М.Моргентал

Заказ 3678ТиражПодписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Г т 0 jt н ц n 4

+ 12,8 -67,3

-640 ция)

+ 223

-508 укция)

+ 185

-404

+ 11,7 -50,4

+ 20,4 -46,5

+ 14,5 -91,7

Таблица 5

Корректор г Т. Палий