Способ относительной оценки степени патогенности штаммов Х - вируса картофеля Советский патент 1990 года по МПК C12Q1/00 A01N63/04 C12N7/00 

-Йзобретение относится к фитопа- тологии, в частности к методике отно- .сительной оценки патогенности штам- мов Х-вируса картофеля.

Цель изобретения - повышение достоверности способа.

Способ осуществляют следующим разом.

В опыте используют две группы растений-индикаторов. В первую группу входят растения, зараженные сильнопатогенным штаммом Х-вируса картофеля, во вторую - слабопатогенным. Растение-индикатор в возрасте 3-4 недель заражают исследуемыми штаммами. Через 5 сут. из каждой группы готовят препараты для исследования под электронным микроскопом ультраструктуры клеток листа. Для этого небольшие кусочки ткани с верхних листьев фиксируют, обезвоживают и заключают в эпоксидную смолу.

Из полученных блоков готовят срезы, которые просматривают на од- нощелевых блендах в электронном микроскопе. Исследуют активность накопления ламинарных структур, митохондрий и мембран агранулярного ретикулума в клетках. По активности накопления в клетках ламинарных структур, митохондрий и мембран эндоплазматн- ческого ретикулума судят о степени патогенности штамма. При этом более высокая активность накопления названных структур свидетельствует о более высокой патогенности штамма. Пример. У двух групп растений дурмана Datura stramonium L. (по пять растений в каждой группе) в возрасте 3-4 недель, выращенных в теплице, два нижних листа напыляли карборундом, при этом одну группу растений инокулировали соком листьев дурмана, пораженных сильнопатоген-

СП

са

00

се

08

е

ным штаммом, а другую - соком листьев дурмана, пораженных слабопатогенным штаммом Х-вируса картофеля. Через 5 сут. готовили препараты для электронномикроскопических наблюдений. Для этого из верхних листьев размером около 7 см вырезали небольшие кусочки , фиксировали их 3 ч в 6,5%-ном растворе глутараль- дегида, приготовленном на фосфатном буфере (рН 7,4) и 2 ч - в 1%-ной четырехокиси осмия, затем обезвоживали в спирте и ацетоне и заключали в аралдит. Из полученных от каждого растения блоков готовили срезы, которые помещали на однощелевые бленды и исследовали в электронном микроскопе УЗИВ-100 АК.

Исследования показали, что в клетках мезофилла листьев растений, заражённых как сильнопатогенным, так и слабопатогенным штаммом ХВК, происходит новообразование ламинарных структур, а также увеличение количества митохондрий и мембран агра- нулярного эндоплазматического рети- кулума. Причем количество этих структур находится в прямой зависимости от степени патогенноети штамма. Зависимость мЪрфометрических параметров клеток мезофилла листьев дурмана от инфицирования их разными

штаммами представлены в таблице. .

Проведенный ультраструктурный анализ свидетельствует о том, что в клетках, пораженных сильнопатогенным штаммом, накапливается значительно больше в сравнении с клетками, зараженными слабопатогенньм штаммом, ламинарных структур, митохондрий, мембран агранулярного эндоплазматического ретикулума.

В известном способе связь репродукции вирулентного штамма с деструкцией хлоропластов не может служить надежным критерием степени па- тогенности штаммов, так как деструктивные изменения хлоропластов могут быть связаны не только с инфекцией, но и с рядом внешних факторов и прежде всего с дефицитом в почве минеральных элементов (азота, фосфора, калия, кальция и др.). Даже если выращивание растений, инфицированных разными штаммами, проводится в теплице в одинаковых условиях, недостаток какого-либо элемента в почве может вызывать деструктивные

изменения хлоропластов, не связанные с заражением. В таком случае оценить деструктивное воздействие

вирусной инфекции на хлоропласты затруднительно.

В зараженных силънопатогенным штаммом Х-вируса клетках растений в хлоропластах ХЛ (очень редко) образуются чашевидные инвагинации, Е которых обнаруживаются клеточные компоненты: митохондрии, рибосомы, различные мембранные образования. Еще реже встречаются хлоропласты с

5 чашевидными инвагинациями, в которых наблюдаются вирусные частицы.

При исследовании ультраструктуры

клеток растений дурмана, пораженных

сильнопатогенным штаммом ХВК, уста0 новлено, что вирус в инвагинациях был обнаружен лишь в шести случаях. В остальных случаях в клетках инфицированных сильнопатогенным штаммом ХВК хлоропласты не имеют инва5 гинаций, клетки содержат относительно небольшое количество вирусных частиц и большое количество ХВК-ин- дуцированных ламинарных структур ЛС в сравнении с клетками, инфицирован0 ными слабопатогенным штаммом ХВК. Кроме того, под действием сильнопатогенного штамма ХВК в клетках фор- .мируется большое количество мембран эндоплазматического ретикулума и

5 митохондрий по сравнению с клетками, инфицированными слабопатогенным штаммом.

В клетках, инфицированных слабопатогенным штаммом ХВК, также в очень

о редких случаях встречаются хлоропласты с чашевидными инвагинациями в том числе с инвагинациями, в которых обнаруживаются вирусные частицы. В исследованных хлоропластах в клет- 5 ках, зараженных слабопатогенным штаммом, обнаружено лишь две инвагинации с заключенными в них частицами ХВК. Таким образом, вирусные частицы встречаются, хотя и очень редко, в инвагинациях хлоропластов клеток зараженных как сильным, так и слабым штаммами ХВК. Следовательно этот признак - наличие вирусных частиц и инвагинациях хлоропластов - не может быть использован в качестве надежного критерия степени патогеннос- ти штаммов ХВК.

Признаком, отличающим клетки, зараженные слабопатогенньм штаммом

0

51

ХВК, являются накопление в клетках относительно большого количества вирусных частиц и существенно меньшего количества ламинарных структур митохондрий и мембран агронулярного эндоплазматического ретикулизма, по сравнению с клетками, инфицированными сильнопатогенным штаммом ХВК.

Способ относительной оценки степени интенсивности штаммов ХВК позволяет использовать защитные ответные реакции клеток на вирусное заражение, которые при одинаковых условиях выращивания зараженных разными штаммами растений будут зависеть лишь от вирусной инфекции. Установлено, что в клетках, зараженных сильнопатогенным штаммом ХВК, количество этих структур будет значительно больше, чем в клетках, зараженных слабопатогенным штаммом.

58986

Формула изобретения

Способ относительной оценки степени патогенности штаммов Х-вируса картофеля, включающий заражение растения-индикатора исследуемыми штаммами с последующим ультраструктурным сравнительны анализом клеток инфицированных листьев растения-индикаJQ тора и оценкой степени патогенности, отличающийс я тем, что, с целью повышения достоверности способа, ультраструктурному анализу подвергают индуцированные Х-вирусом

15 картофеля ламинарные структуры, митохондрии и мембраны агранулярного эндоплазматического ретикулума, определяют их количество, а оценку степени патогенности осуществляют

20 по количеству ультраструктур, при этом к более патогенным штаммам относят штаммы, под действием которых в клетках образуется большее .количество ультраструктур.

Изобретение относится к фитопатологии, может быть использовано сельскохозяйственными опытными станциями, селекционными центрами, НИИ сельского хозяйства. Цель изобретения - повышение достоверности способа оценки степени патогенности штаммов. Степень патогенности штаммов Х-вируса картофеля (ХВК) оценивают по активности накопления в клетках мезофила ХВК-индуцированных ламинарных структур, митохондрий, мембран агранулярного эндоплазматического ретикулума. Более патогенным считается тот штамм ХВК, который индуцирует большее накопление этих ультраструктурных компонентов. 1 табл.

Объемная плотность

ХВК-индуцированных

ламинарных структур,

% от объема клеток15,211,

Число митохондрий в 100 ,210,9

Поверхность мембран агранулярного эндоплазматического ре- тикулума в 1 мкм3, ,510,8

Число профилей

частиц ХВК в

1 мкм445±5,0

6,7tO,7

3,010,3 2,3±0,3

2,2±0,3 1,37±0,2

82t9,0