Штамм М-вируса картофеля для производства диагностической сыворотки Советский патент 1990 года по МПК C12N7/00 A01N63/00 

Изобретение относится к фитовиру- сологии, в частности к иммунодиагностике, и представляет собой новый штамм М-вируса картофеля для производства диагностической сьшоротки к этому вирусу.

Целью.изобретения является получение нового штамма М-вируса картофеля, обладающего более высокой антигенной активностью, обеспечивающего получение диагностической сыворотки к М-вирусу картофеля, реагирующей с различными штаммами М-вируса картофеля и не дающей реакцией с S-виру- сом картофеля.

Штамм М-вируса картофеля выделен из растений-картофеля сорта Прима. Монолинии вируса получены пассированием через некроз на листьях мари стенной с последующим наполнением на томатах сорта Петито.

Вновь выделенному штамму присвоен номер М-35. Штамм депонирован в коллекции ВИЗР под № 16.

Штамм М-вируса картофеля ВМЗР (№ 16/М-35) имеет следующую характеристику.

Штамм имеет нитевидные частицы размером нм, температурная точка инактивации , предельное

Ql

СО

Ю

азведение сока

104

1597389

длительность соханения инфекционности при 20-22 С оставляет 3 дня.

Штамм М-35 идентифицирован как , реднепатогенный по реакции, вызываеой им на растениях-индикаторах, влиянию на растения картофеля и на уроай картофеля, степени повьшения уров- ня активности РНКазы в соке листьев д нфицированных растений томатов, Штамм М-35 М-вируса картофеля вызывает преходящее просветление жилок истьев, мозаику, а затем слабое закручивание листьев и морщинистость |5 на растениях картофеля. Снижает уроай картофеля на 8-10% по сравнению со здоровьм контролем.

Штамм вызывает повышение уровня активности РНКазы в соке лис- 2Q тьев инфицированных растений томатов на 12% по сравнению с соком листьев некнокулированных контрольных растений (слабопатогенный штамм - на 3,0- 7j5%, сильнопатогенный - на 16,3%). 25

Активность РНКазы определяют в соке листьев растений картофеля, выращенных, из клубней от здоровых и инфицированных вирусом растений. Повышение уровня активности РНКазы в ке листьев картофеля, выращенного из пораженных М-вирусом клубней, наибо- лее выражено в фазе бутонизации - цветения растений.

Данные спектрофотометрии при , 260 нм: РНКазная активность в соке листьев здорового картофеля (контроль) 0,614 ед. акт., а в соке растений, пораженных штаммом М-35 М-вируса картофеля, 0,704 ед. акт., т.е. Q отмечается повыщение РНКазной активности на 15% по сравнению с безвирусным контролем.

В соке растений томата уровень активности РНКазы определяют в динами- 45 ке развития инфекции. Повышение РНКазной активности начинает проявляться в соке инокулированных М-вирусом растений томата через дн. после инозыма na ще ра nu и ма в ра ми

л к ля

в щи т к

М е п вы

ш

т за к

т ю ж з л н к

Пр т не

куляции, а наиболее выражено через

19-21 дн, после инокуляции.

Данные спектрофотометрии при длине волны 260 нм: активность РНКазы в , соке листьев- здорового растения томата (контроль) 0,678 ед.акт,, а в соке листьев пораженного штаммом М-35 растения томата 0,759 ед, акт.

не заражает дурман обык- новенньш (Datura stramonium L,), вы

Q

5

0

5

зывает локальную реакцию на листьях мари стенной (Chenopodium mura- le L.), гомфрены головчатой (Gomphre- na globosa L,), вар, пурпурно-цветущей; системно вызывает мозаику на растениях паслена полегающего (Sola- num demissum Lindl), морщинистость и бронзовость листьев чилийских томатов (Licopersicon chilense Dun.) в условиях климатической камеры (22°С, 15000 лк,). Растения томата различных сортов (Lycopersicon escu- lenthuin Mil,) являются бессимптомными носителями вируса,

Штамм М-35 М-вируса картофеля легко передается способом механической инокуляции на растения картофеля, томата и др,

Штамм в лаборатории поддерживают в растениях картофеля, которые выращивают в изолированных условиях, а также в пробирочной культуре растений картофеля сорта Приекульский ранний.

По сравнению с другими штаммами М-вируса картофеля штамм М-35 обладает более высокой иммуногенностью, полученная к этому штамму сыворотка высоко специфична и активна.

Пример 1, Использование штамма для накопления вируса.

Растения томатов в фазе 2-3 листьев заражают вирусом, используя для заражения сок листьев картофеля, ин- фицдрованного штаммом М-35 М-вируса картофеля.

Для приготовления инокулюма листьев пораженных растений их растирают в фарфоровой ступке с добавлением 0,1 М фосфатного или цитратного буферного раствора (рН 7,4) в пропорции 1:1-1:10. Полученную вируссодер- жащую суспензию наносят на листья заражаемых растений с помошью поролонового тампона.после предварительного опудривания их мелкозернистым карборундом.

Штамм М-35 отличается высокой эф- фективностью механической передачи: 83,0% - на растения картофеля сорта Приекульский ранний, 100% - на растения томата сорта Советский, Украинец, НевскийjRutgers, Petite.

В растениях томата штамм М-35 накапливается с высокой концентрацией (значение титра составляет 1:64 - 1:128) и достигает максимальной концентрации в листьях .среднего яруса через 19-25 дн, после заражения.

Концентрацию вируса в соке пораженных растений определяют путем постановки реакции капельной агглютинации с гомологичной антисывороткой. Показатель концентрации вируса в соке инфицированного растения (титр) - это предельное разведение сока, при котором наблюдают положительную реакцию.

Штамм М-35 не оказывает угнетающего действия на растения томата. Эт свойства штамма позволяют получить большое количество зеленой массы при высокой концентрации вируса.

Пример 2. Использование штама М-35 М-вируса картофеля в качестве антигена.

Листья -томатов, инфицированных штаммом М-35, собирают, охлаждают в холодильнике и измельчают на мясорубке, вирус экстрагируют в рабочем буферном растворе, обладающем стабилизирующими свойствами (0,05 М натри лимонно-кислый трехзамещенный, 0,007 трилон Б и 0,2% сульфита натрия). Инфекционный сок осветляют путем кратковременного (5-6 мин) эмульгировани с озслажденным хлороформом и низкоскоростного центрифугирования в течение 20 мин при 3500 об/мин. Дальнейшую очистку вируса проводят путем гель-фильтрации на хроматографически колонках, заполненных гелями на дек- страновой основе (молселекты Г-50 и ЛЭАЭ-50). Концентрируют вирус 3,1%-ным полиэтиленгликолем (ПЭГ 15000) в присутствии 0,25 М хлористого натрия. После вьщерживаиия ви- русного антигена в холодильнике в течение 1 ч проводят центрифугирование в течение 20 мин при 4000 об/мин Осадок ресуспендируют в 0,1 ч. исходного объема физиологическим раствором. На всех этапах очистки наличи вируса контролируют серологическим методом.

Антиген, полученный при очистке растительного материала, инфицированного штаммом М-35 М-вируса картофеля, отвечает основным требованиям.

Чистоту препарата определяют, используя серологический, электронно- микроскопический, спектрофотометри- ческий методы.

Полученный антиген в реакции капельной агглютинации реагирует только с гомологичной сывороткой и не реагирует с гетерологичными сыворотками.

1597389

10

5

20

5

0

5

0

5

0

5

в том числе, и с сывороткой к М-ви- русу картофеля,,

Электронная микроскопия нативных препаратов полученного антигена показала характерные для М-вируса картофеля частицы размером им и не показала посторонних примесей.

При спектрофотометрии очищенного препарата в интервале длин волн от 220 до 280 нм наблюдается характерная для вируса кривая с максимумом при 260 нм и минимумом при 240 нм. При этом соотношение показателей А260 НМ/А280 нм составляет 1,4-1,5, что также характеризует полученный препарат как чистый, не содержащий примесей растительного белка.

(

Концентрацию вируса в препарате

определяют спектрофотометрическим методом, получая 0,1-0,2 мг/мл.

При иммунизации кроликов в произ- , водственныхусловиях используют для инъекции полученный препарат вирусного антигена, разведенньш до концентрации 100-500 мкг/мл.

Пример 3. Использование антигена для получения диагностической сыворотки.

Иммунизацию проводят по схеме: две внутримьш ечньгх инъекции по 2,5 мл с интервалом 1 над. и четыре внутривенных инъекций с интервалом 1 дн по 1; 3; 3 и 3 мл антигена. Кровь отбирают на 7-й, 9-й и 11-й день после последнего введения антигена. При получении штаммоспецифических сывороток применяют одну инъекцию антигена внутривенно.

Получают сыворотку крови по известной методике.

После получения сыворотки определяют ее титр и специфичность отдельно по кроликам с гомологичными и гетерологичными (X, S, Y, F) вирусами картофеля, а также с растительным соком, полученным из здоровых растений картофеля и томатов.

Для определения антигенных сво йств сравнивают три штамма М-вируса картофеля: слабопатогенный М-139 (ВИЗР 17), сильнопатогенный М-200 (ВИЗР 14) и среднепатогенный М-35, получая к ним штаммоспецифические и моноштаммовые сыворотки (табл. 1).

Таким образом, использование штамма М-35 позволяет получить антисыворотку к М-вирусу картофеля, отличаю

щуюся более высоким титром и специфичностью, по сравнению с приготовленными к другим штаммам М-вируса картофеля.

Моноштаммовые сыворотки, полученные с использованием штаммов М-35 и М-200 высокоспецифичны; не реагируют с соком здоровых растений картофеля и томатов, а также с гетероло- гичными вирусами, в том числе и с S-вирусом картофеля, как нативные, т и в разведении 1:1,, 1:2 ив рабочем разведении. Сыворотка, полученная с использованием штамма М-139 не реагирует с соком здоровых растений картофеля и томатов, но реагирует в разведении 1:4 с S-вирусом картофеля.

Ти гр антисывороток определяют двумя методами.

Согласно первой методике готовят ряд разведений физиологическим раствором: 2, 4, 8, -16, ... 2Г где п может достичь значения до 10-15, на- ,пример 2 1024 или 2 32768. Раз веден-ия готовят следующим образом. Берут специальную пластину с лунками, в которые (за исключением первой) заливают один и тот же объем физиологического раствора (по 1 мл). В первую лунку помещают 2 мл натив- ной сыворотки. Из этой лунки берут 1 мл нативной сыворотки и переносят во вторую лунку (с физиологическим раствором)5 перемешивают, набирают опять 1 мл и переносят в третью лунку и т.д. Таким образом, разведение сыворотки во второй лунке составляет 1:2, в третьей 1:4 и т.д.

Для определения титра сыворотки ставят реакцию капельной агглютинаци на предметных стеклах, используя ви

руссодержащий сок растений и каждое из приготовленньгх разведений сыворот ки. Стекла вьщерживают во влажной камере, реакции читают с помощью бинокулярного микроскопа в темном поле при увеличении в 25 раз.

Согласно второй методике готовят ряд разведений сыворотки в пробирках

8первую пробирку помещают нативную сыворотку, а во вторую пробирку к

9мл физиологического раствора добавляют 1 мл нативной сыворотки, получая разведение 1:10. Перемешивают, набирают из этой пробирки 5 мл сыворотки и переносят в соседнюю про- бирку, содержащую 5 мл физиологического раствора, получая разведение 1:20, и т.д.

Значение титра сыворотки при разведении различными способами представлено в табл. 2.

Пример 4. Исследуют выявляе мость М-вируса картофеля, используя моноштаммозые сыворотки, полученные к различным штаммам М-вируса картофеля, и различные изодяты вируса

(табл. 3).

I.

Сыворотка, полученная к Штамму М-35, наиболее активно вступает в реакцию с распространенными в природных условиях изолятами М-вируса картфеля, таким образом, щтамм М-вируса картофеля М-35 является более специфичными и иммуногенным чем известные штаммы.

Формула изобретения

Штамм М-вируса картофеля ВИЗР № 1, для производства диагностической воротки.

Т а б л и ц а 1

1597389 10

Таблица 2

Изобретение относится к фитовирусологии, в частности к иммунодиагностике, и представляет собой штамм М-вируса картофеля для производства диагностической сыворотки к этому вирусу. Целью изобретения является получение нового штамма М-вируса картофеля, обладающего более высокой антигенной активностью, обеспечивающего получение диагностической сыворотки к М-вирусу картофеля, реагирующей с различными штаммами М-вируса картофеля и не дающей реакцией с М-вирусом картофеля. Штамм м-вируса картофеля выделен из растений картофеля. Ему присвоен номер М-35. Штамм М-вируса картофеля М-35 депонирован в коллекции ВИЗРа под номером 16. Титр диагностической сыворотки, полученной с использованием антигена, приготовленного на основе штамма М-вируса картофеля ВИЗР N16, составляет 1:2048-1:4096, а титр сыворотки, полученной с использованием антигена, приготовленного на основе известного штамма, составляет 1:2560. 3 табл.

Пробирка (лунка)

Нативная 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024 2048

1 1:4096

Реакция с антнсыворотками

-139 1 И-200

Контроль М-35 I м-1

24

125

122

139

35

200

117

287

1033

408i

686

Примечание. ||- | - отсутствие реакции; + - реакция сомнительна + - реакция слабая; ++ и ++. - реакция-четко

выражена.

Титр сыворотки по методу

ативная 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1 :1280 1:2560

Таблица 3

+ + + + + +

+ + + + (