Штамм F-вируса картофеля для получения антигена, используемого при производстве диагностической сыворотки Советский патент 1991 года по МПК C12N7/00 A01N63/00 G01N33/53 

1

(21)4696835/13

(22)18.04.89

(46) 07.04.91. Бюл. (Р 13

(71)Научно-исследовательский институт картофельного хозяйства9 Научно- производственное объединение по картофелеводству Госагропрома РСФСР и Украинский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии

(72)К.Ф.Герасимова, Т.В.Тенсина, Н.А.Погорилько и В.А.Шмыгля

(53) 576.8(088.8)

(56) Попкова К.В., Шнейдер Ю.И., Во- ловитс А.С., Шмыгля В.А. Болезни картофеля. - М.: Колос, 1980, 193-194.

(54) ШТАММ F-ВИРУСА КАРТОФЕЛЯ ДЛЯЛЮ - ЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА, ИСПОЛЬЗУЕМОГО ПРИ ПРОИЗВОДСТВЕ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ СЫВОРОТКИ

(57) Изобретение относится к фитови- русологии, в частности к иммунодиагностике, и касается нового штамма F-вируса картофеля. Целью изобретения является получение нового более активного штамма F-вируса картофеля. Штамм выделен из естественно зараженных растений картофеля. Ему присвоен № Fg. Он депонирован в коллекции ВИЗР под № 18, Титр штамма в рабочем разведении при капельной агглютинации составляет 1:32, а у известных - 1:8, 1:16. Выход чистого препарата вируса из растений дурмана составляет 24,4 мг на 1 кг листьев. 2 табл.

а S

V,

С

Изобретение относится к фнтовиру- сологии, в частности к иммунодиагностике и касается нового штамма F-вируса картофеля.

Целью изобретения является получение нового более активного F-вируса картофеля (аукуба-мозаики).

Штамм F-вируса (аукуба-мозаики) картофеля выделен из естественно зараженных растений картофеля сорта Эпикур. Ему присвоен номер F.

Штамм депонирован в коллекции штаммов вирусов растений Всесоюзного НИИ защиты растений под номером 18.

Штамм характеризуется следующими свойствами.

Морфологические и физические свойства. Штамм F -вируса аукуба-мозаики

картофеля имеет нитевидные частицы размером 580x11 нм. Точка температурной инактивации 59+1°С, точка предельного разведения сока Инфекционные свойства в соке растений махорки при 4°С сохраняются 24 дня, а при 18,5°С - 14 дней.

Коэффициент седиментации равен 180 S, мол.масса белка вируса 28500D.

Круг восприимчивых растений. Штамм Fg в растениях картофеля находится в основном в латентном состоянии. На листьях махорки - Nicotiana rustica и дурмана Datura stramonium, выросших сразу за инокулированными, вызывает симптомы в виде побелевших коО5Ј

О:

лец или полуколец, окружающих зеле- ную ткань, которые сохраняются 2-3 недели после появления. Эти два вида -растений используют в качестве растений-накопителей F-вируса. На растениях Nicotiana glutinosa он/вызывает желтую мозаику, а на растениях перца Capsicum annuum - светло-коричневые локальные некрозы с последующим опа- данйем листьев, некрозом верхушки и стебля. Этот вид растения используют в качестве растения-индикатора. На растениях гомфрены - Gomphrena glo- bosa и гибрида А-6 (Solatium demis- sum x Solatium tuberosum сорт Аквила) он вызывает некрозы в виде небольших темных пятен.

Культивирование. Штамм F легко передается механическим путем с по- мощью корборунда на растения махорки Nicotiana rustica и дурмана Datura stramonium, которые используют для накопления вирусного антигена.

Характеристика антигена. Штамм F6 в растениях махорки Nicotiana rustic накапливается в высокой концентрации титр сока с одной и той же сыворотко

3рабочем разведении при капельной агглютинации равен 1:32, что в 2-

4раза выше по сравнению с известными штаммами, титр сока у которых равен (t:8) - (1:16).

Штамм Fg характеризуется высоким выходом чистого препарата вируса из растений дурмана, который составил 24,4 мг на 1 кг листьевtf что в 3- 6 раз больше по сравнению с другими штаммами (табл. 1),

Штамм Fg обладает высокой антигенной активностью. Титры приготов ленных для производственных целей пяти сывороток к этому штамму равны (1:2046) - (1:8192), что в 4-8 раз выше титров сывороток, приготовленных к производственному штамму.

Условия хранения штамма. Штамм V6 в лаборатории поддерживают в растениях картофеля, которые выращивают в изолированных условиях. В летний период клубни картофеля со штаммом Fg высаживают на опытном участке под изоляторами или в пленочно-марлевом домике. В зимнее время клубни хранят в хранилище. Штамм Fg сохраняет антигенную активность в очищенных и за тем лиофилизировэнных препаратах (очищенных вирусных антигенах) в течение года. Штамм Fg поддерживают в

,-

5

n

5

„

5

0

5

0

пробирочной культуре Nicotiana glutinosa. Пробирочные растения периодически (через 2 мес) черенкуют и пересаживают на свежую питательную среду.

Сравнительное изучение штамма. Сравнительное изучение патогенности и антигенной активности штамма Fg проводили вг НПО по картофелеводству Госагропрома Нечерноземной зоны РСФСР и Украинском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной микробиологии в 1980-1986 годах.

Патогенность штамма F по сравнению с другими штаммами F-вируса изучали на растениях картофеля Solanum tuberosum и перца Capsicum annum

На основании полученных данных изучаемые штаммы были разделены на сильнот, средне- и слабопатогенные. F6 отнесен к группе слабопатогенных штаммов. На растениях картофеля на второй год после заражения он вызывал лишь желтую пятнистость листьев, тогда как сильно- и ереднепатогенные штаммы вызывали разной степени отст а- вание в росте, желтую пятнистость и пожелтение листьев,

На растениях перца к группе сильнопатогенных отнесено пять штаммов, которые на 10-й день после заражения вызывали некроз стеблей, а на 15-й день - гибель растений, К группе ереднепатогенных отнесено три штамма, которые на 15-й день после заражения вызывали опадение листьев и некроз стебля. Гибель растений перца при этом наступала на 18-20-й день после инокуляции. И только штамм F на растениях перца оказался слабопатогенным. На 15-й день после заражения он вызывал лишь опадение листьев, гибель растений н-з наступала.

П р и м е р 1. Применение штамма Fg для получения сыворотки.

Для накопления вируса с целью приготовления вирусного антигена используют растения дурмана, которые заражают инфекционным соком, содержащим штамм Fg, полученным из растений картофеля .

Заражение проводят механическим способом с помощью карборунда путем натирания листьев кусочком паралона, смоченным инфекционным соком.

Зараженные растения выращивают в изолированных условиях в секционной теплице. За ними проводят уход, который заключается в поливе водопро

51

водной водой, рыхлении почвы в вазонах и еженедельной подкормке растений смесью Мореля.

Максимальное накопление вируса происходит через 3-4 недели после за ражения. Перед срезанием листьев все растения проверяют серологическим методом на наличие F-вируса и отсутствие других вирусов. Собранные листья охлаждают в уолодильнике и измельчают на мясорубке. Вирус экстрагируют 0,05 М натрий-фосфатным буфером рН 7,5 (0,5 М хлористого натрия и 0,1% меркаптоэтанола). Полученную массу отжимают через двойной слой марли, сок дополнительно охлаждают в морозилке в течение 30 мин, затем добавляют к нему 8% бутанола и 1/8 часть хлороформа. Смесь встряхивают на аппарате для встряхивания жидкостей в сосудах 15 мин, затем центрифугируют 15 мин при 6000 об/ми на рефрежераторной центрифуге. К на- досадочной жидкости добавляют 4% ПЭГ с мол. массой 15000 и 1,5% хлористого натрия. Смесь ставят в холодильник на 1,5-2,0 ч. Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием при 6500 об/мин в течение 15 мин. Полученный осадок рзсуспензируют 2-3 раза 0,02 М боратным буфером (рН 7,8- 8,0). Дальнейшую очистку проводят одним циклом дифференциального центрифугирования на центрифуге VAK-601: низкоскоростное 15 мик при 10000 об/мин, высокоскоростное 1,5 ч при 26000 об/мин.

Осадок после экстракции и низкочастотного центрифугирования суспендируют в физиологическом растворе и используют для иммунизации.

Диагностические сыворотки получены к очищенным таким образом антигенам четырех изолятов. Схема иммунизации: одна внутримышечная инъекция с сапонином и через неделю пять внутривенных без сапонина с интервалом в два дня. Кровь брали через 8 дней после последней инъекции.

Все полученные моноштаммовые сыворотки обладают высокой специфичностью. При разведении 1:2 они не .реагируют с соком здоровых растений картофеля и дурмана, а также с ге- терологичными вирусами картофеля и имеют следующие гомологичные титры с сроком растений Nicotiana glutinosa,

606

зараженных изучаемыми штаммами F вируса.

В табл. 2 - приведена характеристика сывороток к изучаемым штаммам аукуба-мозаики картофеля,

Т а б л и ц а 1

10

25

25

15 F. (гибрид

25

20

Таблица2

25

30

Сыворотка к штамму отличалась от сывороток к другим штаммам более высоким титром. Все сыворотки давали перекрестные реакции со всеми имеющимися девятью штаммами вируса ауку- ба-мозаики.

П р и м е р 2. Получение сывороток к высокоочищенным препаратам вируса аукуба-мозаики.

Листья с зараженных растений N.rustica через 25 дней после заражения срезают и измельчают через мясорубку с добавлением 1:1 0,1М глицинового буфера (рН 7,8-8,0), содержащего 0,2% сульфита натрия, и 0,005М трилона Б. Массу отжимают, полученный сок центрифугируют 20 мин при 12000 об/мин. В надосадочную жидкость добавляют тритон Х-100 до конечной концентрации 0,5% и оставляют на холоде 30 мин. Сок центрифугируют 20 мин при 12000 об/мин. Для концентрации вируса в надосадочную жидкость добавляют 5% ПЭГ-12000 и 2%

164С1

хлористого натрия. Смесь выдерживают в холодильнике 1,5-2,0 ч. Образовавшийся осадок отделяют цектрифугиро- .ванием при 12000 об/мин в течение 20 мин. Осадок 2-3 раза экстрагируют 0,Ш глициновым буфером (рН/ 7,8-8,0) После суспендирования все экстракты объединяют, центрифугируют 15 мин при 5000-6000 об/мин, надосадочную жидкость наносят на 30%-ную сахарозную подушку и центрифугируют 90 мин при 25000 об/мин. Осадок суспендируют 0,1М глициновым буфером (рН 7,8-8,0) и используют для иммунизации.

Схема иммунизации: две внутримышечные инъекции с интервалом в 10 дней в четыре точки по 1 мг препарата и по 0,5 мл неполного адьюванта Фройнда на 1 кролика. Через 3 недели отдыха проводят четыре внутривенных инъекции с интервалами в два дня: две по 0,5 мг препарата на 1 кролика и две по 1,0 мг. Расход препарата на 1 кролика за весь цикл иммунизации 5,0 мг. Продолжительность иммунизации 38 дней. Кровь берут через 8 дней после последнего введения антигена. Проиммунизировано по пять кроликов штаммами F (с сорта Эпикур) и F (с ссрта Омега). Сыворотка к штамму F6 имела гомологичный титр с соком растения махорки 1:2048, а к штамму F4 - 102 4.0 бе сыворотки были специфичными и разведении 1:2 не давали положительных реакций со здоровыми растениями картофеля и махорки, а т,акже с растениями картофеля, зараженными другими мозаичными вирусами.

П р и м е р 3. Накопления вируса и приготовления вирусного антигена используют растения махорки Nicotian rustica, которые заражают штаммом F по примеру 1. Выращивание растений махорки осуществляют аналогично примеру 1.

При максимальном накоплении вирус листья махорки собирают, охлаждают в холодильнике и измельчают путем пропускания через мясорубку. Вирус экстрагируют в рабочем буфере, обладающим стабилизирующими свойствами (б,05М лимонно-кислый трехзамещенньй натрий, 0,007М тринол Б и 0, сульфит натрия). Инфекционный сок осветляют путем кратковременного (5-6 мин) эмульгирования с охлажденным хлороформом и низкоскоростного центрифугирования в течение 20 мин

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

608

при 3500 об/мин. Дальнейшую очистку проводят путем гельфильтрации на хроматографических колонках, заполненных гелями на декстриновой основе (молселекты Р-50 и ДЭАЭ-50). Концентрируют вирус 3,5%-ным полиэтилен- гликолем (ПЭГ-15000) в присутствии 0,25М хлористого натрия. После одночасового выдерживания вирусного антигена в холодильнике проводят центрифугирование в течение 20 мин при 4000 об/мин. Осадок ресуспенди- руют в 0,1 исходного объема физиологическим раствором. На всех этапах очистки наличие вируса контролируют иммунологическим методом. Идентификацию вируса в материале, используемом для заражения растений-накопителей, проводят с помощью электронного микроскопа и растений-индикаторов.

Для иммунизации кроликов используют антиген с одинаковой концентрацией вируса различных штаммов. Кроликов иммунизируют только свежеприготовленным антигеном путем двукратного внутримышечного введения по 2,5мл с недельным интервалом и 4-кратного внутривенного введения по 1,2,3 и 4 мл с однодневным интервалом. Кровь отбирают на 7,9 и 11-й день после последнего введения антигена. Получают сыворотку по известным методикам.

После получения сыворотки определяют ее титр и специфичность отдельно по кроликам с гомологичным и ге- терологичным (Х,8,М,У) вирусами картофеля, а также с растительным соком, полученным из здоровых растений картофеля и махорки.

После определения титра делают рабочее разведение сывороток--с учетом титра каждой сыворотки. Приготовленные таким образом сыворотки используют для выявления F-вируса картофеля на различных растениях.

Все полученные нативные сыворотки к различным штаммам обладают высокой специфичностью. При разведении 1:4 они не реагируют с соком .здоровых растений махорки и картофеля, а также гетерологичными вирусами картофеля и имеют следующие титры: к штамму Fg 1:8192, а к известному производственному штамму 1:1024.

В производственных условиях получено пять серий строго специфических высококачественных сывороток к штамму

Fg. Титр их равнялся (1:2048)- (1:8192), что в 4-8 раз выше титра сыворотки к производственному штамму

Сыворотка к штамму Fg готовится НПО по картофелеводству и рассылается ежегодно в 40-50 учреждений страны по их заявкам для практического применения ее в семеноводстве картофеля

В результате испытания было установлено ,

что штамм Fg при заражении

растений-накопителей (махорка Nico- tiana rustica) вызывает симптомы в виде колец или полуколец, окружающих зеленую ткань. Эти симптомы наблюдали на протяжении восьми лет, что указывает на генетическую стабильность штамма.

Таким образом, штамм F6 хорошо накапливается в растениях махорки

и дурманаs отличается высокой жизнеспособностью, имеет наибольший выход чистого препарата вируса и характеризуется высокой антигенной активностью. Титры сывороток, полученных к штамму F6 , выше в 2-4 раза по сравнению с титрами сывороток к известным штаммам. Это позволяет без дополнительных затрат на производство увеличить выход сывороток в рабочем разведении в 1 ,5-2 раза.

Ф о р to у, л а изобретения

Штамм F-вируса картофеля ВИЗР № 18 для получения антигена, используемого при производстве диагностической сыворотки.