Питательная среда для культивирования личинок ТRIснINеLLа SpIRaLIS Советский патент 1991 года по МПК C12N1/00 A01K67/33 

(/

С

Изобретение относится к гельминтологии, а именно к питательным средам для культивирования личинок ;ельминтов. Цель изобретения - повышение сроков сохранения жизнеспособности личинок. Поставленная цель достигается гем, что в состав среды входят тиамин бромид, раствор полиглюкина, твин-20, твин-80, человеческий сухой альбумин, раствор Хенкса без фенола. Простота изготовления и доступность ингредиентов среды, наряду с ее высокой биологической полноценностью, позволяют применить ее в широкой гельминтологической практике. 1 табл.

Изобретение относится к гельминтологии, а именно к питательным средам для культивирования личинок гельминтов.

Цель изобретения - повышение сроков сохранения жизнеспособности личинок.

Пример1.В асептических условиях к 500 мл стерильного стандартизированного раствора Хенкса нейтрального(без фенола) прибавляют 0,02 1,0% ампулированного 6%-ного раствора бромида тиамина. К полученной смеси добавляют 0.2 5,0% стандартного стерильного раствора полиглюкина, смешивают и в полученной смеси растворяют 100,0-5000,0 мг сухого человеческого альбумина. Затем к раствору прибавляют (0,01- 0,1)% твина-20 и твина ЯО доводят до объема 1 л раствором Хента IK игрального (без фенола).

Полученную рчбоч ю чн т, с. ерилизи- руют с помощью yi га-Mfn-ii .мчи i рилизующей фильтрации типа Миллипор с диаметром фильтрующей поверхности 142 мм. Фильтрацию под вакуумом в 0,5 атм производят в течение 30 мин через микропористые капроновые стерилизующие мембраны с размером пор 0.2 мкм (рН среды 7,8-8,0). Срок хранения питательной среды при 5°С 4-5 мес.

Моделью для культивирования гельминта служат личинки Trichinella splralis, выделенные от инвазированных белых мышей путем переваривания мышечной ткани в искусственном желудочном соке следующего состава: медицинский пепсин 30 г; концентрированная соляная кислота 10 мл; физиологический раствор до 1 л. Выделенные личинки трихинепл после отмывания в стерильных растворах питательной среды в асептических условиях помещают в рабочую питательную среду и инкубируют в

о

00 Ю СО 0

чэ

асептических условиях при 37°С в течение 25-27 дней. Биологическая полноценность питательной среды для культивирования личинок трихинелл определяется по сохранению жизнеспособности и инвазионных свойств личинок. Оценка жизнеспособности личинок трихинелл производится с помощью микроскопического исследования характера поведенческих реакций, двигателей активности, размеров тела и его формы. Оценка инвазионной способности у инкубированных личинок трихинелл производится с помощью биопробы на белых беспородных мышах обоего пола весом 18-20 г при дозе заражения 80 личинок трихинелл на 1 особь. Приживаемость трихинелл определяют через 2, 3, 5, 7, 10, 12, 15 и 20 дней инкубации. Вскрытие животных производят на 3-й день после заражения.

П р и м е р 2. Питательная среда с минимальным значением концентрации входящих ингредиентов, количество ингредиентов в % кг объему: Раствор бромида тиамина (6%-ный)0,02

Раствор полиглюкина 0,2 Твин-200,01

Твин-200,01

Человеческий сухой альбумин (мг)0,01 (мас.%)

Раствор Хенкса нейтральный (без фенола)До 100 (до 1 л)

Приготовление питательной среды для культивирования личинок трихинелл осуществляют аналогично примеру 1.

Результаты оценки биологической полноценности среды при культивировании личинок трихинелл представлены в таблице.

Длительность сохранения жизнеспособности личинок трихинелл в питательной среде с минимальным значением концентрации входящих ингредиентов составляет 15,0-1,Зсут.

У большинства личинок трихинелл на 2-3-е сутки их культивирования отмечалось увеличение размеров тела. В течении 8 сут у личинок трихинелл наблюдается выраженная двигательная реакция (свободное плавание в среде, хаотическое движение тела). У части личинок отмечается снижение двигательной активности и сворачивание тела в плотное кольцо. На 9-10-е сутки появляются личинки с серповидной формой тела, характерной для погибших личинок. Полное исчезновение подвижности личинки и их 100%-ная гибель проявляется на 15-18-е сутки инкубации.

При исследовании целостности кутикулы личинок трихинелл в поле зрения микроскопа при увеличении (90x7) нарушений ее целостности не обнаруживается.

Приживаемость личинок трихинелл у белых мышей на 2-3-й день инкубации со- ставляет 26,4-1,3% против (34,7+0,9 ) % в контроле (р 0,05). На 5-й день инкубации приживаемость инкубированных личинок трихинелл составляет (18,0±1,1 ) %, на 7-й день - (10,8+4,7 ) % при р 0,05. П р и м е р 3. Используют питательную среду с оптимальным значением концентрации входящих ингредиентов следующего состава, количество ингредиентов в % к объему:Раствор бромида

тиамина (6%-ный)0,1

Раствор полиглюкина 1,0 Твин-200,05

Твин-800,05

Человеческий сухой

альбумин (мг)0,05 (мас.%)

Раствор Хенкса нейтральный (без фенола) До 100 (до 1л) Приготовление питательной среды и ее применение аналогичны примеру 1.

Результаты оценки биологической полноценности среды представлены в таблице.

Сохранение жизнеспособности личи- нок трихинелл при их культивировании в среде с оптимальным значением концентрации ингредиентов составляет 21,4+2,6 дня.

В течение первых 2-4-х суток у них отмечается увеличение размеров до 1,4 мм у самцов и до 1,56 мм у самок. Высокая двигательная активность (свободное плавное в среде, хаотическое движение, у отдельных особей наблюдается явление капуляции. Подвижность личинок сохраняется в тече- ние 16-18 дней инкубации. Погибшие личинки (серповидная форма тела) появляются на 18-20-й день и составляет 21-30%. Соответственно 100-ная гибель отмечается лишь на 25-26-й день инкубации. Нарушений целостности кутикулы у погибших ЛТ не обнаруживается.

Приживаемость личинок у белых мышей

на 3-й день инкубации составляет 28,8%

против 34,7% в контроле, на 5-10-й день

21,2-18,3%, на 15-й день 16,1%, на 20-й день

10,5%.

П р и м е р 4, Используют питательную среду с максимальным значением концентрации входящих ингредиентов следующего состава, концентрация ингредиентов в % к объему:

Раствор бромида

тиамина (6%-й)1,0

Раствор полиглюкина5,0

Твин-200,1

Твин-800,1

Человеческий сухой

альбумин (мг)0,5(мас.%)

Раствор Хенкса нейтральный (без фенола)До 100 (до 1л)

Приготовление питательной среды и ее применение осуществляются, аналогично примеру 1.

Жизнеспособность личинок трихинелл в среде с максимальным значением концен- трации ингредиентов сохраняется в течение 11,7+0,7 дней инкубации.

В первые сутки культивирования личинок отмечается более выраженная подвижность, чем при культивировании в среде с минимальной и оптимальной концентрацией ингредиентов, сохраняющаяся в течение 4-5 сут (при р 0,05). У части личинок на 8-9-е сутки наблюдается снижение подвижности, сворачивание тела в кольцо. У 22% появляется серповидная форма тела. 100%- ная гибель личинок отмечается на 11-12-й день наблюдения.

Приживаемость личинок трихинелл у белых мышей на 3-й день инкубации со- ставляет 18,1 %, на 5-й день 12,3%.

Таким образом, питательная среда для культивирования личинок Trlchinella spiralls при оптимальной концентрации входящих ингредиентов обладает высокой биологиче-

Среда

Питательная среда с минимальным значением концентрации входящих ингредиентов

Питательная среда с оптимальным значением концентрации входящих ингредиентов

Питательная среда с максимальным значением концентрации входящих ингредиентов

Среда НС-115

ской полноценностью, обеспечивая более длительное сохранение жизнедеятельности личинок, чем при применении среды НО 175 (на 57,1%). Снижение или повышение концентрации входящих ингредиентов снижает сроки сохранения жизнедеятельности.

Формула изобретения

Питательная среда для культивирования ли - чинок Trichlnella spiralls, содержащая источ- ник белков, углеводов, витамины и минеральные соли, отличающаяся тем, что, с целью повышения сроков сохранения жизнеспособности личинок, она дополнительно содержит твин-20 и твин-80, в качестве источника белка - человеческий альбумин, в качестве источника углеводов- полиглюкин, в качестве минеральных солей - раствор Хенкса, в качестве витаминов - 6%-й раствор тиамина бромида при следующем соотношении компонентов, об.%: 6%-й раствор тиамина бромида0.02-1,0

Полиглюкин0,2-5,0

Твин-200,01-0.1

Твин-800,01-0,1

Альбумин человеческий 0,01-0,5 Раствор Хенкса ,До 100

Сроки сохранения жизнеспо- собности. (дни)

11,7±07 12.С