СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКОГО АНТИГЕНА ПРИ ТРИХИНЕЛЛЕЗЕ Российский патент 2008 года по МПК A61K35/56 

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к иммунологической диагностике трихинеллеза. Может быть использовано для той же цели в медицине при трихинеллезе человека.

Цель изобретения сводится к использованию биотехнологического метода получения антигенов трихинелл.

Известны способы получения антигенов трихинелл с использованием традиционных физико-химических методов, включающих выделение гельминтного материала от лабораторных белых крыс - инвазионных личинок трихинелл, их механическое измельчение, экстрагирование белка - антигена в буферном растворе из гельминтного материала и очистка полученного экстракта от неспецифических белковых примесей, снижающих эффективность диагностических антигенов. Очистка проводится с использованием гель-фильтрации на сефадексе G-200, в результате которой происходит разделение смеси экстракта на белковые фракции, из которых в диагностике используется обычно фракция, обладающая достаточной чувствительностью и специфичностью /9/. Можно проводить фракционирование с использованием других гелей. Например, Тойоперл HW-50, который также позволяет в достаточной степени очищать экстракт от неспецифических белковых примесей /7/.

К недостаткам этих способов относится то, что они трудоемки и продолжительны по времени, особенно подготовительные работы, для выполнения необходим квалифицированный и опытный персонал.

Наиболее близким к заявляемому техническим решением является получение экскреторно-секреторного антигена трихинелл, представляющего 24-часовые продукты метаболизма гельминтов, помещенных в искусственную питательную среду /8/; а также 48-60-часовые продукты метаболизма трихинелл, получаемые на голодных средах /3/.

Недостатком этих способов является небольшой выход активных белков (до 150 мкг/мл), из-за небольшой плотности посева для обеспечения лучшей выживаемости гельминтов при продолжительном по времени культивировании. Кроме того, небольшой выход активных белков может обуславливаться приемами подготовки гельминтов к культивированию и составом среды. Выделение жизнеспособных личинок трихинелл с использованием дополнительного процесса центрифугирования в градиенте плотности глицерина, на наш взгляд, является стрессовым фактором и может снижать жизнедеятельность личинок при последующем культивировании особенно в голодных средах, использованных упомянутыми авторами.

Предлагаемый способ получения антигенов трихинелл основан на использовании культуральных питательных сред, обеспечивающих лучшие условия выживания личинок трихинелл в процессе культивирования. Антиген представляет собой диагностически активные экскреторно-секреторные продукты трихинелл, выделяемые ими в культуральных питательных средах. От наиболее близких по техническому решению он отличается тем, что мы использовали несколько приемов, которые в совокупности позволили улучшить жизнеспособность и условия жизнедеятельности личинок трихинелл, увеличить плотность посева личинок и в конечном итоге выход белка-антигена. Использованные приемы включали: а) переваривание (пептолиз) фарша из тушек крыс в искусственном желудочном соке с уменьшенной по времени экспозицией с целью выделения личинок, что обеспечивает лучшую жизнеспособность их; б) смену среды при 48-часовом культивировании 1 раз в сутки на эквивалентную порцию свежей полноценной среды; в) культивирование в стерильных условиях в СО₂-инкубаторе, поддерживающем постоянный газовый состав среды. Использование обычного термостата, хотя и дешевле, но, по нашим наблюдениям, негативно отражается на диагностической эффективности, снижая, прежде всего, показатель специфичности; г) использование обогащенной среды ДМЕМ. Это позволило обеспечить более стабильные и благоприятные условия для поддержания процессов жизнедеятельности личинок в ходе культивирования, что выразилось в меньшем проценте отмирания их и меньшем загрязнении антигена продуктами распада и, в то же время, позволило увеличить плотность посева в несколько раз, а также конечный выход диагностически ценных белков в 4 раза. Вследствие этого мы получили антиген с достаточно высокой диагностической эффективностью - специфичность антигена возросла на 2-7% по сравнению с другими антигенами трихинелл при прежнем уровне чувствительности.

Способ включает следующие этапы:

1) приготовление гельминтного материала для культивирования;

2) культивирование инвазионных личинок трихинелл и сбор экскреторно-секреторных продуктов;

3) проверка диагностической эффективности экскреторно-секреторных продуктов трихинелл.

Предварительную подготовку необходимой стеклянной и пластиковой посуды, инструментов, растворов и их стерилизацию проводили согласно методик, применяющихся в вирусологии при работе с культурами клеток и тканей животных /5, 6, 4, 2/. Непосредственно для культивирования клеток использовали готовые стерильные растворы и питательные среды (раствор Хенкса, физиологический раствор, среда ДМЕМ) производства ин-та полимиелита и одноразовую пластиковую посуду (чашки Петри).

1. Приготовление гельминтного материала.

Гельминтный материал получали от беспородных белых крыс, экспериментально зараженных лабораторным штаммом T.spiralis, который поддерживается пассированием на лабораторных животных в виварии ВИГИС.Из тушек крыс готовили фарш, который переваривали в искусственном желудочном соке (пептолиз) по ускоренной методике в аппарате АВТ (аппарат для групповой экспертизы свинины на трихинеллез) в течение 30 минут при непрерывном помешивании /1/. Использовали личинки 45-50 дневного возраста. Выделенных личинок тщательно отмывали физиологическим раствором, затем 2 раза стерильным физиологическим раствором и переносили в стерильный стакан. Дальнейшую отмывку проводили в стерильных условиях в боксе. Отмывали 4 раза раствором Хенкса с добавлением 1000Ед/мл пенициллина и 1 мг/мл стрептомицина и 1 раз физиологическим раствором. Экспозиция отстаивания после каждой отмывки составляла 15-20 минут, что позволяло избавиться от нежизнеспособных особей. Отмытых личинок помещали в чашки Петри.

2. Культивирование инвазионных личинок трихинелл и сбор экскреторно-секреторных продуктов.

Культивирование инвазионных личинок T.spiralis проводили в среде ДМЕМ (среда Игла, модифицированная Дульбеко) с добавлением 20 мкл/мл 1,5% раствора L-глутамина и 2 мкл/мл 4% раствора гентамицина при постоянном газовом составе, температуре и влажности. Плотность посева 35-40 тыс.личинок/мл среды. Использовали для культивирования СО₂-инкубатор фирмы «Heauser» с 5%-ным содержанием углекислоты, 70%-ной влажностью и температурой 37°С. Через 24 часа культивирования (первые сутки) отбирали первую порцию экскреторно-секреторных продуктов. Этих же личинок однократно отмывали стерильным физиологическим раствором и добавляли свежую порцию среды ДМЕМ в соответствующем объеме. Культивирование проводили при тех же условиях и вторую порцию экскреторно-секреторных продуктов отбирали через 24 часа (вторые сутки). Общее количество полученного белка-антигена составляло 550-650 мкг/мл; молекулярная масса основных белковых компонентов: 44 кД, 55 кД, 10 кД, 87,1 кД.

3. Проверка диагностической активности экскреторно-секреторных продуктов трихинелл.

Порции экскреторно-секреторных продуктов трихинелл, полученные в ходе культивирования инвазионных личинок проверяли на диагностическую эффективность. Для этого использовали референс-сыворотки и метод иммуноферментного анализа. При удовлетворительных результатах анализа порции объединяли, определяли содержание белка и использовали в качестве антигена. Антиген хранили при минус 20°С.

Примеры конкретного исполнения.

Пример 1. Диагностическую эффективность полученного экскреторно-секретоного антигена личинокк трихинелл оценили с 354 сыворотками свиней, в том числе зараженных T.spiralis - 12 проб; E.granulosus - 13; C.tenuicollis - 5; O.dentatum - 2 пробы и клинически здоровых - 322. Результаты исследования представлены в таблице 1.

Пример 2. Диагностическую эффективность эксреторно-секреторного антигена личинок трихинелл оценили с 45 сыворотками людей, в том числе 6 - от больных с диагнозом трихинеллез, 5 - токсокароз, 1 - цистицеркоз, 11 - эхинококкоз цистный, 1 - эхинококкоз альвеолярный, 21 - от доноров. Результаты исследований представлены в таблице 2.

Анализ данных по оценке диагностической эффективности экскреторно-секреторного антигена личинок трихинелл в иммуноферментной реакции свидетельствует о достаточно высокой чувствительности и специфичности исследуемого антигена, что дает основание применять его в качестве диагностикума при трихинеллезе животных и человека.

Источники информации

1. Бессонов А.С., Успенский А.В., Шеховцов Н.В. Аппараты для групповой экспертизы свинины на трихинеллез.- Ветеринария.- 1985.- №10.- С.71-73.

2. Биология клетки в культуре. Под редакцией А.С.Трошина, Ленинград.- Изд-во «Наука». - 1984. - 274 с.

3. Васерин Ю.И., Костецкий А.Ф. Способ получения культурального антигена из Trichinella spiralis. //A.c. 1493260 СССР.

4. Дьяконов Л.П., Глухов В.Ф., Поздняков А.А. и др. Культура клеток и тканей животных. // Учебно-методическое пособие. Ставрополь. - 1980. - 9 с.

5. Методы культивирования клеток. (Сборник научных трудов под редакцией Г.П.Пинаева), Ленинград.- Изд-во «Наука». - 1988. - 320 с.

6. Спиер Р.Е., Адаме Г.Д., Гриффитс Дж.Б. Биотехнология клеток животных. Т2. (перевод с англ. В.М.Тарасенко, под редакцией Г.А.Сафонова). - 1989. - 520 с.

7. Шеховцов Н.В. Испытания диагностической эффективности при трихинеллезе в ИФА. Восьмая всероссийская конференция по трихинеллезу. Москва, 30-31 мая 2000 г. // Статьи и тезисы докладов. - 2000. - С.156-157.

8. Gamble H.R., Rapič. D., Marinculic. A., Murrell K.D. Evaluation on excretory-secretory antigens for the serodiagnosis of swine trichinellosis. // Vet. Parasitol. - 1988. - V.30(2). - P.131-137.

9. Magat W.J., A serodiagnostic antigen for trichinellosis. // Acta parasitol polon. - 1976. - V.24(11-19). - P.191-198.

Таблица 1Диагностическая эффективность иммуноферментной реакции с экскреторно- секреторным антигеном при трихинеллезе свиней.Гельминтологический статус животногоКоличество животныхРезультаты ИФРПоложительныйОтрицательныйЛожно-положительныйЧувствительность %Специфичность %Т.spiralis экспериментально*66--  Т.spiralis естественно66 -  Е.granulosus экспериментально7-61  Е.granulosus естественно6-42  С.tenuicollis естественно5-50  О.dentatum естественно2-20  Клинически здоровые свиньи**322-3166  Итого354123339100,097,46* Сыворотки крови получили через 30 дней и более после заражения** По данным ветсанэкспертизы без тканевых гельминтов

Таблица 2Диагностическая эффективность иммуноферментной реакции с экскреторно-секреторным антигеном при трихинеллезе людей.Группы людейКоличество сыворотокРезультаты ИФРПоложительныйОтрицательныйЛожно положительныйЧувствительность %Специфичность %Трихинеллез660-100,097,78Токсокароз (L.migrans)5-50Эхинококкоз цистный11-101Эхинококоз альвеолярный1-10Цистицеркоз1-10Доноры21-210Итого456381

Изобретение относится к области ветеринарии. Способ включает выделение личинок трихинелл, их отмывку и культивирование в питательной среде. При этом выделение инвазионных личинок 45-50-дневного возраста проводят ускоренным методом в течение 30 минут с последующей 5-кратной отмывкой с экспозицией 15-20 минут. Культивирование личинок осуществляют в питательной среде ДМЕМ с добавлением 20 мкл/мл 1,5% раствора L-глутамина и 2 мкл/мл 4% раствора гентамицина с уплотненным посевом 35-40 тыс.личинок/мл в стерильных условиях при постоянном газовом составе с содержанием СО₂ - 5%, влажности 70% и температуре 37°С в течение двух суток со сменой среды один раз в сутки. Способ позволяет получать антиген с высокой чувствительностью и специфичностью. 2 табл.

Способ получения диагностического антигена при трихинеллезе, включающий выделение личинок трихинелл, их отмывку и культивирование в питательной среде, отличающийся тем, что выделение инвазионных личинок 45-50-дневного возраста проводят ускоренным методом в течение 30 мин с последующей 5-кратной отмывкой с экспозицией 15-20 мин, культивирование личинок осуществляют в питательной среде ДМЕМ с добавлением 20 мкл/мл 1,5%-ного раствора L-глутамина и 2 мкл/мл 4%-ного раствора гентамицина с уплотненным посевом 35-40 тыс.личинок/мл в стерильных условиях при постоянном газовом составе с содержанием СО₂ 5%, влажности 70% и температуре 37°С в течение двух сут со сменой среды один раз в сут.