Способ определения холинсодержащих фосфолипидов в биологическом материале Советский патент 1991 года по МПК G01N33/50 

Изобретение относится к практической биохимии и может быть использовано в клинической медицине, в микробиологической, пищевой и парфюмерной промышленности, в фармакологии и в животноводстве, в области биотехнологии и в других областях.

Цель изобретения - увеличение чувствительности и селективности, а также упрощение способа.

Способ поясняется чертежом, где представлены калибровочные кривые для холинсодержащих фосфолипидов (ФХ, лизоФХ, СМ).

Способ осуществляется следующим образом.

Для определения используют холинсо- держащие фосфолипиды (фосфатидилхолин, лизо-фосфатидилхолин или сфингомиелин), растворенные в хлороформ-метальной смеси или в этаноле. К пробам добавляют 3 мл хлороформа и краситель катион-анионной формы триарилметанового ряда (например,

кислотный синий 9, кислотный синий 7, кислотный синий 1, кислотный фиолетовый 17 и т.д). Краситель может быть добавлен в виде водного раствора, а также растворенным в смесях вода - глицерин (в различных соотношениях), глицерин - метанол (в различных соотношениях, но не более 80% метанола), вода - ацетон (в различных соотношениях, но не более 20% ацетона), а также в виде сухого вещества Количество холинсодержащих фосфолипидов прямо- пропорционально интенсивности окраски хлороформенной фазы. Оптическую плотность измеряют на спектрофотометре при длине волны, соответствующей максимуму поглощения для используемого красителя Прямая пропорциональность наблюдается в интервале 5-80 мкг холинсодержащих фосфолипидов, т.е. от 0 до 2.5 ед (А) (см чертеж калибровочные кривые для ФХ ли- зо-ФХ, СМ) для различных катион-анионных триарилметановых красителей

со

с

о ю

ч

&U

Јь

В случае небольшой мутности образцов, которая, как правило, не мешает определению, можно к окрашенному хлоро- форменному экстракту перед измерением добавить порошок - безводного сульфата натрия (около 100 мг/образец), который быстро убирает остаточную мутность и не мешает определению. Другим способом устранения слабой мутности образцов является предварительное кратковременное, низкоскоростное центрифугирование (1-2 мин при 2 - 2,5 тыс.об.) образцов для расслоения хлороформенной и водной фаз. Образовавшаяся окраска стабильна длительное время (несколько месяцев), если только не происходит химическая или ферментативная де- градация фосфолипидов и испарение хлороформа. Стабильность приготовленных растворов красителей составляет более 1 г.

Время определения одного образца около 5 мин, для 10 образцов около 10 мин. Коэффициент вариации для 10 одинаковых образцов 3,28%. В предлагаемом способе обеспечивается как минимум в 7,5 раза большая чувствительность количественных определений холинсодерджащих фосфолипидов, чем в известном способе (метод Бёттчера) при сохранении абсолютной селективности (нулевое окрашивание) для холиннесодержащих фосфолипидов и в 9 раз быстрее, чем в известном способе (45 мин - известный и 5 мин - предлагаемый способ).

П р и м е р 1. Краситель - кислотный синий 9, Эриоглауцин, Acid Blue 9, Eriglauclne; Alphuazvrine F.G., С I.42090, Aldrlch, USA). К аликвотам, содержащим 5 - 80 мкг холи и содержащих фосфолипидов - фосфатидилхолин (ФХ), лизо-фосфатидил- холин (лизо-ФХ) или сфингомиелин (СМ) в 2 - 3 повторах для статистической обработки результатов, в небольшом объеме хлороформа или спирта (до 100 мкл) добавляют по 3 мл хлороформа и смесь тщательно перемешивают (растворение фосфолипидов), К пробам добавляют по 1 мл водного раствора анион-катионного триарилметанового красителя - кислотный синий 9, (3,0 мг в 1 мл воды). Смесь интенсивно встряхивают для полного перемешивания фаз. Далее образцы оставляют стоять при комнатной температуре для постепенного расслоения фаз (3-5 мин) и затем, удалив верхнюю фазу на водоструйном насосе Пастеровской пипеткой или отобрав нижнюю фазу шприцем, измеряют оптическую плотность (А) на спектрофотометре образовавшейся окраски хлороформной фазы при 625 нм, т.е. при длине волны, соответствующей максимуму поглощения для данного триарилметанового красителя. Измерения проводят в обычной четырехмиллиметровой кювете с длиной оптического пути 1 см против контроля со всеми добавками, кроме фосфолипида.

Полученные калибровочные кривые представлены на чертеже, Интенсивность окраски комплекса фосфолипид-краситель прямо пропорциональна количеству добавленного фосфолипида (ФХ, лизо-ФХ, СМ) в

интервале 0 - 2,5 ед. (А). Следует также отметить высокие величины контролей (около 0,7 - 1,0 ед.А) при сохранении линейной зависимости (А) от количества измеряемых фосфолипидов. Высокие величины контролей могут быть существенно снижены промывкой образцов (1-2 раза) 2 мл воды до величин 0,05 - 0,1 ед. (А), при этом чувствительность способа не меняется и соответствует тем калибровочным кривым, которые

представлены на чертеже,

П р и м е р 2. Краситель - кислотный синий 7, Альфазурин А, Патентованный синий A, (Acid Blue 7, Alphazvrine A, Patent Blue А, С i 42080, Aldrich, USA)

Предварительно готовят водный раствор красителя из расчета 3,0 мг на 1 мл.

Способ осуществляют как указано в примере 1. Интенсивность образовавшейся ок- раски измеряют при 637 нм. Полученные калибровочные кривые аналогичны кривым, представленным на чертеже. Используемый краситель - кислотный синий 7 является анион-катионной формой триарилметано- вых красителей.

П р и м е р 3. Краситель - кислотный синий 1, Патентованный синий ВФ (Acid Blue 1. Patent Blue VF, C.I. 42045, Aldrich, USA).

Предварительно готовят водный рас- твор данного красителя из расчета 3,0 мг на 1 мл,

Способ осуществляют аналогично примеру 1.

Интенсивность образовавшейся окра- ски измеряют при 630 нм. Полученные калибровочные кривые аналогичны кривым, представленным на чертеже. Используемый краситель является катион-анионной формой триарилметановых красителей.

П р и м е р 4. Краситель - кислотный фиолетовый 17 (Acid Violet 17, C.I.42650, Aldrich USA)

Предварительно готовят водный рас- твор красителя иг расчета 3,0 мг на 1 мл.

Способ осуществляют аналогично примеру 1. Интенсивность образовавшейся окраски измеряют при 545 нм. Полученные калибровочные кривые аналогичны кривым, представленным на чертеже.

Используемый краситель - кислотный фиолетовый 17 является анион-катионной формой триарилметэновых красителей.

П р и м е р 5. Краситель в виде сухого порошка.

К пробам, содержащим фосфолипиды, и к контрольным пробам (см.пример добавляют на кончике шпателя по 0,5 мг красителя Кислотного синего 1 и оставляют стоять на 15-20 мин. При этом развивается окра- ска, пропорциональная количеству добавленных фосфолипидов, содержащих холин. Способ особенно удобен для определения количества холинсодержащих фосфолипидов в пятнах после тонкослойной хроматог- рафии. Интенсивность окраски измеряют при 630 нм,

П р и м е р 6. Определение холинсодержащих фосфолипидов в присутствии холин- несодержащих.

К опытным и к контрольным образцам, полученным, как указано в примере 1, добавляют по 200 мкг кардиолипина или фос- фатидилглицерина, или фосфатидилс ерина, или фосфатидной кислоты, или фосфатиди- лэтаноламина. Все дальнейшие процедуры проводят аналогично примеру 1, добавляя по 1 мл одного из перечисленных выше красителей. Полученные калибровочные кривые полностью совпадают с калибровочными кри- выми, полученными в отсутствие холиннесо- держащих фосфолипидов. Таким образом, предлагаемый способ позволяет избирательно (селективно) определять количество холинсодержащих фосфолипидов в присутст- вии холиннесодержащих.

Общим свойством всех испытанных красителей (см. примеры 1 - 4) является наличие анион-катионных группировок, расположенных на триарилметановой структуре исследованных красителей, что является определяющим при образовании комплекса красителей триарилметанового ряда с различными холинсодержащими фосфолипидами только при наличии анион- катионных группировок. Вместе с тем катионные формы триарилметановых красителей - Виктория голубой Р и Виктория голубой В не способны образовывать окрашенные комплексы с холинсодержащими фосфолипидами в органической фазе.

Использование предлагаемого способа обеспечивает по сравнению с известными способами следующие преимущества: чувствительность предлагаемого способа в 7,5 раза выше, чем у известного способа; время, необходимое для проведения одного определения около 5 мин, (у известного способа более 45 мин, т.е. в 9 раз быстрее); по сравнению с известным способами (за базовый принят способ Васьковского) предлагаемый способ позволяет ускорить определение в 35 - 40 раз, а учитывая необходимость количественного выделения фосфолипидов перед определением по способу Васьковского и отсутствие такой необходимости для предлагаемого способа выигрыш во времени составляет как минимум в 100 раз; чувствительность предлагаемого метода более, чем в 5 раз выше, чем в методе Васьковского; предлагаемый способ позволяет избирательно (селективно) определять количество холинсодержащих фосфолипидов в присутствии холиннесодержащих.

Формула изобретения Способ определения холинсодержащих фосфолипидов в биологическом материале путем экстракции органическим растворителем, контактирования экстракта с реагентом с последующим спектрофото- метрическим измерением содержания полученного продукта, отличающий- с я тем, что, с целью увеличения чувствительности и селективности, а также упрощения способа, контактирование проводят встряхиванием в бифазной системе органический растворитель: водная среда, а в качестве реагента используют краситель триарилметзнового ряда, содержащий анионные и катионные группы.

ff30«

з,М

2,52,0лизо.Предлагаемый способ

ФХ

Метод Васькодского Метод беттчера

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для количественного определения холинсодержащих фосфолипидов в биологическом материале. Цель изобретения - повышение чувствительности и селективности, а также упрощение способа. Способ основан на специфическом связывании холинсодержащих фосфолипидов с триарилметановыми красителями, содержащими анион-катеон- ные группировки, с образованием окрашенных комплексов, растворимых в органической фазе. Изобретение позволяет в 30 - 100 раз быстрее проводить количественный анализ фосфолипидов, позволяет определять количество холинсодержащих фосфолипидов в присутствии холиннесо- держащих фосфолипидов. Способ обладает в 7,5 раз большей чувствительностью 1 ил.

О Ю 20 30 40 50 SO 70 80 90 100 нкг ФосфолипидоВ