Способ количественного определения фосфолипидов Советский патент 1987 года по МПК G01N21/78 

Изобретение относится к области аналитической химии, а именно к способам колориметрического определения количества фосфолипидов в липидньгх экстрактах, полученных из различных - видов тканей, клеток, субклеточных фрак1Д1й и биотшгических жидкостей.

Целью изобретения является повышение селективности и чувствительности анализа.

Пример 1, В пять стандартных пробирок вносят по 6 мкл раствора фосфатидилэтаноламина (ФЭА) в хлороформе (16,7 мкг/мкл), по 3 мл хлороформа VI по 0,5 мл раствора красителя основного синего К в глицерине (4мг/ /60 м.п) . В контрольные пробирки фос- фолипид не вносят. Смесь тщательно встряхивают несколько раз, добавляют по 1 мл этиленгликоля в каждую пробирку и опять перемешивают встряхиванием. Через 3 мин (после расслоения фаз) отбирают пастеровской пипеткой

10

роль сужает диапазон определяемых: к личеств фосфолипидов.

Пример 3. Без проведения от мывки избытка красителя этиленглико лем перед колориметрией ббразцов.

Способ осуществляют согласно примеру 1, но краситель растворяют в смеси глицерин/этршенгликоль 1:1 об /об (4 мг/60 мл). Оптическую плотность образцов измеряют против хлор форма. Результаты измерений привед ны в табл.3.

Время определения одного образца 15 15 мин, время измерения пяти образцов - 18 мин. Чувствительность мето да, как в примере 1.

Интенсивная окраска контроля, не четкое разделение фаз и избыток кра сителя в хлороформной фазе существе но снижают воспроизводимость измере ний.

П р и м е р 4. Подбор оптимально

20

минимального объема этиленгликоля по 2,5 мл окрашенной х.пороформной фа- 25 для отмывки избытка красителя перед зы и измеряют ее оптическую плотность колориметрией образцов, (он) при 590 нм на цифровом спектрофотометре в 1-сантиметровой кювете против контроля. Оптическую плотность хлороформной фазы в контрольных пробирках измеряют против хлороформа.

Результаты измерений: ОП контролей 0,138 и 0,147 ед. ОП.

Результаты определения оптических плотностей в присутствии красителя в 100%-ном глицерине приведены в табл.1.

Время определения одного образца 5 мин, время измерения пяти образцов - 8 мин. Основной недослаток определения - высокая вязкость глицеринового раствора красителя, что затрудняет его дозировку при введении.

Пример 2. Способ осуществляется как в примере 1, но краситель растворяют в 100%-ном этиленгликоле (4 мг/60 мл).,Оптическую плотность

Способ осуществляют согласно примеру 3. Перед колориметрией хлорофор фазу промыв ают 0,2-5,0 мл эти30 ленгликоля. При этом пропорционально увеличению добавляемого объема этиленгликоля происходит уменьшение объ ема хлороформа и повьппение скорости перехода избытка краски из хлоро35 формной фазы. Результаты измерений приведены в табл,4.

Таким образом, оптимальньш минимальный объем этиленгликоля составляет 1,0 мл, а измерения можно прово

4Q дить в интервале объемов этиленглико ля 0,2-3,0 мл, т.е. при объемном соотношении этиленгликоль:хлороформный раствор фосфолипида (0,2-3,0): :3,0.

П р и м е р 5. Избирательное коли чественное определение фосфолипидов в бинарных смесях на примере смеси ФЭА с фосфатидилхолином (ФХ).

45

контрольных и опытных образцов измеряют против хлороформа. Результаты измерений приведены в табл.2.

Время определения одного образца 20-25 мин, время измерения пяти об- разцоэ - 30 мин. Чувствительность метода, как в примере 1.

Медленное отделение избытка красителя из хлороформной фазы, диффузная граница раздела фаз, снижение точности измерений, увеличение разброса. результатов измерения, высокий конт

роль сужает диапазон определяемых: количеств фосфолипидов.

Пример 3. Без проведения отмывки избытка красителя этиленглико- лем перед колориметрией ббразцов.

Способ осуществляют согласно примеру 1, но краситель растворяют в смеси глицерин/этршенгликоль 1:1 об/ /об (4 мг/60 мл). Оптическую плотность образцов измеряют против хлороформа. Результаты измерений приведены в табл.3.

Время определения одного образца 15 мин, время измерения пяти образцов - 18 мин. Чувствительность метода, как в примере 1.

Интенсивная окраска контроля, нечеткое разделение фаз и избыток кра- сителя в хлороформной фазе существенно снижают воспроизводимость измерений.

П р и м е р 4. Подбор оптимального

минимального объема этиленгликоля для отмывки избытка красителя перед колориметрией образцов,

Способ осуществляют согласно примеру 3. Перед колориметрией хлорофор- фазу промыв ают 0,2-5,0 мл этиленгликоля. При этом пропорционально увеличению добавляемого объема этиленгликоля происходит уменьшение объема хлороформа и повьппение скорости перехода избытка краски из хлороформной фазы. Результаты измерений приведены в табл,4.

Таким образом, оптимальньш минимальный объем этиленгликоля составляет 1,0 мл, а измерения можно проводить в интервале объемов этиленгликоля 0,2-3,0 мл, т.е. при объемном соотношении этиленгликоль:хлороформный раствор фосфолипида (0,2-3,0): :3,0.

П р и м е р 5. Избирательное количественное определение фосфолипидов в бинарных смесях на примере смеси ФЭА с фосфатидилхолином (ФХ).

Смесь фосфолипидов: 6 мкл ФЭА (16,7 мкг/мкл) и 6 мкл ФХ (16,7 мкг/ /мкл) вносят в три пробирки. В три пробирки вносят ФЭА без ФХ и две пробирки без фосфолипидов служат контролем. Определение количеств фосфолипиов проводятJ как в примере 3, с отмывкой красителя 1,0 мл этиленгликоля (отношение этиленгликоль:хлороформ 1:3 по объему). Результаты измерений приведены в табл.5.

-51

Таким обра-эом, предлагаемый метод не позволяет определять ФХ, что мо- жет быть использовано для прямого (без тонкослойной хроматографии) определения количеств других фосфолипи дов, входящих в состав бинарных смесей с ФХ.

П р и м е р 6. Определение ФЭА в присутствии метанола,

В десять опытных пробирок вносят по 6 мкл раствора ФЭА в хлороформе (16,7 мкг/м.п) и в каждую пару пробирок добавляют различные количества метанола (О, 20, 50, 100 и 150 мкл).

В десять контрольных пробирок (без добавления фосфолипидов) добавляют попарно по О, 20, 50, 100 и 150 мкл метанола.

Затем по все пробирки добавляют по 3 мл хлороформа, смесь встряхивают, добавляют во все пробирки по 0,5 мл красителя - основного синего К (4 мг/60 мл) из раствора этилен- гликоль - глицерин (1:1) и после тща тельного перемешивания в каждую пробирку добавляют по 1 мл этиленгликоля. Смесь в пробирках тщательно пере- мeпшвaюf и после расслоения фаз отби рают нижнюю (хлороформную фазу) пастеровской пипеткой. Далее измеряют ОП образцов на спектрофотометре при 590 нм против чистого хлороформа или воды в 1-сантиметровых кюветах. Результаты измерений представлены в табл.6.

Поскольку основной средой для определения фосфолипидов является хлороформ, то добавление в среду определения аликвот метанола полностью соответствует тому, как если бы фосфо- Липиды добавлялись из смеси хлороформа и метанола.

Предлагаемый способ количественного определения фосфолипидов по сравнению с известным обеспечивает повышение чувствительности в 2,5 раза и повышение селективности определения.

Формула изобретения

1. Способ количественного опреде- ления фосфолипидов путем обработки раствора анализируемой пробы в хлоро- форм,е красителем с последующим отделением экстракта и измерением его оптической плотности, отличающийся тем, что, с целью повыше- Ьия селектягшости определения и его чувствительности, в качестве красите10

33

19

ля используют раствор основного синего К в глицерине, или этнпенгликоле, или в смеси глицерина с этиленгли- колем.

2. Способ поп.1,отличаю- щ и и с я тем, что после обработки пробы красителем .в полученную смесь добавляют эти-пенгликоль.

Т а б л и ц а 1

15

0,623 0,610

0,632 0,621

0,620

0,625

3,54

Таблица2

5

30 Контроль 1 0,670

5

35

40

45

Контроль 1 0,426

Контроль 2 0,472

0,450

50

1,073 0,623 0,968 0,518

0,925 0,475 0, 57,2 1,100 0,650 1,279 0,829

1 Контроль Опыт

Контроль 2

Опыт

Контроль 3

Опыт

Контроль 4

Опыт

Контроль 5

Опыт

Контроль 6

Опыт

Контроль 7

Опыт

1Нет0,1540,150

,147

ФЭА0,7830,633

,7770,627 0,625 2,8i

,7650,615

ФЭА + ФХ0,7520,602

,7650,615 0,619 6,1

0,790 0,640

Таблица4

15

15

12

12 5 5 3 3

2,5 2,5 2,0 2,0 1,5 1,5

0,453 1,088 0,426 1,027 0,300 0,950 0,170 0,795

0,635

0,601

0,650

0,625

Объем остающейся хлороформной фазы ниже требующегося для измерений в обычных кюветах

Т а б л и ц а 5

Составитель С.Хованская Редактор Н.Егорова Техред л.СерднжоваКорректор А,Обручар

Заказ 4817/45 Тираж 776Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Проиаводственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Таблицаб

Изобретение касается аналитической химии, в частности количественного определения фосфолипидов в липид- ных экстрактах, полученных из различных видов тканей, клеток, субклеточных фракций и биологических жидкос- тей. Цель изобретения - повьппение чувствительности и селективности анализа. Последний ведут обработкой пробы в растворителе - СНС1. с помощью красителя - раствора основного синего К в глицерине и/или этиленгликоле. Целесообразно после обработки красителем в полученную смесь добавлять этиленгликоль. Затем отделяют экстракт и измеряют его оптическую плотность. Время определения одного образца 5 мин, время измерения 5-ти образцов 8 мин. Способ обеспечивает в 2,5 раза лучшую чувствительность при высокой селективности анализа, чем в известном случае. 1 з.п. ф-лы, 6 табл. (Л со со со