Способ диагностики инфицированности плодов овец вирусом лейкоза крупного рогатого скота Советский патент 1992 года по МПК A61K39/12 

.

S .:

: Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и иммунологии, в частности к разработке экспресс-способа диагностики инфицированности вирусом лейкоза плодов сельскохозяйственных животных в ранние сроки после заражения.

. Лейкозы относятся к хроническим инфекционным заболеваниям опухолевой прйродУ - гём областрза м, основным признаком которых является злокачественное

разрастание клеток кроветворных органов с- нарушением их созревания.

Возбудитель лейкоза крупного рогатого скота - вирус лейкоза крупного рогатого скота - РНК -.содержащий онкогенный ре- тровирус. О путях и чаетоте передачя вируса от больных здоровым животным среди исследователей нет единого мнения. Обще- призноно, что перенос вируса лейкоза путем гамето-хромосомной трансмиссии не происходит. В последнее время исследоваcaraS

толи стали обращать внимание на трансплацента риы и путь передачи вируса лейкоза крупного рогатого скота, интегрированного с ДНК лимфощггов, матери - плоду.

В связи с этим разработка надежного способа определения проникновения через плацентарный барьер материнских лимфоцитов, содержащих геном ВЛ КРС в плод, япляется актуальной проблемой расшифровки механизма прохождения вируса через плаценту и обнаруМШГй ё его в организме плода в более ранние сроки, когда специфические антигены к нему серологическим методом не выявляются.

Известен способ изучения циркуляции крови в плаценте путем введения в сосуды рентгенрконтраспшх веществ - кордиот- раст, з также определения проницаемости сосудов на основе внутривенного введения беременным животным остальных красителей -трипановойсини, туши и ряда других. Но применение их достаточно трудоемко и не удобно в работе. - :. .

Для изучения циркуляции клеток в кровеносной системе, распределение их в кровеносных сосудах тканей, в последнее время используют мечение клеток флуорес- цеин изотиоционатом (ФИТЦ), который не влияет на морфофункциональные свойства клеток 1. -. ; - Известен также способ диагностики ии- фицированности плодов 8Л КРС по обнаружению антител к антигенам р-24 и др 69 ВЛ КРС и РИД в сыворотке крози новорожденных, взятой до скармливания им молозива. У 5 из 15 исследованных плодов (33,3%) от инфицированных ВЛ КРС коров-матерей исследователи отмечали наличие антител к вирусу лейкоза в РИД. У одного плода антитела обнаруживал в более высоком титре, чем у коровы-матери, при этом отмечали инфильтрацию опухолевыми клетками матки и плодной часта плаценты у отдельных инфицированных плодов 2.

Недостатком данного способа является то, что нарушение плацентарного барьера и инфицирование плодоз ВЛ КРС определяли ретроспективно путем обнаружения в сыворотке их крови антител к вирусу лейкоза, не выявлял вирус. Общепризнанно, что антите- ла к вирусу обнаруживают в основном через два месяца после заражения. РИД в этот период бывает ложноотрицатёльной и плод оценивают как свободный от ВЛ КРС, т. е. недовыявляют некоторых животных-виру- соносителей.

Цель изобретения - повышение точности, и повышение проницаемости плацентарного барьера. . -

Поставленная цель достигается благодаря тому, что из крови овцы получают лей- коконцентрат, разводят его питательной средой Игла до концентрации 107-109 кл/мкл, смешивают с флуоресцеином изоти-, оцианатом (ФИТЦ) в соотношении 0,08-0,1 мг/.мл взвеси клеток, инкубируют в термостате при 36-38°С в течение 13-15 мин, отмывают средой Игла до получения чистых 0 меченых клеток и вновь вводят овцематке внутрйзенно в количестве 3,0-8,0 мл при концентрации 1011-1013меченых кл/млсре- ды,через 3-12 ч овцематку убивают, от нее и от плода берут пробы крови, делают мазки 5 и мазки-отпечатки из внутренних органов, которые фиксируют 59-61 %-ным ацетоном :на насыщенном растворе трилона Б в течение 1 мин и учет результатов проводят по наличию меченых клеток в испытуемых пробах. Пред- 0 зрительно для повышения проницаемости плацентарного барьера овцематке вводят внутривенно однократно пирогенал (официальный препарат) в дозе 0,024-0,026 мг/кг массы животных. Для уточнения диагноза на 5 инфицированность плода ВЛ КРС проводят постановку биопробы на ягнятах.

Предложенный способ состоит в следующем. - . :. .. - ...;

От инфицированных ВЛ КРС суягных

0 овец (инфицированность В Л КРС овец определяли по наличию внутреннего белка р24 ВЛ КРС в краткосрочной культуре лейкоцитов крови этих овец) берут кровь и проводят выделение из крови лейкоцитов методом ли5 зиса эритроцитов. Затем полученные лейкоциты трижды отмывают стерильной средой Шла от остатков эритроцитов, ресуспенди- р уют в среде Игла. К взвеси клеток (1x10 - -1x109 кл/мл взвеси) добавляют флуоресцин

0 изотиоционат (ФИТЦ) в расчете 0,08-0,1 мг/мл-взвеси лейкоцитов и инкубируют в термостате при 36,0-38,0°С в течение 13-15 мин. Затем отмывают клетки средой Игла от несвязанного с ними красителя и осаждают

5 его центрифугированием при 1000 об./мин в течение 45 мин. Лейкоконцентрат ресус- пендируют средой Игла до концентрации 10 меченых клеток в 1 мл среды и вводят внутривенно осцам. Каждой овце

0 вводят лейкоциты крови, выделенные из ее крови. С целью повышения проницаемости плацентарного барьера двум из трех ооец внутривенно предварительно вводят пирогенал в дозе 0.024-0,026 мг/кг массы живо5 тного. Через 3-12 ч животных убивают и от овец и их плодов берут пробы кропи, делают м.гзки и мазки-отпечатки из внутренних органов, которые фиксируют 59-61% ацетоном на насыщенном растворе трилона Б в течение 1 мин. Одновременно от плодов бе рут кусочки органов и тканей, фиксируют общепринятым способом для дальнейшей проводки и заливки в уплотняющие среды; Для подтверждения диагноза на инфицированность плодов ВЛ КРС кровь от исследуемых плодов вводят внутрибрюшйнно ягнятам, свободным от ВЛ КРС (ставят биопробу).

Учет результатоз на инфицированность плодов проводят по наличию меченых клеток в мазках-отпечатках из органов плода (просмотр проводят на люминесцентном

. микроскопе) и по положительным результатам биопробы., - .. ......

Пример 1. От трех овец получали кровь, выделяли лейкоконцентрзт, разводи. ли средой Игла до концентрации 109 кл/мл, смешивали с ФИТЦ в соотношении 0,1 мг/мл взвеси клеток, инкубировали в термостате при 38°С в течение 15 мин, отмывали средой Игла от остатков несвязанного ФИТЦ и вводили овцематкам внутривенно в количестве 8,0 мл при концентрации 1013 меченых клеток в 1 мл среды. Через 12 ч овец убивали, от овец и от их плодов брали кровь, делали мазки-отпечатки из внутренних органов, которые фиксировали 61%- ным ацетоном на насыщенном растворе трилона Б в течение 1 мил и просматривали в люминисцентном микроскопе. Двум ов-,

. цам предварительно, до введения лейкоци.; тов крови, меченных ФИТЦ, внутривенно

однократно вводили пирогенал в дозе 0,026

мг/кг массы животного. Сыворотку крови

...плода, и овцы-матери исследовали в РИД,

кровью плодов (гепзринизированной) ставили биопробу на ягнятах,

Отмечали активное свечение меченых

клеток в мазках-отпечатках медиальных подвздошных лимфоузлов, единичные в ,мзтке, в межворсинчатом пространстве плаценты. У овец, которым вводили пирогенал. находили интенсивное свечение в лимфоузлах, матке, между клетками эпителия

- хориона, в строме ворсин. В сыворотке крови плодов и овец-матерей антител к ВЛ КРС обнаружено не было. От плодов двух овец, которым вводили пирогенал, биопроба была положительной.

Пример 2. От трех озец получали крооь, выделяли лейкоконцентрат, разводили средой Игла до концентрации 107 кл/мл, смешивали с ФИТЦ в соотношении 0,08 мг/мл взвеси клеток, инкубировали в термо- .стате при 36°С в течение 13 мин. отмывали средой Игла от остатков несвязанного ФИТЦ и вводили ооцёматкам внутривенно о количестве 3, при концентрации 10 меченых клеток в 1 мл среды. Через 3 ч оэец убиазли, от овцы и ее плода брали кровь,

делали мазки-отпечатки из внутренних органов, которые фиксировали 59%-ным ацетоном на насыщенном растворе трилона Б в течение 1 мин и просматривали о люмимесцентном микроскопе. Двум овцам предва- рительно, до введения лейкоцитов крови, меченных ФИТЦ, внутривенно однократно вводили пирогенал в дозе 0,024 мг/кг массы животного. Сыворотку крови плода и овцыматери исследовали в РИД, кровью плодов (гепаринизированной) ставили биопробу на ягнятах. ..

При осмотре мазков-отпечатков в люминисцентном микроскопе находили едмничные светящиеся клетки в матке, межворсинчатом пространстве, У плодов двух овец, которым вводили пирогенал, находили меченые клетки в мазках-отпечатках из пуповины. В сыворотке крови плодов и

овец-матерей антител и ВЛ КРС обнаружено не было. От плодов двух овец, которым вводили пирогенал, биопроба была положительной.... , . .; . .

Л р им ё р 3. От трех овец получали

кровь, выделяли лейкоконцентрат, разводили средой Игла до концентрации 108 кл/мл, смешивали с ФИТЦ в соотношении 0,09 мг/мл взвеси клеток, инкубировали в термостате при 37°С в течение 14 мин, отмывали

средой Игла от остатков, несвязанного ФИТЦ и вводили овцематкам внутривенно в объеме 5,0 мл при концентрации 1012 меченых клеток в 1 мл среды. Через 6 ч убивали, от овцы и ее плода брали кровь, делали

мазки-отпечатки из внутренних органов, которые фиксировали 60%-ным ацетоном на насыщенном растворе трилона Б в течение 1 мин и просматривали в люминесцентном микроскопе. Двум овцам предварительно.

до введения лейкоцитов крови, меченных ФИТЦ, внутривенно однократно вводили пирогенал в дозе 0,025 мг/кг массы животного. Сыворотку крови плода и овцы-матери исследовали в РИД, кровью плодов

(гепаринмзированной) ставили бирпробу на ягнятах.

При просмотре на люминесцентном микроскопе находили свечение меченых клеток в мазках-отпечатках медиальных подвздошных лимфоузлов (незначительное), в мзтке, о межворсинчзтом пространстве. У плодоя двух овец, которым вводили пирогенал, - среди клеток эпителия хориона, в печени. В сыворотке крови плодов и овец-матерей антител

к ВЛ КРС обнаружено не было. От плодов двух ооец. которым вводили пирогенал, био- проба была положительной. Все пробы материала от девяти, овец и от их плодов фиксировали общепринятым методом с последующей прооодкой и заливкой в парафин. Затем готовили гистосрезы, в которых при просмотре па люминесцентном микроскопе искали святящиеся (меченные ФИТЦ) лейкоциты крови. У всех плодов от овец, у которых повышали проницаемость плацентарного барьера, отмечали наличие светящихся материнских клеток, Ошпроба от этих плодов на наличие В Л КРС была положительной.

.Число обнаруженных меченных ФИТЦ лейкоцитов, введенных овцематкам, зависело от числа введенных клеток и времени от момента их введения до убоп животных. Мззки-отпечатх Гиказались более быстрым и штостггй в исполнении диагностическим приемом по выявлению светящихся клеток по сравнению с обработкой материала для заливки в уплотняющие среды (парафин), приготовление срезоа и последующим их просмотром в люминесцентном микроскопе. ..;..- ; .;: ... . ..- .

Предложенный способ позволяет выявлять проникновение в плод материнских лимфоцитов, содержащих ВЛ КРС, и тем самым задолго до. выработки организмом плода антител к ВЛ КРС судить об йнфици- рованности его этим вирусом.

Способ прост в исполнении благодаря использованию мазков-отпечатков, в которых определяют меченные ФИТЦ клетки.

Предлагаемый способ найдет применение в научно-исследовательских и производственных учреждениях, занимающихся профилактикой и борьбой с лейкозами.

Формула изобретения

.1. Способ диагностики инфицированно- сти плодов овец вирусом лейкоза крупного рогатого скота, включающий отбор крови у

5 овцематок с последующим убоем и забором крови и внутренних органов у плода, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, из крови овцематок гото- влт лейкоконцентрат, разводят его средой

0 Игла до концентрации 107-109 кл/мл. смешивают с флуоресцеиномизотиоционэтом в количестве 0,008-0,1 мг/мл лёйкоконцент- рата, инкубируют при Зб-38°С в течение 13-15 мин, отмывают средой Игла и вновь

5 вводят овцематке внутривенно в количестве 3,0-8,0 мл при концентрации 1011-1013

кл/мл среды, через 3-12 ч овцематку убивают, из внутренних органов плода делают мазки-отпечатки, которые фиксируют 59- 0 61 %-ным ацетоном на насыщенном растворе трилона Б в течение 1 мин, и при наличии меченых клеток в испытуемых пробах диаг носциругат инфицированность плодов виру- сом лейкоза крупного рогатого скота.

5 2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью повышения проницаемости плацентарного барьера, овцематке перед введением меченых клеток внутривенно однократно вводят пирогенал в дозе 0,0240 0,026 мг/кг массы животного.

3. Способ по пп. 1 и 2, о т л и ч а ю щ и- й с я тем, что, с целью повышения точности, дополнительно проводят постановку биопробы на ягнятах..

5 .- -- ,: - . .:

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и иммунологии, Б частности к разработке экспресс-способа диагностики инфицированное™ вирусом лейкоза плодов сельскохозяйственных животных в ранние сроки после заражения. Целью изобретения является повышение точности способа и повышение проницаемости плацентарного барьера. Для этого из проб крови суягных овец получают лейкоконцентрат, разводят питательной средой Игла до концентрации 107-109 кл/мл, смешивают с флуоресцеин изотиоционатрм (ФИТЦ) в соотношении 0,08-0,1 мг/мл взвеси клеток, инкубируют в термостате при36-38°С 13-15 мин, отмывают средой Игла до получения чистых меченых клеток и внооь вводят овцематкам внутривенно в 3,0-8,0 мл при концентрации 1011-1013 меченых клеток на 1 мл среды, через 3-12 ч овцематок убивают, от них и их плодов берут пробы крови, делают мазки и мазки-отпечатки из внутренних органов, которые фиксируют 59-61 %-ным ацетоном на насыщенном растворе трилона Б в течение 1 мин и учет результатов проводят по наличию меченых клеток в испытуемых пробах. Предварительно, перед введением меченых клеток, для повышения проницаемости плацентарного барьера вводят внутривенно пирогенал (официальный препарат) в дозе 0,024-0,026 мг/кг массы животного. Для уточнения диагноза На инфи- цйрованность плода ВЛ КРС проводят постановку биопробы на ягнятах. 2 з.п. ф-лы. С