Штамм перевиваемой клеточной линии фибробластов эмбриона овцы фэо, продуцирующий бычий лейкозный вирус (блв) Советский патент 1980 года по МПК C12K9/00 

(54) ШТАММ ПЕРЕВИВАЕМОЙ КЛЕТОЧНОЙ ЛИНИИ

ФИБРОПЛАСТОВ ЭМБРИОНА ОВЦЫ ФЭО, ПРОДУЦИРУЮЩИЙ

БЫЧИЙ ЛЕЙКОЗНЫЙ ВИРУС

1

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и представляет собой штамм перевиваемой клеточной линии фибробластов эмбриона овцы ФЭО, продуцирующий бычий лейкозный вирус (БЛВ), изолят «Латвийская бурая.

Наиболее близкой к заявляемой является культура клеток селезенки эмбриона овцы (FLS), полученная в 1974 г. доктором М.Ван-дер-Маатеном в Национальном центре по изучению заболеваний животных, США 1. Однако эта культура является дефицитной у нас и не обеспечивает все исследовательские работы по изучению лейкоза крупного рогато госкота. Кроме того, при потере культуры нет возможности восстановить ее.

Целью изобретения является получение перевиваемой линии клеток, продуцирующей БЛВ.

Заявляемую перевиваемую клеточную линию получают следующим способом. В качестве культуры тканей используют кожномыщечную ткань эмбрионов овец. Культуру ткани выращивают на среде следующего состава: среда Игла 60%, 0,5%-ный гидролизат лактальбумина 25%,. инактивированная бычья сыворотка 15°/о, с добавлением антибиотиков: пенициллин - 200 ед/мл, стрептомицин 50 ед/мл, канамицин - 100 ед/мл. Первично-трипсинизированную культуру ткани на ранних пассажах (2-3) кокультивируют с лейкоцитами больной хроническим . лимфолейкозом коровы породы «Латвийская бурая. Лейкоциты из периферической крови выделяют следующим способом. Эритроциты крови разрушают гемолитическим щтоком путем добавления к одному объему

10 крови двойного количества тридистиллированной воды с последунэщим восстановлением изотоничности и осаждением лейкоцитов. Культуру ткани инфицируют лейкоцитами в соотношении 1:50, при этом последние вносят на 24-часовой монослой клеток. Пос15ле этого культуру ткани выдерживают для адсорбции при +37° в течение 1 часа: наливают питательную среду и ставят в термостат при 37°С. В дальнейщем инфицированную культуру ткани продолжают пассировать и пересевают через 3-4 для в соотнощении 1:2-1:3.

Полученная таким образом перевиваемая клеточная линия фибробластов эмбриона овцы ФЭО характеризуется следующим признаками.

Морфологические признаки. Продуцирующая БЛВ культура фибробластов эмбриона овцы ФЭО представляет собой фибробластоподобные клетки. Морфологическое изучение культуры вьшвило многоядерных клеток - симпластов. Симпласты представляют собой большие по размеру клетки округлой формы, содержащие в начале пассирования по 2-3 ядра, количество которых увеличивается и достигает 30. Клетки:симпласты появляются, начиная с 2-3 пассажа, на уровне 20-30 пассажа количество симпластов достигает максимального значения - 7,4%. Митотический индекс в ФЭО9,6%. При электронно-микроскопическом исследования обнаружены вибрионы сферической формы диаметром 75-150 нм, имеющие двухконтурную оболочку. Вибрионы наблюдаются в вакуолях клеток, а также в межклеточном пространстве.

При иммунофлюоресцентном исследовании наблюдается зернистое или диффузное свечение цитоплазмы как в одноядерных, faK и в многоядерных клетках - симпластах. С увеличением числа пассажей наблюдается как увеличение числ.а флюоресцирующих клеток, так и интенсивность свечения. Методом РИД установлено,- что культура продуцирует в культуральную среду антиген р24. - вирусспецифический антиген БЛВ.

На фиг. 1 представлена динамика образования вирусспецифического антигера БЛВ «в продуцирующих онкорнавирус культурах ткани (по РИФ): фибробластах эмбриона овцы ФЭО, легких эмбриона овцы ЛЭО, почек эмбриона овцы ПЭО. Из данных видно, что процент флюоресцирующих клеток в культуре ФЭО наиболее высокий по сравнению с культурами ЛЭО и ПЭО.

Физико-химические признаки.

На фиг. 2 показана плотностная характеристика вирусных JjacTHn, продуцируемых фибробластами эмбриона овцы 24 пассажа, 6 градиенте плотности сахарозы 20-60°/о: вирус, меченый Н-уридином, после цикла дифференциального центрифугирования в градиенте плотности сахарозы 20-60% находится в зоне плотности 1,16-1,18 г/мл, что характерно для онкорнавирусов.

РНК - содержащие структуры содержат фермент ревертазу, активность которой увеличивается с увеличением числа пассажей (таблица).

Ревертазная активность культуры ткани ФЭО, .продуцирующей БЛВ

№ пассажа

29ч 40

Продуцируемый культурой ФЭО БЛВ содержит 10 главных полипептидов (мол. вес от 85000 до 9000 дальтон). Одним из мажорных белков является белок с молекулярным весом 24000 дальтон/др24/(согласно номенклатуре белков вирусов). Гликопротеидом является белок мол. весом 60000 дальтон

йрбо/: Физиологические признаки.

Клетки снимаются со стекла 0,02%-ным раствором версена с добавлением раствора трипсина. При пипетировании образуется однородная взвесь клеток.

Жизнеспособность перевиваемых клеток

ФЭО, продуцирующих БЛВ, поддерживают

путем регулярных пересевов на свежую питательную среду. Частота пересева 2 раза

в неделю. Коэффициент пересева 1:2-1:3.

Получение перевиваемой клеточной линии ФЭО, продуцирующей БЛВ, создает возможность использовать его в качестве источника накопления лейкозоспецифического антигента БЛВ, применяемого в ряде иммунологических реакций при диагностике лейкоза крупного рогатого скота. С использованием полученной клеточной линии для продукции БЛВ вне организма в значительной мере сократится число экспериментов на животных, а следовательно, сократятся и дополнительные трудности и расходы, связанные с выращиванием и содержанием их.

Формула изобретения

Штамм перевиваемой клеточной линии фибробластов эмбриона овцы ФЭО, продуцирующий бычий лейкозный вирус (БЛВ).

Хранится в институте микробиологии им. Августа Кирхенщтейна Академии наук Латвийской ССР.

Морфологические признаки. Продуцирующая БЛВ культура фибробластов эмбриона овцы ФЭО представляет

собой фибробластоподобные клетки. В культуре выявлено наличие клеток симпластов больших по размеру многоядерных клеток округлой формы, содержащих в начале пассирования по 2-3 ядра, количество которых

увеличивается с пассированием и достигает 30. Симпласты появляются начиная с 2-3 пассажира, на уровне 20-30 пассажа количество клеток-симластов достигает .максималы ого значения - 7,4%. Митотический индекс в ФЭО 9,6%. Электронно-микроскопическое исследование выявляет наличие вирионов сферической формы диаметром 75-150 нм, имеющих двухконтурную оболочку. Вирионь наблюдаются в вакуолях клеток, а также в межклеточном пространстве.

При иммунофлюоресцентном исследовании наблюдается зернистое или диффузное свечение цитоплазмы как в одноядерных, так и в многоядерных клетках-симпластах, с увеличением числа пассажей наблюдается

как увеличение числа флюоресцентных клеток, так и интенсивность свечения.

Физико-химические признаки.

Культура продуцирует в культуральную среду антиген р24-вирусспецифический антиган БЛВ.

Вирус, мечений Н-уридином, после цикла дифференциального центрифугирования в градиенте плотности сахарозы 20-60% находится в зоне плотности 1,16-1,18 г мл, что характерно для онкорнавирусов.

РНК - содержащие структуры содержат фермент ревертазу, активность которой-увеличивается с увеичением числа пассажей.

Продуцируемый культурой БЛВ содержит 10 главных полипептидов (мол, вес. от 85000 до 9000 дальтон). Одним из мажорных белков является белок с мол.весом 24000 дальтон (р24 согласно номенклатуре белков вирусов). Гликопротеодом является белок мол.весом 60000 дальтон (др 60).

Физиологические признаки.

Клетки снимаются со стекла 0,02/о-ным раствором версена с добавлением раствора

трипсина. При пипетировании образуется однородная взвесь клеток.

Жизнеспособность перевиваемых клеток ФЭО, продуцирующих БЛВ, поддерживают путем регулярных пересевов на свежую питательную среду: среда Игла 60%, 0,5%-ный гидролизат лактальбумина 25%, инактивированная бь1чья сыворотка 15%, пенициллин 200 ед/мл, стрептомицин 50 ед/мл, канамицин 100 ед/мл; частота пересевов 2 раза в неделю, коэффициент пересева 1:2-1:3.

Перевиваемая клеточная линия фибробластов эмбриона овцы ФЭО, продуцирующая БЛВ, предназначена для накопления лейкрзоспецифического антигена БЛВ, используемого в иммунологических реакциях при диагностике, а также при изучении лейкоза крупного рогатого скота.

Источники информации,

принятые во внимание при экспертизе

1. М. J. Van der Maaten et al. Replicating type-С virus particles in monolagek cell сиИцгез of tissues -from cattle with lymphosarcoma, J., Nat., can. Jn., 1974, 52, № 2, 491-497.

ФЭО

лэо

2 4 20 3040

us.J Пассаж

S 4

§ I 16

J)

«)

12 6

iU i,2

fiui.2