Способ выделения свободного рибонуклеопротеида вирусов гриппа типов А и В Советский патент 1992 года по МПК C07H21/02 A61K35/76 

Изобретение относится к биологии, а именно к вирусологии. .

Известен способ выделения рибонукле- опротеида (РНП) вирусов гриппа путем разрушения вирионов смесью неионного и ионного детергентов с последующим седи- ментационным выделением вирионного РНП,

Наиболее близким к изобретению является способ выделения РНП вирусов гриппа, предусматривающий обработку вирионов неионным детергентом (нонидет Р-40 (НР-40), тритон N-101 (ТН-101). лизоле- цитин и др.) в гипертонической среде (0,25 М NaCI) с нейтральным рН в диапазоне 7,4 - 8,1 с последующим выделением РНП посредством центрифугирования.

Однако известные способы не позволяют добиться полной диссоциации вирионного РНП и матриксного белка М1, что обусловливает невысокий выход свободного (без белка М1) РНП. В указанных работах

удается получать около 20% РНП от общего его количества в исходном вирусе - источнике выделения.

Цель изобретения - повышение выхода целевого продукта.

Для этого разрушение вирионов вируса гриппа, которое происходит в ходе центрифугирования вирионов через раствор глице- рина (так называемая совмещенная с центрифугированием депротенизация вирионов), осуществляют неионным детергентом в кислой среде с рН 6,0 - 4.5 в гипо- либо изотонических условиях (40 - 150 мМ NaCI или KCI). Кислый рН обусловливает эффективную солюбилизацию белка М1. что позволяет осуществить близкий к 100% выход свободного вирионного РНП.

Пример. 9-дневные куриные эмбрионы заражают вирусами гриппа A (WSN) 33 (H1N1)A/Aichl2/68 (H3N2), A/FPV/Weybridge(H7N7)B/Lee/40 и С- Улан-Уде/131/25/86 с множественностью

со

с

VI

О

CJ О

ел

о

около 10 БОЕ на эмбрион и инкубируют при 33 - 36°С. Через 24 - 72 ч собирают вирусо- содержащую аллантоисную жидкость (а.ж.), которую осветляют центрифугированием при 12000 об/мин в течение 20 мин (2 раза). Осветленную а.ж. разводят раствором Хен- кса до 64 ГАЕ/мл и 8,5 мл полученной суспензии наслаивают нч двухступенчатый градиент глицерина: 3,8 мл 15 %-ного раствора, приготовленного на воде (интерслой), и 4,3 мл 25%-ного раствора (базовый слой), содержащего 1% НР-40 или ТН-101, NaCI 40 мМ ингибитор протеиназ-апротинин для предотвращения деградации вирусных белков и 10 мМ трис-гидроксиметиламиноме- тана, который доводят до значения рН 5,0, гидроксиэтилпиперазинэтансульфоновой кислотой (трис-ГЭПЭС-буфер), либо морфо- линоэтансульфоновой кислотой (трис-МЭС- буфер). 15%-ный интерслой служит для концентрации вирионов и предотвращает соприкосновение вирусосодержащей а.ж. с содержащим детергент базовым слоем.

Сформированные градиенты центрифугируют при 22 000 об/мин в течение 2,5 ч при 11 - 12°С (ротор SW 27.1; Spinko L5-65). При центрифугировании вирионы проходят интерслой и входят в базовый слой, где подвергаются воздействию детергента в среде с рН 5,0. Детергент растворяет ли- попротеидную оболочку вируса, что вызывает освобождение оболоченных вирусных белков, НА1, НА2, и М1, которые после растворения остаются в растворе глицерина в силе невысокой скорости седиментации, а вирусные нуклеоиды (РНП с белком М1) или свободные РНП проходят 25% глицерин и осаждаются на дно центрифужной пробирки. После центрифугирования надоса- дочную жидкость аккуратно удаляют. Белки осадков (нуклеокапсидная фракция)растворяют в буфере (1 % додецилсульфата натрия, 0,01 М дитиотреита, 0,2 М трис-HCI, рН 6-8) в течение 1 - 2 мин в кипящей водяной бане и анализируют с помощью электрофореза в по- лиакриламидном геле. По данным полипеп- тидного анализа осадков судят о степени депротеинизации вирионов.

Электрофорез белков проводят в пластинах (толщина 1,2 мм). Разделительный гель (10 см) - трис-НС -буфер (рН 8.8), фокусирующий гель (1 см)-трис-НС -буфер (рН 6,8). Система полимеризации - рибофлавин

(8 мкгр/мл)-1ЕМЕД (0,04%) при облучении УФ-светом. После электрофореза гели окрашивают Кумаси R-350 (Pharmacia). Для количественной оценки белков окрашенные

гели сканируют в видимом свете на микроденситометре CDS-200 (Beckman).

Количественная оценка результатов, выполненная на основании сканирования гелей, показывает, что в нуклеокапсидной

фракции белок М1 сохраняется в количествах не более 5%. Сканирование также показывает, что содержание главного нуклеокапсидного белка NP во фракции, изолированной при кислых рН, было сходным с таковым в препарате исходного вируса. Такой результат говорит о практически полной изоляции РНП из вируса с помощью данного способа выделения.

Характеристику вирусных РНП, выделенных при кислых рН предлагаемым способом, проводят электронно-микроскопическим исследованием нуклеокапсидных осадков. Оно показывает, что в препаратах, выделенных при кислом рН 6,0-4,5, обнаруживают типичные спиралевидные сегменты вирусного РНП.

Таким образом, представленные результаты демонстрируют, что разрушение вирионов вируса гриппа типов А и В с помощью неионного детергента в среде с рН 6,0 - 4,5 позволяет с высокой эффективностью диссоциировать РНП от поверхностных гликопротеидов и матриксного белка М1, что, с свою очередь, позволяет с помощью центрифугирования добиться практически полной изоляции вирионного рибонуклеопротеида из исходного вирусного препарата, что говорит о повышении выхода целевого продукта.

Формула изобретения

Способ выделения свободного рибонуклеопротеида вирусов гриппа типов А и В путем разрушения наружной оболочки вирусных вирионов неионным детергентом,

фракционирования в градиенте концентрации глицерина, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, разрушение наружной оболочки вирусных вирионов осуществляют непосредственно при фракционировании, а раствор глицерина готовят на 5 - 25 мМ буфере трис-ГЭПЭС или трис-МЭС, рН 4.5 - 6,0, содержащем 40 - 150 мМ NaCI.

Изобретение относится к области биологии, а именно к вирусологии. Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта. Способ заключается в разрушении вирионов ортомиксовирусов, которое проводят в ходе их центрифугирования через раствор глицерина неионным детергентом в кислой среде с рН 6,0 - 4,5. Кислый рН обусловливает эффективную со- любилизацию матриксного белка М1. что позволяет осуществить близкий к 100% выход вирионного РНП.