СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ ЯДЕРНЫХ РИБОНУКЛЕОПРОТЕИДОВ (РНП) ИЗ ТКАНЕЙ И ОРГАНОВ МЛЕКОПИТАЮЩИХ Российский патент 2011 года по МПК C12P19/30 C12P21/00 

Изобретение относится к области биохимии, молекулярной биологии, ветеринарии и медицины.

Предлагается новый способ выделения препаративных количеств рибонуклеопротеидов (РНП) с использованием нейтрального детергента цетавлона, ранее применяемого только для очистки аналитических количеств РНК и ДНК.

В качестве источников РНП используют ткани и органы молодых (1-2 года) животных (крупный рогатый скот), которые подвергают гомогенизации с последующим выделением ядер клеток. Затем осуществляют лизирование ядер детергентом и очистку препарата от белков, ДНК и высокомолекулярных РНК с использованием концентрированных растворов NaCl и нейтрального детергента цетавлона, образующего с ДНК и высокомолекулярными РНК нерастворимые в воде соли. Конечный продукт переосаждают этанолом, лиофилизируют и хранят в запаянных ампулах при 4°С.

Низкомолекулярные ядерные рибонуклеопротеиды (РНП) являются генетическими регуляторами, набор которых специфичен для клеток каждой ткани и для каждой стадии онтогенетического развития организма. РНП содержатся в клетках нормальных здоровых организмов, поэтому не обладают токсическим эффектом и слабо отличаются от одного вида животных к другому. В настоящее время они активно исследуются на предмет применения в качестве лекарственных средств и адаптогенов для лечения различных заболеваний человека.

Известные на сегодняшний момент способы выделения рибонуклеопротеидов (Kirkby K.S. A new method for the isolation of nucleic acids from mammalian tissues, 1956, Biochem. J., 64, 405 (1); Feramisco J.R., Helfman D.M., Smart J.E., Burridge K., Thomas G.P., 1982, Coexistence of vinculin-like protein of higher molecular weight in smooth muscle, J. Biol. Chem. (2); Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук, 1984, Методы генетической инженерии, «Мир», Москва, стр.191-192 (3)) обладают следующими недостатками:

1. Использование высокотоксичных реагентов: требуется спецоборудование и средства защиты персонала.

2. Дорогостоящие операции по утилизации фенола и хлороформа, что приводит к значительному удорожанию получаемого продукта.

3. Конечная очистка получаемых препаратов от токсических примесей значительно усложняет процедуру и увеличивает время выделения.

Целью настоящего изобретения является разработка легковоспроизводимого, нетоксичного способа выделения препаративных количеств низкомолекулярных рибонуклеопротеидов (РНП) высокой степени очистки, стабильно сохраняющих активность, пригодных для введения в организм млекопитающих.

В качестве прототипа предлагаемого способа выделения низкомолекулярных рибонуклеопротеидов можно рассматривать способы получения низкомолекулярных рибонуклеопептидов из ядер клеток тканей и органов крупного рогатого скота, описанные Витвицким В.Н. и соавторами в патенте RU 2238756, опубликованном 27.10.2004 (заявка на выдачу патента РФ №2003101855 от 24.01.2003). Для получения низкомолекулярных ядерных рибонуклеопротеидов в известном способе ткань (например, печени) крупного рогатого скота (молодых здоровых животных) отделяют от соединительнотканных оболочек, сосудов, жировых прослоек и отмывают от клеток крови в физиологическом растворе. Обработанную таким образом ткань гомогенизируют при низкой температуре в растворе, содержащем Трис-буфер, хлористый кальций, ЭДТА и Тритон Х-100. Гомогенат центрифугируют, осадок промывают в том же растворе, но без Тритона Х-100, суспензируют в растворе ацетата натрия, содержащем Трис-HCl буфер (рН 5,0), ЭДТА и додецилсульфат натрия. Затем приливают смесь фенола : хлороформа (1:1) и прогревают на водяной бане. После охлаждения систему центрифугируют, отбирают верхнюю фазу, содержащую РНК, к ней снова приливают смесь фенола : хлороформа (1:1), прогревают, охлаждают и центрифугируют. Эту процедуру повторяют несколько раз при последовательно увеличивающейся температуре прогревания. Полученные фазы центрифугатов снова депротеинизируют, удаляя большую часть белков, ДНК и высокомолекулярных РНК, которые удаляют центрифугированием из растворов после добавления к ним натрия хлорида до 1-2 М. К полученным фазам центрифугата для осаждения целевого продукта приливают охлажденный этанол, осадок отделяют, промывают этанолом. После стерилизующей фильтрации целевой продукт разливают в ампулы и лиофильно высушивают. Ампулы запаивают под вакуумом и хранят в холодильнике.

Существо предложения заявителя, направленного на выделение препаративных количеств низкомолекулярных ядерных рибонуклеопротеидов с помощью доступных простых технологических приемов без использования токсичных реагентов с высокой степенью очистки, обеспечивающей возможность введения в организм человека и животных, состоит в следующем.

Для выделения низкомолекулярных фракций рибонуклеопротеидов использовали ткани органов молодых (1-2 года) животных (крупный рогатый скот). Ткань освобождали от жировой клетчатки и соединительнотканных слоев, гомогенизировали и центрифугировали для получения отдельных клеток. Клетки лизировали с помощью нейтрального детергента Тритон Х-100 для выделения клеточных ядер. Полученные ядра гомогенизировали в присутствии додецилсульфата Na (SDS) и затем полученный гомогенант освобождали от белков и ДНК с помощью растворов NaCl и нейтрального детергента цетавлона. Разработанная методика может быть разбита по этапам, между которыми возможны перерывы на одни и более сутки.

Поскольку растворимость цетавлоновых солей однонитиевых и двунитиевых молекул нуклеиновых кислот в водных растворах различна и зависит от концентрации NaCl, то цетавлон ранее использовался в основном для очистки препаратов ДНК от примесей РНК и других высокомолекулярных соединений (Сулимова, 1978, Сулимова и др., 1976, 1978; Дохием, 1977; Хвойка и др., 1978). В данном способе выделения цетавлон используется как основной компонент, позволяющий отделить низкомолекулярные рибонуклеопротеиды от примесей ДНК и высокомолекулярной РНК, ранее цетавлон не использовался для этих целей.

Подробное изложение осуществления способа

Ниже описаны условия (температурный режим, концентрация реагентов, параметры центрифугирования), оптимальные для получения максимального выхода низкомолекулярных ядерных рибонуклеопротеидов с высокой степенью очистки из ткани печени и почек.

Очищенную ткань ресуспендируют в 0,01 М Трис-буфере (рН=7,0), содержащем 0,35 М сахарозы и 0,01 М хлорида кальция. После чего добавляют Тритон Х-100 до конечной концентрации 1% и гомогенизируют получившуюся смесь. Полученную суспензию центрифугируют 7 минут при 7000 об/мин, 4°С.

Супернатант отбрасывают, а полученный осадок ядер ресуспендируют в 0,1 М Трис-HCl буфере (рН=7,6), содержащем ЭДТА (0,05 М) с добавлением к нему SDS до конечной концентрации 1% и 5 М NaCl до конечной концентрации 1 М, после чего оставляют данную смесь инкубироваться на 30 мин, 60°С.

К полученной суспензии добавляют 5 М ацетата калия до конечной концентрации 1 М, после чего смесь инкубируют на холоде в течение 1,5 часов для осаждения SDS и комплекса SDS-белок.

Получившуюся суспензию центрифугируют 25 минут при 6000 об/мин, 10°С.

К супернатанту, полученному в результате центрифугирования, добавляют равный объем 1% раствора цетавлона и инкубируют в течение 30 минут при комнатной температуре.

Получившуюся суспензию центрифугируют 10 минут при 4000 об/мин, 15°С.

К супернатанту, полученному в результате центрифугирования, добавляют равный объем 0,5% раствора цетавлона и инкубируют в течение 2,5-3 часов при комнатной температуре.

Получившуюся суспензию центрифугируют 20 минут при 10000 об/мин, 15°С.

Осадок растворяют в 1 М NaCl, после чего осаждают целевой продукт - низкомолекулярные ядерные РНП 2,5 объемами охлажденного этанола.

Полученный осадок растворяют в дистиллированной воде и лиофилизируют.

Лиофильно высушенный препарат представляет собой гигроскопичный белый порошок без запаха и вкуса. Сохраняет активность в течение одного года при хранении при температуре не выше 4°С, хорошо растворим в воде.

Выход препарата: из 1 г ткани получают обычно около 1,2 мг конечного препарата.

Общее время выделения занимает около 6-7 часов.

Использование электрофореза нуклеиновых кислот в агарозном геле, спектрофотометрического анализа и специфической реакции на определение нуклеиновых кислот (по Шмидту-Таунхаузеру) показало, что характеристики препарата, получаемого по данному способу, и препарата, получаемого с помощью фенольного метода, близки и оба препарата имеют сходную чистоту и соотношение РНК/ДНК. Препарат содержит 90% низкомолекулярных рибонуклеопротеидов, а также примеси ДНК и белка.

Способ может быть разбит по этапам, между которыми возможны перерывы на 24 и более часа, что обеспечивает технологичность процесса.

Данным способом можно выделять низкомолекулярные рибонуклеопротеиды из других органов и тканей, по такому же принципу. При этом такие параметры выделения, как режимы центрифугирования, концентрации отдельных реагентов (Тритон Х-100, SDS) и т.п., можно варьировать для получения максимального выхода целевого продукта из конкретного вида ткани. Основные параметры процесса, такие как последовательность стадий, используемые концентрации и соотношения цетавлона и натрия хлорида, являются общими для выделения низкомолекулярных рибонуклеопротеидов из различных тканей и органов млекопитающих.

Данный способ исключает использование токсичных реагентов для выделения высокоочищенных препаратов РНП, годных для введения в организм человека и животных, при этом позволяет за одно выделение получать препаративные количества РНП (более 100 мг).

Изобретение предназначено для выделения низкомолекулярных ядерных рибонуклеопротеидов (РНП) из тканей млекопитающих с использованием нетоксичных и недорогих реагентов. Указанный результат достигается за счет того, что используется нейтральный детергент цетавлон для выделения и очищения фракции низкомолекулярных рибонуклеопротеидов от ДНК и высокомолекулярной РНК. Цетавлон образует с ДНК и РНК нерастворимые в воде соли, благодаря чему из раствора можно последовательно осадить ДНК и высокомолекулярные РНК. В результате в растворе остается фракция низкомолекулярных рибонуклеопротеидов, которую затем осаждают с помощью цетавлона. Полученный осадок растворяют в этаноле для осаждения чистых рибонуклеопротеидов. Цетавлоновые соли нуклеиновых кислот устойчивы к действию ферментов РНКаз, благодаря чему данный способ может быть разбит на стадии с большими временными промежутками (до нескольких суток) без потери биологических свойств выделяемых рибонуклеопротеидов. Данный способ выделения позволяет получать низкомолекулярные рибонуклеопротеиды высокой чистоты (содержание РНП в полученных образцах - 90%) в препаративных количествах.

Способ получения низкомолекулярных ядерных рибонуклеопротеидов (РНП) из тканей и органов млекопитающих, включающий выделение фракции клеточных ядер с помощью нейтрального детергента Тритона-XI00 с последующим их лизисом посредством додецилсульфата Na (SDS), освобождение полученного гомогената ядер от белков и ДНК с выделением целевого продукта - низкомолекулярных ядерных РНП и переосаждение его этанолом, отличающийся тем, что освобождение полученного гомогената ядер от белков и ДНК осуществляют с помощью концентрированных растворов NaCl и нейтрального детергента цетавлона (цетилтриметиламмоний бромида), при этом к гомогенату клеточных ядер добавляют 5М ацетата калия до конечной концентрации 1М, инкубируют полученную смесь на холоду в течение 1,5 ч, после чего центрифугируют, к полученному супернатанту добавляют равный объем 1%-ного раствора цетавлона и инкубируют в течение 30 мин, получившуюся суспензию центрифугируют, отделяют супернатант, добавляют к нему равный объем 0,5%-ного раствора цетавлона и инкубируют в течение 2,5-3 ч, получившуюся суспензию центрифугируют, полученный осадок растворяют в 1М NaCl, после чего переосаждают целевой продукт охлажденным этанолом.