Способ выделения матриксного белка м1 ортомиксовирусов Советский патент 1992 года по МПК C12N7/00 A61K39/00 

Изобретение относится к биологии, а именно вирусологии, и касается выделения мэтриксного белка М1 ортомиксовирусов.

Целью изобретения является получение нативного незгрегированного матриксного белка М1 ортомиксовирусов типов А, В.

Для достижения цели разработан прием поэтапной депротеинизации вирусов гриппа типов А, В и с помощью неионного детергента при различных рН. На первом этапе посредством воздействия детергента в нейтральной среде (рН 6,8 - 8,0) осуществляют растворение липидной оболочки вирионов и удаление поверхностных гликопротеидов с сохранением внутреннего нуклеида. На втором этапе обработка полученного вирионного нуклеоида детергентом в кислой среде (рН 3,0 - 4,5) приводит к избирательной солюбилизации матриксного белка М1, что делает возможным его получение после удаления вирусного ри- бонуклеопротеида (РНП). Такой способ выделения, лишенный какого-либо денатурирующего воздействия, исключает агрегацию М1 и позволяет получить его в нативном состоянии в растворимой форме. Пример. Вирусы гриппа A/WSN/33(H1N1), A/Aichi/2/68(H3N2). A/FPV/Weybridge(H7N7), B/lee/40. размножают в 9-дневных куриных эмбрионах при 36°С в течение 48 ч, кроме вирусов В/Lee/40, которые инкубируют 72 ч при32°С. Вируссо- держащую аллантоисную жидкость (АЖ) разводят раствором Хэнкса до концентрации вируса 256-512 ГАЕ/мл и осветляют-при 1 ЮООд 30 мин. Осветленную АЖ.наслаивают на двухступенчатый градиент глицерина (8,5 мл вирусного материала на одну пробирку

vj

О VI О

VJ

ь.

градиента), в котором верхний спой (интерслой) состоит из 3,5 мл 10%-ного раствора глицерина, приготовленного на веде без каких-либо добавок, а нижний слой (базовый слой) состоит из 4.3 мл 20%-ного глицерина, содержащего 25-100 мМ NaCI, 20 трипсин ингибирующих единиц (ТИЕ) на 1 мл апро тинина (контрикал R, ГЕРМЕД-ГДР), 1% детергента нонидет Р-40 (NP 40) и 5 мМ трис-гидроксиметиламинометанэ, доведенного до рН 6,8-8,0 морфолинэтансуль- фоновой кислотой (МЭС), либо гидроксиэтилпиперазинэтансульфоновой кислотой (ГЭПЭС). Для выделения вирион- ных нуклеоидов градиенты центрифугируют при 20000 об/мин и при 15 - 18°С в роторе SW28.1 (Spinkb L-5). В ходе центрифугирования у вирионов при прохождении базового слоя происходит растворение наружной липопротеидной оболочки под действием детергента NP-40. В результате, солюбили- зированные вирусные гликопротеиды задерживаются в глицерине, в нуклеоиды проходят базовый слой и оседают на дно пробирки.

После центрифугирования аккуратно удаляют жидкую фазу градиентов и полученные осадки (вирусный нуклеоид) из 3 - 4 пробирок суспендируют в 350 мкл 10%-ного глицерина, содержащего 50 - 200 мМ NaCI. 20 ТИЕ/мл апротинина. и 0.1 -0,5% NP-40. Полученную суспензию делят на части по 100 мк-п. к которым добавляют 10 - 30 мкл И фосФэтно(Ма2НРО.,} Цитратного ) либо цитратного (СеНзОт JvNaj) буфера с различным рН в дизпэ- зс 3.0 - 5,2. После пипетирования суспензию наслаивают на 0.5 мл 20%-ного глицерина, приготовленного на воде, и центрифугируют в растворе SW65 при 23000 (12°С) в течение 1,5 - 2.0 ч (Spinko L-5). После центрифугирования отбирают верхний слой в объеме 120 - 150 мкл, удаляют 20%-ный глицерин и сохраняют осадок. Качественную и количественную оценку полипептидного состава полученных фракций проводят на основании электрофореза белков в полиэкриламидном геле, содержащем додецил сульфат натрия с буферной системой Laemmli. После электрофореза гели окрашивают Кумаси R-350 (pharmacla) и отмывают смесью уксусной кислоты (7%) с этанолом (5%) с последующим сканированием окрашенных гелей в видимом свете на спектрофотометре Beckman CDS-200.

Далее проводят второе фракционирование, при котором препарат нуклесида суспендируют в 10%-ном глицерине, содержащем фосфатно-цитратный либо центратный буфер с различным рН в диапазоне 3,0 - 6,2. Полученную суспензию центрифугируют для осаждения вирусных РНП.

Полипептидный состав осадка и суперна- танта анализируют с помощью электрофореза. Как показал анализ, при суспендировании при рН более 4.5 матрик- сный белок Ml сохраняет связь с РНП и

осаждается с ним через раствор 20%-ного глицерина и отсутствует в соответствующей Фракции супернатанта. При суспендировании в буфере в диапазоне рН 3,0 - 4,5 белок М1 избирательно диссоциирует с РНП и переходит во фракцию супернатанта и практически отсутствует в соответствующих фракциях осадка.

В результате анализа можно заключить, что изолированный предлагаемым способом белок М1 находится в растворимом состоянии преимущественно в форме мономеров. Аналогичные результаты по выделению белка М1 при кислых рН получены для всех исследованных штаммов вируса

гриппатипое А. В

Способ мсжет иметь широкое применение s медицине при разработке диэгности- кумов и вакуумных препаратов и в биологии для структурных и функциональных исследовэний белков и субвирусных структур. Формула изобретения Способ выделения матриксного белка М1 ортомикссвирусов путем избирательной солюбилиззции его из еирионов. о т л и ч аю щ и и с я тем. что. с целью получения нативного неагрегисованного белка М1. со- любилизацию осущестапяют путем депро- теинизэции вирионов воздействием 0.5 - 1,0% неионного детергента NP-40 или TN101 в нейтральной или слабощелочной среде с 2 - 20 мМ трис-МЭС или трис-ГЭПЭС буфера (рН 6,8 - 8.0). с последующей обработкой 0,1 - 0,4%-ным неионным детергентом NP-40 или TN-101 з кислой среде (рН 3,0

- 4,5) с 5 - 30 мМ цитратного или фосфоцит- ратного буфера и получением конечного продукта в результате очистки материала от вирусного РНП центрифугированием.

Изобретение относится к биологии и медицине. Целью изобретения является получение нативного неаггрегировэнного мэтриксного белка М1 ортомиксовирусов типа А, В. Цель достигается поэтапной депротеинизацией вирионов с помощью неионного детергента при различных рН. На переом этапе депротеинизирующего воздействия при нейтральном рН получают вирусные нуклеоиды, содержащие белок М1. На втором этапе при обработке нуклеоидов в кислой среде с рН около 4,0 происходит селективная солюбилизэция М1 Таким образом, разработанный способ, лишенный денатурирующих воздействий, позволял получить в растворимом состоянии натив- ный белок М1 ортомикровирусов А, 3. Разработанный способ может иметь широкое применение в медицине при разработке ди- агнсстикумов и вакцинных препаратов и биологии для структурных и функциональных исследований белков и суОэ/русных структур. ел с