Способ получения микроклубней картофеля Советский патент 1992 года по МПК A01H4/00 

Изобретение отно ствснной биотехнолог. б а м к у л i т и о и р о в а н i тканей и органов ра испопь .оз чо при, вып: лекции и семеноводст:И 1 астен способ п; ней для поддерч::анил. вкл юч п ЮМ-; и и ч с; ре и ь,: viKo и п-тадку 1- Орен. питотгльную с.р- ау. с зос;нм; 0 ;с.- уГ)нг.

I IО ДО С Т Л КС Э-|0 бОЛ I- .i 0 3 П U И С и М ОС ; получ:ч:;1ч мик, .:;;iyfl Ccifiiuc ей. , сопт. зог;; и:1.и этого c,i:, ,пся к сельскохозяй- 1. з именно к спосо ч изолированных

еним и мохе т Быть г;нечи,и работ по се- у сортов картофеле, лучения М1 чрокл fi- коллекции сортов,

зан1-е растений in p. iij гяризо.1.чн:-:ую т.оГктвующуо с5гп: способа н-.яется ; pe.v.-nt.TaTnnHoj.Tn ей СТ СО| тО-:ы: ОСО- гр.)зц %в . и г пол ь- ( не (Чфлзуют

клубней. Нередко наблюдаются тг.ие нежг- лательныс признаки, как отсутствие укоренения и ycbiXc iHv.e растения, начинающееся с верхушки. Отмеченное недостатки существенно снижают надежность, и технологичность способа и об/слиьлены TCNHI обстоятег.ьстплми что как для нзращивг.нл.ч вегетативной . так и для клубнеобра- зования используется одна и та же пигп- тельна среда, не обоспе-чипающая в достаточной мере потребности растительного с оьекто на н ращчпамия вегегпцмонной массы (ипбыточное с- магическое .п,пг.лг:ние, излишне высокое содео- x- .aHt .e сахарозы и цитскинпься., и на стгдии клу(11:еобр.)лг)на; ия (недостаточное осмспиVJ

О

IDs 4ь,

СО

о

ЧОСКГО/ :г я. С 1. Ли ;М Н ,;3 0-. СОЛ-Г л HilfJ г...-(Ч|); ) И Jil . rVV-Ml .HOr.).

Cyii;. .тг HH;.IM к ЯО ЛЗ г --SM ;и-/--.1СЯ

тз1-::; е то. по инэЧ Тмн й способ не снимает сортовую ;х;|- ;:- . иа продолжительность сьсте огс д-т К г: зр г.тате этого /.«ля кз;/.- до;о с of; TOO Г/; - : ;. -г .экспериментатор выну.де и специально подбирать Ь.(:-.лгогфИ тные параметры осмотпчзского долепи;: сре;;м. сахзрозм: ци- юиининоз, э т-:- ,- i продолжительное ясве- гсг;ого и темносого г fpne, ;. t.

Известен cneT . lj получения микроклубней о культуре in viiro, включающий черен- коблиие и рысал1:, растений в кслбы с питательной среде.. благоприятной наращивания вектзтионой масс ,., кулыиви- ровэние указанных колб на специальных шей срэх, обеспечивающих орбитальное качание питательной среды и освещений светом с интенсивностью 1.0 тыс. лк с последующей индукцией клубнеобразозания путем корректирования состава питзтеяь- :ой среды. Зг11слючающегося в увеличении содеожаж .я цитокининов до 5.0-5,5 мг/л, содержания сахарозы до 80000 мг/л и дггнии хпорхолинхлоридз в дозе 0.5 г/л.

Недостатком указанного способа является необходимость использования дорогостоящего оборудования, обесиечипающаго орбитальный режим качания. Существенным недостатком способа является низкое качество клубней, проявляющееся в том.что они имеют различные и. в подавляющем большинстве, недостаточные размеры, паз- росшкеся чечевички. Особо следует подчеркнуть в качестве недостатка способа тс обстоятельств, что в процессе выращивания микроклубней используются недопустимо высокие дозы синтетических цитокининов ( + бенэилэминопу- рик) - 5.0-5.5 MI /л), тогда, как известно, что превышение содержания о питательной среде синтетических цитокининов выше 1,1 мг/л вызывает стпп-.сти ;ески достоверное посышен е частоты хромосомных абарра- ций и, следовательно ведет к необратимой потере генетической идентичности сорто- сбразца.

Цель изобретения - упрощение способа и улучшение качества микроклубней.

Постатейная цель достигается тем, что исходный материал о виде сегменюп стебля с почкой (черенков) - рас. -цельный объект - культивируют 3--4 нсд. в культиоационных сосудах на «лдкой гг/та.ельной среде, обес- печисающеП благоприятные.условия для укоренения рзститсг:ных объектов и нарастания вегетационной массы, а для предотвращения гибеличйренкопот затопления их

куя:,7.:г, на nouopxiiOCTH п.; ./1ЫЮГО ;К/ УДЫИ1а, В Ы110/: И СI НО О. НаНр: 1Сф. ИЗ

пан,, .инкм H jcKiix или сстостаеьмых оо- локон, филыpu j льно; 1 пли хроматогра- Фимсской бумаги. Растительные оОьск:м культивируют при температуре 22±2° С и интенсивности освещения в прздсллл 5,0- 8,0 тыс. лк, причем питательная среда включает сзхзрозу н 10000-30000 мг/л. а такхе регуляторы роста - кинетин 0.01 -0,1 мг/л. феруловую кислоту 0,01-0,1 мг/л, индоли- луксусную кислоту 0,о--3,0 мг/л.

После развития достаточного количества пегетатиг.ной массы, т. е. через 3-4 нед. культивирования после черенкования.питательную среду корректируют посредством, воеденш концентрированных добавок таким обоазом, чтобы донести содерх нис: сахарозы в питательной среде до 60000- 100000 г.-.г/л, цитокининов (кинетHIi илибен.-и- ламинопурин) до 0,3-0.5 мг/л, препарата ТУР до 200-500 мг/л и аденина до 5.0-40,0 мг/л.

С целью усиления индукции клубпесб- рс;зовэния культивационные сосул с мате- риалом пог-:ещают о темноту или на слабый рассеянный свет- (0,1-0,5 тыс. люкс)на 2-3 мед., после чего в случае необходимости образовавшиеся микроклубни доращивают и озеленяют при указанных ранее условиях. Питательная среда для укоренения черенков и наращивания вегетационной массы включает следующие компоненты, мг/л: Аммоний азотнокислый 1650 Кальций хлористый двухводный 440 Калий фосфорнокислый

однозамещенный170 Борная кислота 6.2 Марганец сернокислый четырехводмий 22,3 Калий подпетый 0 83 Натрий молибденопокислый. ДБухсодный 0.25 Мезо-инозит 100 Никотинамид 2,0 Тиамин 1.0 Фолиевая кислота 0.5 Калий азотнокислый 1300 Магний сернокислый семиводный 370 Трилон Б 37,3 Железо сернокислое семиосдное 27,8 Цинк сернокислый четырехиодный 8.6 Медь сернокислая пятиводная 0.025 Кобальт хлористый шестиводный 0.025 Пиридоксин 1,0 Кальции пактогеиат 10,0 Глицин 3,0 Рибофлавин 0.5 Цианкобаламид 0,015

. kHVTHHТ.О

Tst O: COC :- ПИГЬ.М :ГМ Дг Г. м; Кспмапько; c. f rxjHii сопть-; . - ни5;м растит o;:b ,i;.X uuv- « Tori д. y.oponoivi , 1/.:ноч 1 1ГН Сти мог.лш.нязпия

fi Ji C : : 1-L:-ifHi . С LI При iO-.l Or НИ. ЖПЙ ypT... V .) :,-:1-11 p..; I . / т I nr KHH /MOR (С КН.Т.И- ЛёМИ . ООурНН. ST. eiMHj CHllf. ОТрПЦ;

тел ь .; дои :.; niie 3iQio регуляторе; из

П ;Ог; -::С ytfO -::iv.: Ич И оОеСпечпВЗ :: уелро- Hcuv-ft ,a ; 4.biiL:x послецст&ий апикального дом и i и DO к a и и я. /; и дол илу к су с и а я кислота в указанно концентрациях эффективно индуцирует укоренения черенков. Вместе с , от ri /; -. Tocii пысоксЛ .ио.поСТЬЮ, уже М ;ПОЗ 34 СуТ КуЛЫ ИВИрОВ-1НИЯ

матерка/:а не. слету она полностью разрушается и не оказывает отр-ицзтепьного влияния нэ р г-:;итие и луцирпсз-н ых корней, е отличие OY дг-йстпня более стабильной неф- тилуксусной кисло 1 ы. н.спольз..-.мой ь изое- стном способе Следует подчеркнуть, что розруиение н.:-;долилукс сной кислоты после ыполне ич e. ьозг. Функций (индукция уктрсчения) обеспечивает возможность достижения б ламсз ауксимос и

ЦИТОКИМИНГ;. бЛЙГОПрИЯЮ ЕуЮЩОГО 1 НДуКции клубнео5.пзс1;Эиин нч безопасном уровне зкзогенкк х цитокинино (0.3 O.G мг/л). Р. отличие от способа, избранного в качестве, прототипа, по которому такой Ьзпзнс достигается только при концептрячиг, экзогенных цитокпнпнов на уровне 5.0--5.5 мг/л.

Ферулсв я к . слота в указанных концентрациях выступает как синергист ауксинов (индол и луксус на я кислота) и благоприятствует ро 1:итп;о . мд,иироппн- ных корней.

Вс-.змо- чость осущ-5ствг,.;:г«пч корректировки сог. арэ питательной среды в процессе культивирования. достигаемая посредством использования гпгрс / ьнг с вклздыи а. позволяет обеспечить более интенсивную индукцию клубнеобразования. по сравнению со способом, избранным в качестве аналога, путем уаел-. чеииа осмотического дс- -ения питательной сродь1, повышения концентрации сахарозы, а такхе устранить сортог.ые различия по чувсг и- тельности к индукции клу5нео()разоЕ)ия благодаря виедомию праплрйто ТУР.

Пример 1. Опрсделч 1 оп имал1 ный состаг) ср-:;; дг Я уиореноння г.торильных и н(; Ji t .u лмия ;.огот цион -О1/1 массы этапа .-nui-.T.inii к- .убносГчразорэ- нич. О г. Hi.-.;1, с и, с. ни: лтел.Н ) С|:-:дп. , ;ц ,я . л о 1К Л:-| Mni::.:paf n.Mi.ic cv..n, шмпмпн -: п. i л..-1 ,.;н со ласно про, .-.си .l Снге и CKV.J (х, иш;; .i p;c ч.ч. и О, по с.оKi .r. K.ni.i И V.i ({. .О СН:/И Ч:Г. r.i. r i . f-V.f;л пестг, ср ..Л -i i;:)p.,ic,Cin;i/iH р пг. i,- рН r...C-:,.tv После Kv/.iH/n-u1. ;-г;.п .1 с т(ч;-н:. С ,т

.1 i Oiit МИГ.ОЛП Гк-i .: 1 . U - П-. З- - / HCpCI 1, . б.. :.171 Г.о.;,г:мо.;Н ,С - . ССПО- СоГ):;,:;,Тм 1)- П yK-jr: -: i lfi; i Ua ifji - - СЛЛОГ-0

y: orvc:rt чнс: 1 - cnrnoo p;-.- i- /-rno

надзо - г Ой масс,:; 9 Ciarnvn - ..iC -siicn раз- втие корнезой сис.томь: vi nt)fo.:tor- .(0u t .ac- сы.

Полученные данные прояхтаклечы а -,-збл. 1.

П р и м о р 2. Изучали г ежность метода, определяемую к а г отношение числа растений, образовавших клубни г. общему числу исходных зксплзмт.чтоп. п-,1,, аженную в процентах (табл. 1).

В качестве первого варг-анта опиП п пс- пользс:в ;лп способ, избранный н кзчослее аналога, второго - способ, избранный в ко- честго прототипа, а трет;им п. спу- жил предлагдемый способ.

Полученные дг.нныо сридетольстиуют о том, 1-.то npe/v iy способ обоспг чмност РЫСОКИЙ :тыход растений, обр зопашш .х микрокл /Оми, : этот показатель меньше зависит от сортовых особенностей раститсльного объекта.

При м G р 3. Изучали пр яопхнтопь- ность период;, необходимою длм г,ч,;:.м;,ро- ваниг; ми к ро к л у бнб:й . как одного из .,. |Лг показателей вг ппк цих нп г /.оиомп чость и тсхноло ичност - способа. Ва- рнанть г зк в .;,(.: 1,

Из данных, табл. .) видно, что предлагаемый способ сяго;;но отличается от . из местных 6or,te коротким Г1 :риодам.

необходимым для формирован/я микро- клубчой.

П р и r-1 e р 4. Определяли оптимальную интенсивности освеи;ения д/.п наращис-.- ния максимальной вегетативной массы.

Из табл. 4 видно, что максимальное развитие растений мохсно достичь при обеспечении интенсивности ОСР.С ЩОНИЙ на уропне Б- 8 . лк. Более низкая освещенность не обеспечивает мл;-.симольиого раг-,:5И1ия Rfiгетстд .юниой массы, а следопатслкно. не позволяет получать достаточно крупных микрокпубнсй.

П р и м е р 5. Определяли оптимальный состав питательной сроды для индукции

клу омообрззо-.-аниг культуре in ч-И о Все .yni-: :. ;.тол и систпетг. знп с предлагаемым способом. Ь рппмтм оп:. та различались по KOi l f. ip:, ч :м;;арОГ- |. к и нет и и а, пдоппмп t: лрг.п. ТУР. ,-пЧе. ОН1..1., 1 |Г.СЛСДОГ;Л 11 - С V /,ЛИ flpOбирочные рэстония картофеля сорта Резерв. Результаты опыта оценивали по выходу полноц нны.х микро луГ ней через 50 сут поело процедуры индукции клубнеобрззо- вания (гибл. 5).

Следовательно, с целью выполнения процедуры индукции клубнсоброзовония необходимо скорректировать состав питательной среды таким образом, чтобы довести содержание сахарозы до 60000-100000 иг/л, цитокининов. например кинетина до 0,3-0,5 мг/л, адеиина до 5-40 мг/л; препарата ТУР до 200-5У) мг/л.

Пример 6. Изучали роль гигрофильного вклгдыша и жидкой питательной среды на эффективность осуществления способа. Опытный вариант выполняли в соответствие с предлагаемым способом. Контрольный вариант отличался от опытного TCP-., что сместо гигрофильного вкладыша и жидкой питательной среды для наращивания массы использовали агаризованную питательную среду. В качестве объекта исследования использовали растения картофеля сорта Гатчинский.

В опытном варианте образовались более крупные клубни, причем после инициации клубнеобразовэния в этом варианте, в отличие от контрольного, все растения сохраняли жизнеспособность.

Пример 7. Изучзли пригодность микроклубней, полученных по предлагаемому способу, для идентификациисортообраз- цов по изоэлектрофоретическим спектрам белков. Изозлектрофоретические спектры белков, выделенных из микроклубней, выращенных по предлагаемому способу, отличаются ярко выраженной дискретностью белковых полос. Следовательно, получение клубней по предлагаемому способу полностью удовлетворяет требованиям метода идентификации сортообразцов по изоэлектрофоретическим спектрам тотальных белков.

Использование гигрофильного оклады- ша, таким образом, предотвращает гибель растительного материала от затопления и обеспечивает возможность корректировки

сосгяиа питательной среды в процессе куль тиьировэния. Благодаря этому достигается более интенсивная индукция клубнеоб.оззо- пания, улучшается накоплении яссимиляционных продуктов, определяющее размер и качество микроклубней. Устранение потребности в дефицитном агаре, необходимом для получения клубней по способу избранному в качестве аналога, а также в

дефицитном импортном оборудовании для орбитального качания шейкерной культуры (по способу, избранному в качестве прототип,-; позволяет достичь высокого экономического эффекта.

П р и м е р 8. Определяли затраты материальных ресурсов на получение микроклубней с целью использования последних для идентификации генотипоа. Варианты как в примерах 2-3.

Формула изобретения Способ получения микрокл 5нейчкарш- феля, включающий эксплантацию растительного материала на модифицированную

питательную среду Мурасиге-Скуга, укоренение и наращивание вегетативной массы, перенос на питательную среду для клубнь- образованил и выращивание микроклубней, отличающийся тем. что. с целью

упрощения способа и улучшения качества микроклубней, укоренение и наращивание вегетативной массы проводят в течение 3-4 недель на поверхности гигроскопичного вкладыша при интенсивности освещения

5.0-3,0 яке добавлением в питательную среду 10000-30000 мг/л сахарозы. 0.01-0.1 мг/л кинетинз, 0.01-0.1 мг/л феруловой кислоты. 0,5-3,0 мг/л индолилуксусной кислоты и выращивайте микроклубней

осуществляют ча питательной среде в присутгтвии 60000-100000 мг/л сахарозы, 0.30.5 мг/л экзогенных цитокининов, 200-FOO

мг/л хлорхолинхлорида. при этом культивационные сосуды помещают на 2-3 недели в

темноту или на слабый рассеянный свет и образовавшиеся микроклубни доращивают и озеленяют при прежних условиях освещения.

Таблица

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии, з именно к способам культмонропания изолироваимь х тканей и органов растений, i . можо Оьм ь использовано мри ьыполнеи /.и по селекции и семеноводству сортов картофеля. Цель изобретения - упрощение способа и улучшение качества микрокл бней. Способ состоит в том, что исходный материал в вида СИГГ/CHTOQ стебпя с почвой культивируют п культиаацпонных сосуд&х нэ жидкой питательной среде, культивируют на поверхности гигрофильного вкладыша на питательной среде при освещенности Е.0 8,0 тыс. лк, а 3-4 нсдгл -. питательную среду корректируют, увеличивав количество сахарозы, цитокининоо и пр.опррата тур, после чего сосудь; псмещпют г темно;/ но 2-3 недели для образования мпгроклубчей.

Д юддлжительиость периода получения микроклуб чей сут юз- НевскийЛорх Полесский j Энергия ГиЬрид474

ппчпнми

Способ

Шомодедоз-------------ь -- -Л

Известный

1

2

Предлагав мы и

3

. I с кий

77

80

62

78

77

62

89

80

78

розовый

73

88

66

80

80

60

71

88

60

Таблица2

Т а б л v ц s 3

лучения м олесский

ппчпнми

розовый

73

88

66

80

80

60

71

88

60

I

Интенсивность освещении

2,5

11,0

Т а 0 л и ц а 4

Масса стебля

JL.I1 51 ь ям YL. Jblr IfiO 104 218 280 230

ТаблицаБ

Таблицаб

Спос-и

ИзгСПТНМЙ

1

2

ПрйЛ. гэС м;;1й

3

Т а 0 л и ц о 7