Способ аэробной и анаэробной ферментации Советский патент 1992 года по МПК C12N1/00 C12N11/00 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к псоизеодстеэм з энолэ, фуранкарбоновой кислоты, антибиотиков, биомассы дрожжей, ферментов и других продуктов трансформации органических субстратов иммобилизованными клетками микроорганизмов.

Использование иммобилизованных клеток е аэробной и анаэробной ферментации позволяет более эффективно использовать каталитические свойства микроорганизмов: появляется возможность создания непрерывно действующих стабильных процессов без затрат на получение и выделение биомассы.

Известен способ анаэробной ферментации с использованием иммобилизованных дрожжевых клеток для получения этанола. В этом способе клетки Saccharomyces

cerevisiae включают в фотосшиваемые смолы, поляризация которых происходит под действием света 300 - 400 нм. Гелевые пластинки толщиной 0,8 - 1.0 мм укладывают вертикально в реактор непрерывного действия. В качестве субстрата подают разбавленную тростниковую мелассу.В установке, оборудованной таким образом, выход спирта составляет 600 л/день. 1.

Однако продуктивность реактора постепенно снижается из-за накопления в нем осадка мелассы, который необходимо периодически удалять.

Известен также способ анаэробной ферментации для получения этанола с использованием дрожжевых клеток, иммобилизованных в пектине. Для иммобилизации клеток S. serevisiae CM-1-20 равные объемы пектина и дрожжевой суспензии вводят D

С

V

с

V

с

смесь 0.2 М Мэ2Вл07. Концентрации дрожжей в пектине и в исходной суспензии обычно равны 70 г/л сухой массы и 2 - 6 об.% массы соответственно. При сбраживании глюкозы иммобилизованными на твердом носителе клетками максимальный выход этанола составляет 0,43 г/л глюкозы, а продуктивность 12 кг/м3 ч 2.

Недостатками способов аэробной и анаэробной ферментации, включающих инкубацию субстратов с иммобилизованными на твердых носителях клетками, являются снижение активности клеток биомассы при закреплении на носителе из-за затрудненного доступа субстрата и кислорода при аэробных процессах и недостаточной вентиляции при анаэробных процессах, необходимость регенерации носителя, загрязнение носителя осадками субстрата и необходимость удаления осадков; неконтролируемость количества биомассы на матрице и ограниченная скорость потока через носитель, а также необходимость специального оборудования для накопления биомассы продуцента, приготовления носителя и ферментации.

Целью изобретения является увеличение выхода продукта и упрощение способа.

Указанная цель достигается тем, что согласно способу аэробной и анаэробной фер- м е н т а ц и и. включающему инкубацию cv6cTp3TQBC иммобилизованными клетками и последующее отделение продуктов реакции, используют клетки, обладающие фло- тирующей способностью, а их иммобилизацию осуществляют путем закрепления клеток нэ межфазной поверхности газ - жидкость при удельных затратах мощности 0.5 - 3 кВт.м ч. при этом для иммобилизации при проведении аэробной ферментации используют барботаж воздухом, а при проведении анаэробной - барботаж рециркулируемым в ферментаторе газом.

Способность клеток адсорбироваться нэ поверхности раздела фаз газ - жидкость известна и используется при выделении клеток из культуральной жидкости методом флотации. Флотир , ющей способностью обладают дрожжс-подобные грибы рода Candida, Trlchosporon, Hansenula. Kluyveromyces.

Asperg .Hus.

тет;ии Bacillus subtllls, базидальные грибы Trichoderma nitornlum и другие. Эта способность микроорганизмов используется для их иммобилизации на поверхности фаз газ - жидкость.

В предлагаемом способе клетки закреплены на поверхности раздела фаз в пленках жидкости, окружающих пузырьки, и не обладают способностью свободно передвигаться в основном объеме жидкости. Об этом свидетельствует полное отсутствие клеток в жидкости, выводимой из аппарата, несмотря на их значительную концентрацию в объеме реактора (12-40 г/л абсолютно сухой биомассы) и высокие скорости протока среды (D - 1-2 ).

Среди известных способов аэробной и анаэробной ферментации, включающих ии0 кубацию субстратов с иммобилизованными клетками и последующее отделение продуктов реакции, не обнаружено признаков, сходных с отличительными признаками предлагаемого изобретения.

5 В отличие от способа аэробной и анаэробной ферментации с использованием традиционной иммобилизации на твердых носителях, где поверхность раздела фаз фиксируют, создание поверхности раздела

0 фаз в системе газ - жидкость требует введения энергии на диспергирование газа, так как такая двухфазная система обладает только динамической устойчивостью и в отсутствии подвода энергии на перемешива5 ние расслаивается с образованием газовой и жидкой фаз. Для создания и поддержания раздела фаз в зависимости от пенообразую- щей способности раствора требуется различный вклад мощности на перемешивание.

0 Увеличение выхода продукта в предлагаемом способе аэробной и анаэробной ферментации обусповлечс повышением эк- гиг:ности продуцента по сравнению со способом, где используют иммобилизацию нэ

5 твердых носителях, так как в предлагаемом способе субстрат, кислород и другие компоненты среды абсолютно доступны клетке и последняя не ингибируется химическими соединениями, применение которых неиз0 бежно при формировании твердых носителей. Поверхность раздела фаз газ - жидкость не загрязняется осадками субстратов и способствует активному массооб- мену газов.

5 Для накопления биомассы продуце.н- тов, проведения процесса иммобилизации и получения продуктов не требуется специального оборудования, а все три процесса протекают в одном ферментаторе. Унифика0 ция оборудования, а также снижение затрат на приготовление носителя достигается тем, что для аэробных и анаэробных процессов требуется один ферментатор, с той лишь разницей, что при проведении аэробных

5 процессов используется воздух, а анаэробных - С02. любой инертный газ Все указанное приводит к упрощению предлагаемого способа.

Иммобилизованные клетки микроорга: низмов на поверхности раздела фаз газ жидкость используют Б аэробном процессе ЬиотрансФормации фурфурола (Ф) в фуран- г-кэрбоновую. кислоту (ГФКК), в аэробном процессе очистки сточных вод и анаэробном процессе сбрэживания Сахаров на спирт.

Ферментацию проводят с различными видами микроорганизмов из музея ВНИИ- гидролиз в ферментаторе емкостью 3 л при определенном вкладе мощности на создание межфазной поверхности газ - жидкость, снабженном мешалкой, системами подачи воздуха, те; остатирования подачи субстрата и отбора ультурэлъной жидкости через зону, лишенную подвода энергии перемешивания.

Зона, лишенная подвода энергии, создается искусственно, в виде кармана или ложного дна ферментэтора. В этой зоне происходит расслоение на газовую и жид- к/ю фазы. Микроорганизмы, закрепленные на поверхности пузыг -OB. всплывают в активную зону фермеь. ора.а культуральная жидкость, свободная от клеток и содержащая целевой продукт, выводится из зоны, лишенной энергии.

В фэрментатор непрерывно подают пи- тательные среды газ. поддерживают температуру и рН. Одновременно с подачей питательней ществляют непрерывный СТбОр KV oTy;: .ЗЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ ИЗ

зоны, лишенной подвида энергии. Удержание биомассы в Ферментаторе осуществляют за счет им м о б и лvза ц ии клеток на поверхности раздела фЈ- газ жидкость. В культуральной жидкс-ти определяют концентрации продуктов методом ж.идкостной хроматографии, спектрофотометрически, химически.

Осуществляя способ аэробной и анаэробной ферментации с использованием клеток, обладающих флотирующей способностью, иммобилизованных на межфазной поверхности газ - жидкость, накопление биомассы продуцента и биотрансформацию фурфурола иммобилизованными клетками проводят в одном ферментаторе.

Пример 1. Дрожжи Candida tropicalls 649(У-699) вносят в ферментатор с питательной средой, а активную зону которого непрерывно подают воздух и осуществляют активное перемешивание среды с помощью мешалки (М 500 мин ) для создания межфазной поверхности газ - жидкость. Вклад мощности на перемешивание 1.2 кВт/м поверхности, на которой удерживаются клетки дрожжей. При достижении концентрации биомассы в ферментэторе 12 г/л вместо питательной среды начинают подачу раствора Ф с концентрацией 1.5%. Из зоны ферментатора, лишенной подс-одл энергии, отбирают культуральную жидкость без биомассы продуцента, в которой Ф окислен до ГФКК. Процесс биотрэнсфсрмэции Ф протекает

5 при 37°С и рН 6,0. Скорость подами раствора составляет D 0,2 ч .

Выход целевого продукта - ГФКК составляет 95%. Процесс трэнсформэции осу- ществляют непрерывно в течение 120 «,

0 концентрация биомассы в ферментаторе составляет 12 г/л, а в культуральной жидкости -0,12 г/л.

Пример 2. Накопление и иммобилизацию продуцента ФКК дрожжей Hansennla

5 anomala Кир-5(У-251) и трансформацию Ф в ГФКК осуществляют по методике примера 1. Выход ГФКК 94,3%. Унос клеток продуцента с культуральной жидкостью составляет 0,12 г/л сухой биомассы, концентрация

0 иммобилизованных дрожжей в ферментаторе 11.8 г/л.

Пример 3. Накопление и иммобилизацию продуцента ФКК дрожжей Candida melinii Георг-1(70) (штамм не депонирован)

5 осуществляют по методике примера 1. Выход целевого продукта 88%. Унос клеток продуцента с культуральной жидкостью 0,20 - 0,30 г/л, концентрация иммобилизованных дрожжей 11 г/л.

0 П р и м е р 4. Накопление и иммобили- зацию продуцента ФКК Candida gulllermondll Лу-2 (У-248) и бистрэнсфсрмэ- цию Ф в ФКК осуществляют.по методике примера 1. Выход целевого продукта 90.0% .

5 Унос клеток продуцента с культуральнсй жидкостью 0,23 г/л сухой биомассы, концентрация иммобилизованных дрожжей 12 г/л.

Пример 5. Анаэробную ферментацию

0 сбраживаемых Сахаров гидролиззта древесины проводят при помощи иммобилизованных в пене на межфазной поверхности газ - жидкость клеток дрожжей С. troplcalis 649 (У-696). Межфазную поверхность созда5 ют в ферментаторе с мешалкой пои удельных затратах мощности 0,5 кВт/м .

В аппарат, снабженный мешалкой с отношениемс

dannapaia 0Ймешалки

и числом оборотов п 125 , а также системами подачи воздуха и рециркуляции газа, заливают 1 л питательного субстрата - гидролизата древесины, содержащего 6,9 5 г/л гексоз и 2,3 г/л пентоз.

В посевную среду, содержащую 420 мг/л азота и 70 мг/л P20s, вносят дрожжевые клетки С. tropicalis 649(У-696). Иммобилизация клеток происходит одновременно с

и накоплением в аэробной стадии на меж- { . i и о й пояорхности газ жидкость, создя- р, за счет подачи воздуха со скоростью 1 л/с и работы мешалки (п мин ). концентрация составляет 12.5 г/л сухих ДГ;О.жей.

При переходе на анаэробный процесс сбражиеания гидролизата вместо подачи воздуха наминают рециркуляцию углекислого газа, образующего при сбраживэнии гидролизата. Сбраживание Сахаров гидролизата на спирт происходит при 32°С, рН 4,0, подаче субстрата со скоростью D 1.0 ч .

Выход этанола составляет 0.46 г/г от сброженных редуцирующих веществ (РВ) гидролизатз

Концентрация биомассы в культурэль- ной жидкости, отбираемой из зоны, лишенной подвода энергии, составляет 0,1 - 0.25 г/л.

Пример 6. По методике примера 5 получают этанол при помощи иммобилизованных на межфазной поверхности газ - жидкость клеток Kluyveromyces marxianus WC. При вкладе мощности на создание меж- фазной поверхности газ - жидкость 1,5 кВт/м выход спирта составляет 0.42 г/г. концентрация биомассы в культуральной жидкости составляет 0,5 г/л.

Пример 7 По методике примера 5 поучают этанол при помощи иммобилизованных на межфэзной поверхности газ - жидкость ето С. tropical is ОН-2 (штамм не депонирован Пг. i вкладе мощности на создание межфазной поверхности газ - жидкость 1,5 кВт/м выход спирта составляет О 36 г/г, а концентрация биомассы в культура льне и жидкости составляет 0.1 -0,18 г/л.

В табл. 1 приведены результаты других анаэробных Ферментации гидролизата дрересины и мелассы иммобилизованными клетками

Пример 8. Очистку сточных вод гидролизного производства проводят путем аэробного культивирования Tr. cutaneum Лд-Ю(У491). Процесс проводят в лабораторном ферментэторе емкостью 5 л, число оборотов мешалки 400 мин . расход воздуха 2 л/ч. Вклад мощности на перемешивание 3,0 кВт/м3; рИ среды 5,5: t 36°С: скорость подачи сточной воды D 3.0 ч ;концентрация биомассы е ферментаторе 9.5 г/л сухой биомассы: концентрация загрязнений на входе по ХПК 6000 мг 02/л.

Очищенную сточную воду отбирают из зоны ферментатора. лишенной подвода энергии, в количестве 13.5 л/ч, концентрация биомассы в ней составляет 0,1 - 0,2 г/л сухой биомассы: ХПКост 2000 мг 02/л. Избыточную биомассу отбирают из верхней

части ферментатора с концентрацией 9.5 г/л с потеком жидкости 1.5 л/ч. Глубина очистки составляет 66 - 70% (по ХПК) Удельная окислительная мощность 12 г 0:/пч

ПримерЭ Очистку воды гидролизно- дрожжевсго производства производят ассоциацией культур микроорганизмов Aspergillus niger и penicUlium chrisogenum (не депонированы) по методике примера 8.

0 Концентрация загрязнений на входе по ХПК 6700 мг 02/л. Глубина очистки 75-78% (по ХПК), удельная окислительная мощность системы 9,2 02/л ч.

В табл. 2 приведены результаты других

5 аэробных ферментации сточной воды иммобилизованными клетками.

Как видно из приведенных примеров различных ферментации, биомасса микроорганизмов п результате закрепления на по0 верхности раздела фаз газ - жидкость имеет время пребыБЗния в объеме ферментатора значительно большее, чем время пребывания жидкости.

Так, в примерах 1 - 4 при биотрансфор5 мации Ф среднее время пребывания жидкости в ферментаторе составляет 5 ч пои времени трансформации более 120 ч

В пример. 5 - 8 при сбражгей-ши с.д- харосодержащих растворов в этанол рязни0 ца времени отбывания дрожжей 250 ч и жидкости (1 н) еще больше. Аналогичные данные получены и при очистке стсччь х вод: 0,3 и 250 ч соответственно (прг .-сры В и 9).

5Способ ферментации с исполt зо&анн м клеток, обладающих флотирующей способностью, иммобилизованных путем закрепления клеток на межфазной поверхности газ - жидкость может быть применен как

0 для аэробных процессов (примеры 1 - 4, 8 и 9), так и анаэробных (примеры 5 - 8) В зависимости от ис. ользуемого субстрата и по пенообразующей способности вклад мощности на перемешивание, необходимой

5 для создания поверхности раздела фаз газ - жидкость и обеспечения массообмена кислорода, составляет от 0,5 кВт/м (для мелассы до 3 кВт/м (для сточных вод гидролизного производства) Процессы первичного накоп0 ления биомассы продуцентов во всех примерах и различные процессы с использованием иммобилизованных на поверхности раздела фаз газ - жидкость клеток проводят в одном и том же ферментаторе для аэробных и анаэ5 робных процессов.

В примерах 8-9 приведены ферментации с использованием флотирующихся микроорганизмов различных классов и родов, что указывает на широкую возможность применения предлагаемого способа для

получения продуктов метаболизма, биомассы и для очистки сточных вод.

Формула изобретения Способ аэробной и анаэробной ферментации, включающий инкубацию субстратов с иммобилизованными клетками и последующее отделение продуктов реакции, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода продукта и упрощения способа, используют клетки, обладающие

флотирующей способностью, а их иммобилизацию осуществляют путем закрепления клеток на межфазной поверхности газ - жидкость при удельных затратах мощности на создание межфазной поверхности 0,5 - 3.0 кВт/м3- ч, при этом для иммобилизации при проведении аэробной ферментации используют барботаж воздухом, а при проведении анаэробной - барботаж рециркули- руемым в ферментаторе газом.

Изобретение относится к микробиологической промышленности Цель изобретения - повышение активности продуцента, снижение затрат на приготовление носителя и унифицировэние оборудования. Цепь изобретения - увеличение выхода продукта и упрощение способа. Для этого закрепление клеток производят е пене на межфазной поверхности газ - жидкость при удельных затратах мощности на создание межфэзной поверхности от 0,5 до 3.0 кВт/м3 ч. При этом для проведения аэробной ферментации используют бзрботаж воздухом, а анаэробной - бароотзж рецирку.лируемым в фермента- торе газом. 2 тэбл.

Таблм ц а I

Таблида2