Способ получения @ -лизина Советский патент 1985 года по МПК C12P13/08 

1 Изобретение относится к микробиологической промьшшенности и может быть использовано для управления процессом получения лизинд. Известен способ управления процес сом биосинтеза Ь- лизина, при котором рН среды поддерживают в заданных пределах в зависимости от концентрации аниоио-органической кислоты, например уксусной, рН среды регулируют вводом в нее углекислого газа или бикарбоната натрия flj . Наиболее близким из известных способов к изобретению является спо соб получения лизина, заключающимися в том, что получают L-лизин путем культивирования его продуцентов на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, и необходимые питательные соли при аэрации среды ;первмешивании и поддержании заданного значения рН с последующим выделением лизина 2 , При регулировании процесса в ста дии образования биомассы в фермента торе условия близки к полному перемешиванию и регулирование по рОд при концентрации кислорода 30 - 40% насыщения обеспечивает достаточно точное регулирование по всему аппарату, но в стадии биосинтеза при насыщении кислородом 5 - в аппарате уже не обеспечиваются услови полного перемешивания и нельзя однозначно установить значения по всему объему, что является недойтат ком этого способа. Недостаток кислорода, в клетках переключают метатолизы углеводов от аэробного процесса на анаэробный. В результате этого под действием лактатдегидрогеназы образуется молочная кислота. Таким образом метаболиты углеводов не включаются в цепь синтеза лизина, а используются на обра зование побочных метаболитов, напри мер молочной кислоты. Целью изобретения является повышение точности управления процессом получения лизина, а также увеличени выхода целевого продукта. Поставленная цель достигается тем что по предложенному способу в процессе ферментации, начиная с 16 по 30 час в кзльтуральной жидкости определяют концентрацию молочной кисло ты или активность лактатдегидрогеназы, в клетках продуцента при этом 4 При определении концентрации молочной кислоты в культуральной жидкости и достижении ее 0,3 - 0,5 мас.% ийи при определении активности лактатдегидрогеназы и достижении ее 10 30 уд, ед. доводят рН культуральной жидкости до заданного значения путем регулирования количества подава-. емого воздуха и перемешивания. Способ осуществляют следующим образом. В качестве продуцента L-лизина используют микроорганизмы Brevabacteriura или Micrococcus. После выраш 1вания культуры в посевном ферментаторе дальнейшее культивирование проводят в производственных ферментаторах на углеводной питательной среде, например мелассной. При ферментации во время роста продуцента pOg поддерживают на уровне 20 - . насыщения. Начиная с 16 ч определяют концентрацию молочной кислоты в культуральной жидкости или активность лактатдегидрогёназы в клетках продуцента. При достижении концентрации молочной кислоты 0,3 - 0,5 мас.% или активности лактатдегидрогёназы 10 - 30 уд. ед., в результате чего снижается значение рН, повышают интенсивность аэрации и перемешивание до достижения рН 7,4 - 8,0. На 30 - 36 часу при резком снижении рН его поддерживают добавлением аммиачной воды или мочевиной с таким расчетом, чтобы концентрация азота не превышала 0,2 - 0,4 мас.%. После окончания культивирования из культуральной жидкости выделяют Lлизин известными методами или получают кормовой концентрат лизина. Пример 1. Исходную культуру Brevibacterium sp 22 ЛД размножают вначале на агаровых косяках, затем в колбах на качалке и в посевном ферментаторе. Затем посевной материал передавливают в производственный ферментатор емкостью 5000 л со стерильной средой 32000 л. Питательная среда имеет следующий состав: 6500 кг (при соМелассадержании сахара 46 мас.%) Кукурузный 1040 кг (при соэкстрактдержании 50% сух.вв.) Аммоний хло700 кг ристый Аммоний фосфорнокислыйдвухэамещенныйДо 32000 л Вода Ферментацрпо проводят при 31 + i , в стадии роста рН среды поддерживается в пределах 6,8 - 7,8 рО - на уровне 22% насыщения. На 16 часу культивирования определяют активность лактатдегидрогеназы в клетках продуцента. Активность 22 уд. единиц, рН снижалась до 7,0, Увеличивают расход воздуха на 5%, рН устанавливается 7,6 и не меняется, через 3 часа культивирования опять определяют активность лактатдегидрогеназы - активность 6 уд, ед. Объем воздуха остается прежним. В дальнейшем активность лактатдегидрогеназы определяют через каждые 3 ч культивирования. При увеличении активности лактатдегидрогеназы увеличивают расход воздуха или интенсивность перемешивания, поддер живая рН на уровне 7,4 - 8,0 и рО на уровне 20 - 25% насыщения,. Начиная с 36 часа культивирования рН среды поддерживают добавлением амми ачной воды. Во время ферментации при достиже нии величины РВ 5% добавляют стерил ную массу в расчете 2 масо% по РВ и продолжают ферментацию до полного использования редуцирующих веществ. . На 54 часу ферментации культурал ная жидкость содержит L-лизина 39 г/ биомассы продуцента Ь-лизина - 20 г/ концентрация сухих веществ в культу ральной жидкости 14,6 масЛ, остаточные сахара - 0,75%, молочная кис лота - 0,2%. После окончания фермен тации культуральная жидкость обраба тывается одним из известных способо Пример2. В качестве продуцента L-лизина используют микроорганизмы Micrococcus glutamicus Т-3, Культивирование ведут на среде, аналогичной примеру 2. В качестве стимуляторов роста используют гид ролизат белково-витаминного концент рата. Активность лактатдегидрогеназы определяют начиная с 16 часа культивирования. При превышении активности 10 уд, ед. и снижении рН до 44 7,0 увеличивают число оборотов мешалки или расход аэрирующего воздуха да достижения рН 7,4 - 7,8 м парциального давления кислорода 25% насыщения. После 30 - 36 часа ферментации рН поддерживают аммиачной водой. На 54 часу ферментации культуральная жидкость содержит L-лизина 38 г/л, биомассы продуцента L-лизина 19 г/л, концентрация сухих веществ в культуральной жидкости 15,0 мас.%, остаточные сахара 0,6 мас.%, молочная кислота 0,3%. П р и м « р 3. В качестве продуцента используют культуру Brevibacterium 22. Ферментацию осуществляют в ферментаторе емкостью 15 л на среде следующего состава: 1,52 кг (при соМелассадержании сахара 46 мас.%}, Кукурузный 0,25 кг (при экстракт сод. 50% вес. сух. в-в) Сульфат аммонияФосфат аммония двузамещенныйКарбонат кальция Подсолнечное масло На 4,6 л среды вносят 0,4 л посевного материала, т.е. 8% объемных с содержанием биомассы 18 г/л. Содержание РВ в начале ферментации 12 мас.%, рН - 6,8, температура + 31° + 1°С. Во время роста продуцента рО поддерживают на уровне 10% насыщения. На 8 часу рН увеличивается до величины 7j8 и поддерживают на этом уровне до 20 час аэрацией и перемешиванием. После достижения концентрации РВ в культуральной жидкости 5% производят периодическое добавление источника углерода (мелассы, уксусной кислоты, сахарозы, спирта, двойной соли гл козы). В начале ферментации аэрация 0,8 : : 1 объем воздуха /объем культуральной жидкости, обороты мешалки 400 об/мин, расход воздуха и интенсивность перемешивания постепенно увеличивают до 1 : 1 и 800 об/мин к 8 часу ферментации, рОг поддерживают на уровне 20 - 25% насыщения. Регулярно каждые ,3 ч определяют концентрацию молочной кислоты и по ней судят об активности лактатдегидрогеназы. При достижении концентрации молочной кислоты в среде 0,4 масД, что соответствует увеличению активности лактатдегидрогеназы в клетках 16 уд. ед. увеличивают интенсивность аэрации и перемешивания. При продолжении ферментации, в частности, после добавления источника углерода, pOj снижается до 3 - 5% насыщения, рН уменьшается до 7,0, активность лактатдегидрогеназы увеличивается до 50 уд, еДс и активность биосинтеза L-лизина падает от 0,09 г/л ч до О505 г/л/ч на 1 г биомассы. При этом увеличивают аэрацию до 1,2 s ; 15 активность лактатдегидрогеназы уменьшается до 6 уд. ед, и актив- ность биосинтеза увеличивается до г/л/ч на 1 г биомассы. 46 После 30 часа ферментации рН поддерживают 30%-ным раствором мочевины, которая одновременно служит источником азота. Во время ферментации определяют содержание азота, содержание которого не должно превьшать 0,2 О,4 мае.%. К 60 часу ферментации культуральная жидкость содержит L-лизин 56 г/л, биомассы продуцента 24 г/л, концентрация сухих веществ 18 мас.%, остаточные сахара - 0,9 мас.%, молочная кислота -0,1%. . Предлагае1 1ый способ позволяет увеличить выход L-лизина на 30% за счет снижения количества побочных продуктов метаболизма и сократить общее время ферментации на 10 - 16 ч. При использовании способа повысился экономический коэффициент биосинтеза L-лизина.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ЛИЗИНА путем культивирования его продуцентов не питательной среде, содержащей источники углерода, азота и не- . обходимые питательные соли, при аэрации среды, перемешивании и поддержании заданного значения рН с последующим выделением L-лизина, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода L-лизина, в процессе ферментации, начиная с 16 по 30 час культуральной жидкости определяют концентрацию молочной кислоты или активность лактатдегидроге- назы, при этом при определении концентрации молочной кислоты в культу- ральной жидкости и достижении ее 0,3 - 0,5 мас.% или при определении активности дактатдегидрогеназы и достижении ее 10-30 уд. ед. доводят рН культуральной жидкости до заданного значения путем регулирования количества подаваемого воздуха и перемешивания.S(Лff>&05 9Stэо*sj4^