Способ отбора растительных форм, устойчивых к насекомым вредителям Советский патент 1992 года по МПК A01H1/04 C12N15/01 

Изобретение относится к сельскому хозяйству и может быть использовано для отбора растительных форм, устойчивых к насекомым-вредителям, при селекции.

Известны способы селекции растений, обладающих устойчивостью к насекомым- вредителям, обусловленной измененным составом фитостеринов, которые основаны на использовании суспензионных культур In vitro. Селекция заключается в отборе на уровне единичных клеток, что сопровождается низкой выживаемостью растительных клеток, в том числе и мутантных, и приводит к резкому снижению вероятности отбора клеток с нужными свойствами.

Известен способ селекции растений при получении клеточных линий табака, имеющих измененный количественный состав фитостеринов. ТВ известном способе в

качестве селективного агента среды применены полиеновые антибиотики нистанин и амфотерицин В. Клеточные линии получают с использованием суспензионных культур.

Недостатком известного способа является большая потеря мутантов в силу специфики роста растительных клеток In vitro, a также возможная утрата ими морфогенети- ческих потенций, что исключает получение растений-регенерантов. Это приводит к длительным срокам селекции с нужными свойствами устойчивости.

Целью изобретения является увеличение количества мутантных клеточных линий, сохраняющих способность к морфогенезу, и скорости их получения.

Поставленная цель достигается тем, что в известном способе отбора растительных форм, устойчивых к насекомым-вредителям,

4 О

СЬ

предусматривающим культивирование растительных клеток на среде, содержащей нистатин, выделение жизнеспособных клонов, получение регенерантов растений с последующим анализом состава стеринов в растениях, в соответствии с предлагаемым изобретением, в качестве культуры растительных клеток используют культуру микрокаллусов растений, а содержание нистатина в среде устанавливают не ниже сублетальной дозы для данной культуры.

Цель достигается также тем, что жизнеспособные клоны дополнительно обрабаты- вают ультрафиолетовым светом с мощностью светового потока 2 Дж/м2 с экспозицией 4-6 мин.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в следующем. Каллусная ткань, полученная in vitro из частей проростков, по набору запасных веществ, составу фитосте- ринов и другим свойствам соответствует целому растению и в качестве единственного источника питания может обеспечить нормальное развитие насекомого. Используя методы клеточной селекции, можно получить клеточные линии с измененным составом стеринов, а из них - растения- регенеранты, которые и будут влиять на развитие насекомых-вредителей посредством неполного удовлетворения пищевых потребностей насекомых.

В предлагаемом способе мутанты получают с использованием микрокаллусов. Микрокаллусы - небольшие кусочки каллус- ной ткани размером 1,5-2 мм, светлые, рыхлые, легко диспергируемые. Микрокаллус характеризуется высокой скоростью роста и первичную устойчивость растения можно оценить на 10-15-й день с момента посадки растительной ткани, тогда как при использовании суспензионной культуры этот срок соответствует 30-40 дням. Применение нистатина в питательной среде в дозах, не ниже сублетальных, которые частично инги- бируют рост микрокаллусов, обеспечивает селекцию первично-устойчивых каллусов, дающих мутантные клеточные линии, сохраняющие нужный признак - устойчивость к насекомым-вредителям и на неселективных средах в дальнейшем.

Способ осуществляют следующим образом,

В качестве растительного материала используют каллусную культуру, полученную из асептических проростков культуры на среде для каллусообразования, например, RMNO (3), содержащий фитогормоны (2,4- дихлорфеноксиуксусная (2,4-Д) кислота 0,1 мг/л, кинетин 0.04 мг/л,/ -индолилуксус- ная кислота (ИУК) 3 мг), или на среде Мурасиге-Скуга (4), также содержащей фитогормоны (6-бензиламинопурин (БАП) 2,5 мг/л и а-нафтилуксусную кислоту (НУК) 0,5 мг/л). Для получения устойчивых к нистатину клеточных линий в среду для культивирования после автоклавирования добавляют нистатин в концентрации сублетальной, величина которой установлена экспериментально. Так, для табака она составляет 50 мг/л, а для

0 гороха - 60 мг/л, и эти сублетальные концентрации не полностью подавляют рост растений. Культивирование проводят в чашках Петри, в каждую помещают по 22 микрокаллуса. За единицу варьирования при

5 анализе берут один микрокаллус, контролем служат микрокаллусы, растущие на среде без нистатина. Антибиотик нистатин, вносимый в питательную среду, растворяют в диметилсульфоксиде, а для контроля при0 меняют среду с диметилсульфоксидом (ДМ50). Чашки Петри с каллусами помещают в термокомнату при 22-26°С в темноту.

Результаты культивирования оценива5 ют на 10-16-й день роста каллусов. Определяют долю растущих каллусов по отношению к общему их числу. Сублетальной считается такая доза, при которой процент растущих микрокаллусов не

0 превышает 2%. Первичные каллусы пассируются на среду того же состава и каждое последующее культивирование осуществляют через 15-20 дней. Для увеличения количества устойчивых к нистатину

5 микрокаллусов растений используют ультрафиолетовое (УФ) облучение в экспозиции 4-5 мин, причем облучение проводят лампами с мощностью светового потока 2 Дж/м2 с на расстоянии 0,7 м над поверхностью

0 чаши.

Селекцию клеточных штаммов на устойчивость к нистатину проводят следующим образом. На среде с нистатином растут только единичные микрокаллусы, первично5 устойчивые. Для уменьшения гетерогенности клеточной популяции проводят субселекцию. Для этого из отобранного клеточного штамма, индивидуально от каждого, берут микр/экаллусы и снова помещают

0 на среду с нистатином в той же концентрации. Пассирование повторяют 2-3 раза, что приводит к уменьшению числа устойчивых штаммов, как правило, в 2-3 раза. Мутант- ная природа полученных штаммов измене5 ний доказывается сохранением признака в неселективных условиях. Проверка этого критерия осуществляется отбором микрокаллусов от каждого устойчивого штамма и пассивированием его на среде без нистатина, причем пассирование проводят дважды.а затем опять переносят на среду с нистатином. Выросшие штаммы на среде с нистатином относят к устойчивым клеточным линиям. Число таких штаммов подсчитывают и соотносят с числом первичноустойчивых штаммов. Параллельно ставят контрольный опыт - получение каллусов на среде без нистатина.. Чашки с каллуса контрольных и устойчивых штаммов на среде MS, содержащей 6-бензиламино- пурин (ВАР) в концентрации 1 мг/л, щают на досветку и на 30-й день наблюдают появление растений-регенерантов, Для укоренения каждый побег отделяют от общей массы и переносят на среду .MS без фито- гормонов. Для проверки сохранности признака у растения проводят морфогене- тический цикл растение - регенерант - каллус. Для этого от каждого растения получают вторичный каллус и в соответствии с изложенной выше методикой с помощью микрокаллусов проверяют сохранность признака на среде с нистатином.

В ходе осуществления способа необходим выбор сублетальной концентрации нистатина,ингибирующейрост микрокаллусов, При определении такой дозы используют концентрации нистатина в диапазоне 0,1-50 мг/л, причем нистатин, взятый в концентрации даже 0.1 мг/л, подавляет рост микрокаллусов и по мере увеличения ;концентрации антибиотика процент растущих микрокаллусов резко снижается (табл.).

П р и м е р 1, Испытывают влияние различных концентраций нистатина на рост микрокаллусов табака. Выявлено, что инги- бирующая рост концентрация нистатина 60 мг/л, а сублетальная - 50 мг/л для нистатина с активностью 5200 ед/мг, при этом суб- лета льной концентрации соответствует около 2% растущих микрокаллусов после селекции (табл. 1), При активности нистатина 3200 ед/мг снижение растущих каллусов до 2% отмечалось при концентрации антибиотика 15 мг/л (табл. 1) .

П р и м. е р 2. Испытывают культуру гороха на устойчивость с применением нистатина с активностью 5200 ед/мг. В среду, содержащую нистатин концентрацией 40 мг/л, в чашках Петри вносят-311 каллусов гороха линии 1-23/2, помещают чашки Петри на термостатирование при 22-26°С в темноте. После культивирования в течение 15 дней отбирают первичноуетойчйвые каллусы, способные к морфогенезу, и определяют процентное, отношение их к исходному количеству образцов. Для данной концентрации нистатина их количество равно 49,8% (по пяти опытам 32,4-54,3%).

ПримерЗ. Испытывают культуру гороха 1-23/2 аналогично примеру 2. при концентрации нистатина 50 мг/л. Отобрано 20,4% растущих каллусов (по пяти опытам

.18,3-24,2%).

П р. и м е р 4. Испытывают культуру гороха 1-23/2, аналогично примеру 2, с ни- , статином активностью 5200 ед/мг, концентрацией 60 мг/л. Берут 297 микрокаллусов.

после культивирования отобрано 1,2% растущих каллусов (по пяти опытам 0,9-1,5%). П р и м е р 5. Испытывают культуру гороха, аналогично примеру 2, с нистатином концентрацией 70 мг/л. Берут 326 микрокаллусов для культивирования, после 15 дней жизнеспособных каллусов не обнаружено (по пяти опытам 0,00-0,08%).

Приме р 6. Испытывают культуру гороха 1-23/2 на среде с ДМ5О, без нистатина, аналогично примеру 2. Берут исходно

174 микрокаллуса, после культивирования

(через 15 дней) обнаружено 98.0% растущих

микрокаллусов (по пяти опытам 96.8-99.8%).

П Р и м е р 7. Испытывают культуру

гороха в контроле на среде без добавок аналогично примеру 2. Берут 230 микрокаллусов, и через 15 дней обнаружено растущих микрокаллусов 90% (по пяти опытам 85,4 - 91,3%).

По примеру 2-7 делают выводо влиянии нистатина на развитие микрокаллусов и устанавливают сублетальную дозу 60 мг/л при активности 5200 ед/мг, ингибирующую 70 мг/л. Результаты сведены в табл. 2,

ПримерЗ. Испытывают влияние УФ-облучения в присутствии сублетальных концентраций нистатина на развитие растений и увеличение количества мутантных кле- ток табака. Микрокаллусы облучают

УФ-светом в течение 2-6 мин. При субселекции первичноустойчивых каллусов, отобранных по схеме примера 2, после 2-кратного пассирования на среде, содержащей нистатин, отбирают устойчивые линии, сохранившие признак в неселективных условиях.

Берут исходных микрокаллусов 231, культивируют на среде с содержанием нистатина активностью 5200 ед/мг 50 мг/л,

облучают растения УФ-светом в течение 2 мин. После селекции отбирают 2 первично- устойчивых каллуса, производят субселекцию, после которой устойчивых каллусов не сохранилось.

П р и м е р 9. Испытывают влияние УФ-облучения на развитие растений и увеличение клеточных линий табака, аналогично примеру 8, с облучением УФ-светом в течение 3 мин. Из исходных микрокаллусов после культивирования отобрано первичноустойчивых 3, устойчивых после субселекции каллусов не выявлено.

П р и м е р 10. Испытывают влияние УФ-облучения на табак, аналогично примеру 8, с облучением его в течение 4 мин. Из 231 исходного микрокаллуса после культивирования выявлено первичноустойчивых 9, устойчивых после субселекции 3 и устойчивых после проверки в неселективных условиях 3.

ПримерИ. Испытывают влияние УФ-света на табак, аналогично примеру 8, с облучением в течение 5 мин. Из 320 исходных микрокаллусов отобрано первично- устойчивых 2, однако после субселекции устойчивых образцов не выявлено.

При м е р 12. Испытывают влияние УФ-облучения на табак аналогично примеру 8, с облучением в течение 6 мин, Из 231 исходного микрокаллуса отобрано первичноустойчивых 4,после субселекции устойчивых 2, и устойчивых после проверки в неселективных условиях 2.

Пример 13. Проводят опыт аналогично примеру 8 без УФ-облучения, Из 326 исходных микрокаллусов отобрано первично- устойчивых 2, а после субселекции устойчивых образцов не обнаружено.

По результатам примеров 8-13 делают вывод о влиянии УФ-облучения при мощности светового потока 2 Дж/м2 с экспозицией 4-6 мин в сочетании с культивированием на среде, содержащей нистатин в сублетальной для растения дозе, на увеличение количества устойчивых к нистатину клеточных линий, выдержавших проверку на устойчивость в неселективных условиях.

Результаты опытов с табаком и горохом приведены в табл. 3.

Пример 14. У устойчивых растений табака и исходной клеточной линии, на которой они были получены, методами газово- жидкостной хроматографии проанализирован состав стеринов. Ориентировочный состав стеринов проверяемый у растений, следующий: холестерин (1), кампестерин (2) стигмастерин (3), ситостерин (4) и другие

(5).

Стерины испытанных растений в контроле распределились по позициям указанных стеринов следующим образом: 1 -22%, 2-21%.3-45%,4-12%.5-0%.

Для растений-регенерантов (в контроле) соотношение стеринов: 1 - следы, 2 - 30%, 3-44%. 4-25%, 5-0%.

Для нистатин-устойчивых клеточных линий: 1-следы: 2-26%, 3-21%, 4-58%. 5- 0%.

Для каллусов (в контроле): 1 - 14%, 2 - 28%, 3-22%, 4-36%, 5-0%.

Для нистатин-устойчивых растений-регенерантов: 1 - 17%, 2 - 17%. 3 - 53%, 4 - 8%, 5-0%.

Таким образом, все устойчивые к ниста- тину клеточные линии и растения-регене- ранты имеют измененный состав стеринов по сравнению с контрольными образцами.

Пример 15. У устойчивых растений гороха и исходной клеточной линии метода- 0 ми газово-жидкостной хроматографии проанализирован состав стеринов. Ориентировочный состав, проверяемый у растений, такой как в примере 14.

По позициям, указанным выше, стери- 5 ны испытанных растений распределились следующим образом:

растения (контроль): 1 -21%, 2- 10%, 3 -23%, 4-26%, 5-20%;

каллус (контроль): 1-7%,2-9%,3- 0 10%, 4-25%, 5-49%;

нистатин-устойчивые клеточные линии,

штамм 1:1-8%, 2-0%. 3-0%. 4-0%. 5-92%;

штамм 2: 1 -9%, 2 - 0%, 3 -0%, 4 -8%, 5 5-83%:

штамм 3: 1 - 0%, 2 -0%, 3 - 0%, 4 -38%, 5-62%;

штамм 4: 1 -8%, 2 - 15%. 3- 11%, 4- 28%, 5-38%.

0 Таким образом, все нистатин-устойчивые клеточные линии гороха имеют сущест- венно иной состав фитостеринов по сравнению с контролем.

Результаты примеров 14-15 сведены в 5 табл. 4.

Пример16. Оценивают устойчивость полученных линий табака в системе растение-дрозофила (разработанная авторами эколого-генетическая система для тестиро- 0 вания растительных объектов). Устойчивость растений к насекомым-вредителям оценивают по плодовитости дрозофилы, для которой исследуемое растение (в виде микрокаллуса) является пищевым субстратом. 5 Достоверное снижение плодовитости дрозофилы служит доказательством устойчивости растения к насекомому-вредителю, поскольку жизнеспособность его зависит от содержания стеринов и их нормального со- 0 отношения в данном растении.

Для табака (каллусы в контроле) плодовитость мух составляет 38.0%. При содержании мух на мутантных клеточных линиях, нистатин-устойчивых, плодовитость состав- 5 ляет 6,2 и 8.4%, что говорит о достоверном снижении плодовитости мух на нистатин-устойчивых линиях.

Пример 17. Оценивают устойчивость клеточных линий гороха в системе растение- дрозофила аналогично примеру 16. Плодовитостьдрозофилы на контрольном штамме составляет 49,0%, а на устойчивой клеточной линии - 13,6%, при этом наблюдается задержка в развитии и нарушение репродуктивной системы самок мух.

Таким образом, среди устойчивых к нистатину линий растений (например, табак, горох) есть такие, которые в целом и обеспечивают развитие дрозофилы, но с задерж- кой, и снижают ее плодовитость, Изменение метаболизма фитостеринов в растении позволяет блокировать развитие насекомого.

Технико-экономическая эффективность прелагаемого изобретения по сравнению с известным заключается в существенном ускорении и направленном отборе раститель- ных форм, устойчивых к насекомым- вредителям, за счет получения многочисленных растений-регенерантов на основе отобранных устойчивых клеточных линий с использованием системы микрокаллусов. Современная селекция растений, устойчивы к насекомым-вредителям, предусматривает получение, прежде всего, набора растительных форм, подлежащих испытанию, из которых и выбирают устойчивые, причем результаты испытаний зависят от

факторов внешней среды в гораздо большей степени, чем предлагаемый способ.

Для культур с длительным циклом развития предлагаемый способ представляется наиболее эффективным, и существенно снижающим затраты на проведение селекционной работы для всех культур.

Формула изобр е т е н и я

1.Способ отбора растительных форм, устойчивых к насекомым-вредителям, предусматривающий культивирование растительных клеток на среде, содержащей нистатин, выделение жизнеспособных клонов, получение регенерантов растений с последующим анализом состава стеримов в растениях, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что. с целью увеличения выхода устойчивых растительных форм и упрощения способа, в качестве растительных клеток используют микрокаллусы растений, а содержание нистатина в среде устанавливают не ниже сублетальной дозы..

2.Способ по п. 1, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью повышения выхода устойчивых растительных форм, жизнеспособные клоны дополнительно обрабатывают ультрафиолетовым светом с помощью светового потока 2 Дж/м2 с экспозицией 4-6 мин.

Изобретение относится к сельскому хозяйству и может быть использовано для отбора растительных форм, устойчивых к насекомым-вредителям, при селекции. Целью изобретения является увеличение выхода устойчивых растительных форм и упрощение способа. Способ отбора растительных форм/устойчивых к насекомым-вредителям, предусматривает культивирование микрокаллусов на среде, содержащей на ниже сублетальной дозы нистатина, выделение жизнеспособных клонов, получение регене- рантов растений с последующим анализом состава стеринов в растениях. При этом жизнеспособные клоны дополнительно обрабатывают ультрафиолетовым светом с мощностью светового потока 2 Дж/м2 с экспозицией 4-6 мин. 1 з.п. ф-лы, 4 табл.

Таблица Влияние концентрации нистатина на рост микрокаллусов табака

Вариант опыта Количество микро- Растущие микрокаллусы

каллусови доверительный интервал,%

Нистатин с активностью 3200 ед/мг 0,t мг/л6023,3

в,6 - 3,7 1 мг/л4839,6

26,3 - «3,7 10 «г/л906,7

4,5 - 10,8 15 мг/л631,6

0,8 - 2,2 Нистатин с активностью 5200 ед/мг

11171701612

Т а б л и ц а 2

Влияние изменения концентрации нистатина на рост микрокаллусов гороха (1-23/2)

ш вв «. - -«.-. - - - ---- | в в - .« -

Вариант опыта Количество микро- Количество растукаллусов щих микрокаллусов и доверительный интервал, %

Контроль23090,0

85 „4- 91,3

DMSO17498,0

96,8 - 99,8

Нистатин с активностью 5200 ед/мг 40 мг/лЗИ . . 49,8

32,4 - 54,3

50 мг/л28320,4

18,3 - 24,2

60 мг/л2971.2

0,9 - 1,5

70 мг/л3260,0

0,00 -

Т а б л и ц а 3

Влияние УФ-облучения на получение устойчивых к нистатину клеточных линий табака и гороха

МикрокаллусыГорохТабак

. ММ М«яаМ М «Ш «НЯВ« М «вМ.М М МВ 4

Доза УФ-облучения за время, Доза УФ-облучения за время, минмин

103460 2 3 4 56

------- - ---Г------- ------------- -г--- -------------------------------.

Исходные367 283 360 740326 231 210231 320 231

Пер:вичноустоЙчивые 60352 23 92 Ц

Устойчивые после

субселекции201300 0302

Устойчивые после проверки в неселективных уело-. виях 10 0 30 003 0 2

Таблица Содержание фитостеринов в ка нях табака и гороха (%)

Нистатин-устойчивые клеточные линии:

штамм 1 штамм 2 штамм 3 штамм k

П р и м е ч а н и е. -4- относительное время удержания стеринов по холестерину.

11

38 28

92

83 62

38