Способ получения солеустойчивых клеточных линий люцерны Советский патент 1991 года по МПК A01H4/00 C12N5/04 

Изобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству и может быть использовано в клеточной селекции при создании нового исходного материала, в частности в клеточной селекции люцерны.

Цель изобретения - повышение солеустойчивости растений.

Способ осуществляется следующим образом.

В качестве исходного материала используют среднеазиатские сорта люцерны. В качестве эксплантата берут листья, растения предварительно стерилизуют в 0,1%- ном растворе диоцида. Каллусную культуру получают на среде Гамборга Bs, содержащей дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4- Д) 8 мг/л, нафтилуксусную кислоту (НУК) 0,5 мг/л, кинетин (КИН) 8 мг/л. Клеточную суспензию получают на жидкой питательной среде с фитогормонами 0.5 мг/л 2,4-Д и 0,5 мг/л КИН. Полученную клеточную суспензию подвергают ультрафиолетовому облучению, которое проводят в асептических

условиях в чашках Петри на расстоянии 15- 20 см от источника облучения с длиной волны 304-410 нм. После облучения клетки промывают 3-4 раза питательной средой при рН 5.8 с последующим определением их жизне- и эмбриогенной способности. Клеточную суспензию с жизнеспособностью выше 30% переносят на селективную питательную среду, содержащую комплекс солей. Суспензию, выдерживающую высокие концентрации комплекса солей, культивируют 3-4 пассажа по 25-30 дн, после чего получают эмбриоиды и растения-регенеран- ты.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

П р и м е р 1. Для мутагенного воздействия УФ-облучения используют суспензии, содержащие не менее 800 тыс.клеток в 1 мл с жизнеспособностью 85-95%. Если в суспензии имеются клеточные агрегаты, то их предварительно отфильтровывают через сетку для получения гомогенных клеточных

Ё

00

XJ

со ю

суспензий, которые разливают по 15 мл в чашки Петри в условиях асептики. Промывку повторяют 3-4 раза. После этого определяют жизнеспособность и эмбриогенную способность (табл.1),

П р и м е р 2. После облучения промытые клетки переносят в селективную питательную среду Гамборга Bg, содержащую смесь солей сульфата и хлорида натрия (табл.2).

Как видно из табл.2, ультрафиолетовые лучи повышают жизнеспособность клеток люцерны. Наиболее высокий индекс роста и жизнеспособность на 25-е сутки культивирования наблюдают при облучении и концентрации солей 1,5%, что в 2,1 раза выше, чем у необлученных клеток, а при концентрации соли 1 % индекс роста и жизнеспособность практически не отличаются от контроля. При концентрации солей 2% жизненная функция клеток ингибируется. Та- ким образом, ультрафиолетовое облучение увеличивает выход клеток, устойчивых к действию комплекса солей.

П р и м е р 3. Для доказательства интервальных значений приводится табл.3, где ингибирование жизненных функций культуры ткани люцерны наблюдается при соотношении солей от 0,42:0,83 до 0,56:1,11 или от 1,25 до 1,67%.

П р и м в р 4. Облученные ультрафиоле- товыми лучами клетки промывают в стерильной питательной среде в условиях асептики. Действие кратности промывок в стерильной питательной среде при рН 5,8- 6,0 на плотность и жизнеспособность кле-

ток люцерны иллюстрируется в табл.4, из которой видно, что на 6 день после 3-4-кратной промывки наблюдается наиболее высокая жизнеспособность. При увеличении числа промывок жизнеспособность изменяется слабо.

После 3-4 пассажей на селективной среде отбирают устойчивые к смеси солей клеточные линии люцерны, получают расте- ния-регенеранты, 40% которых выдерживают сильное засоление в природных почвенных образцах с преобладающим сульфатно-хлоридным типом засоления. Получены семена от растений-регенерантов в условиях комплексного засоления. Формула изобретения Способ получения солеустойчивых клеточных линий люцерны, включающий получение каллуса из эксплантатов, получение из каллуса суспензии клеток и перенос ее на селективную питательную среду с последующим получением растений-регенерантов, отличающийся тем, что, с Целью повышения солеустойчивости растений, перед переносом на селективную питательную среду на суспензию клеток воздействуют ультрафиолетовым облучением в течение 3-4 ч, после чего облученные клетки промывают 3-4 раза стерильной питательной средой с рН 5,8-6,0 в условиях асептики и в качестве селективного агента используют смесь солей сульфата и хлорида натрия в концентрации 1,25-1,67% при соотношении солей 1:1 по осмотическому давлению.

Изобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству и может использоваться в клеточной селекции люцерны при создании нового исходного материала. Целью изобретения является повышение солеустойчивости растений. Способ состоит в том, что из листьев получают каллус, из которого получают суспензию клеток, которую в течение 3-4 ч облучают ультрафиолетом, затем промывают 3-4 раза стерильной питательной средой и переносят на селективную питательную среду, в качестве селективного агента используют смесь хлорида и сульфата натрия в количестве 1,25-1,67% при соотношении солей 1:1 по осмотическому давлению. 4 табл.

Таблица

1241,1/30,2241,3/33,0245,4/33,2246,6/33,0

2240,6/23,0240,6/35,0259,8/45,8260,4/45,6 3 243,0/16,5249,2/33,2268,6/55,4263,2/55,8

6 243,6/единичные242,2/32,8277,2/57,2278,2/59,0 клетки

Таблиц аЗ

Таблица 4