СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ РАСТЕНИЙ КУКУРУЗЫ IN VITRO Российский патент 2003 года по МПК A01H4/00 C12N5/04 

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способам генетической инженерии, и может быть использовано как в сельском хозяйстве, так и для фундаментальных исследований в области физиологии растений.

В настоящее время при получении трансгенных растений метод агробактериальной трансформации кукурузы не нашел широкого применения из-за низкого выхода регенерантов, а при получении коммерческих сортов кукурузы используют метод баллистической трансформации, основанный на переносе различных генов с использованием специальной установки, основанной на неестественном (на химически инертные металлы наносятся вводимые гены, которые внедряются в клеточные структуры под давлением). При использовании этого метода частота появления трансформированных растений достигает только 3% (Brettschneider R., Becker D. , Lorz H. Efficient transformation of scutellar tissue of maize embryos. // Theor. Appl. Genet. - 1997 - v.94 - p.737-748).

Известен способ получения трансформированных растений (Драйпер Дж., Скотт Р., Армитидж Ф., Уолден Р. (Ред.) Генная инженерия растений. - М.: Мир. - 1991. - 408 с.).

Этот способ заключается в кокультивировании эксплантов растений с агробактериями в жидкой питательной среде, с последующим культивированием на твердой питательной среде, содержащей антибиотики, один - элеминирующий рост агробактерий и другой - селективный агент, в частности антибиотик канамицин.

Недостаток этого способа заключается в том, что при применении его к культуре тканей кукурузы происходят ингибирование морфогенеза и подавление регенерации.

Известен способ получения трансформированных растений кукурузы in vitro, заключающийся в кокультивировании незрелых зародышей кукурузы с агробактериями, предварительно обработанными эссудатом табака, последующем встряхивании на приборе "vortox" и культивированием на твердой питательной среде, содержащей антибиотики (Ishida Y., Saito H., Ohta S., Hiei Y., Komari Т., Kumashiro T. High efficiency transformation of maize (Zea mays L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens. // Nat. Biotechnology - 1996 - v.14 - p.745-750).

Недостатком этого способа является малый выход трансформированной кукурузы, нестабильность воспроизводимости результатов, использование в качестве эксплантов только незрелых зародышей и нетехнологичность процесса, а именно его трудоемкость.

Задачей настоящего изобретения является создание такого способа получения трансформированных растений кукурузы, который бы обеспечивал увеличение выхода канамициноустойчивых растений, стабильность воспроизводимости результатов, использование в качестве эксплантов как незрелых зародышей, так и эмбриогенного каллуса и улучшение его технологичности.

Эта задача решается новым способом получения трансформированной кукурузы in vitro, заключающийся в кокультивировании эксплантов растений кукурузы на питательной среде с агробактериями, преварительно активизированными экссудатом табака, с последующим добавлением антибиотиков, причем кокультивирование эксплантов кукурузы проводят на газоне агробактерий в течение одного пассажа культивирования, в качестве эксплантов используют как незрелые зародыши, так и эмбриогенный каллус, а добавление антибиотиков проводят поэтапно: сначала цефотаксим в течение шести пассажей в концентрации 100-300 мг/л, а затем канамицин для отбора канамициноустойчивых растений.

Заявляемые пределы концентрации цефотаксима определяются следующим образом: использование концентрации ниже 100 мг/л не элиминируют агробактерии, а при использовании концентрации выше 300 мг/л подавляется регенерационная способность эмбриогенного каллуса.

Сущность изобретения, по мнению авторов, заключается в том, что в предлагаемом способе кокультивирования эксплантов осуществляют на газоне агробактерий, который выращивают на твердой питательной среде для роста кукурузы, что не ингибирует активность морфогенеза и регенерацию растений, а поэтапное добавление пониженных доз цефатоксима вызывает не только элиминацию агробактерий, но и стимуляцию регенерации. При поэтапном добавлении антибиотиков происходит разделение процесса элиминации с одновременной стимуляцией регенерации и последующей селекцией уже полученных регенерантов.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами, причем результаты, представленные в примерах 1-6, являются воспроизводимыми и математически усредненными, они приведены в таблице.

Пример 1. Незрелые зародыши кукурузы линии 91 (Долгих Ю.И., Ларина С.Н., Шамина З.Б., Жданова Н.Е., Пустовойтова Т.Н. Засухоустойчивость растений кукурузы, полученных из устойчивых к осмотическому действию полиэтиленгликоля клеточных линий. //Физиология растений - 1994 - т.41 - 6 - с.853-858), линия А 188 (Green C.E. Somatic embryogenesis and plant regeneration from friable callus of Zea mais. // In plant tissue culture, maruzen со., Tokyo, Japan - 1982 - Ed. Fujiwara A. - p. 107-108) и гибрид между этими линиями А188х91 кокультивируют на твердой питательной среде с агробактериями (газон), предварительно активизированными экссудатом табака, в течение 20 дней (один пассаж). Затем переносят на среду, содержащую антибиотик цефотаксим (Сх) в концентрации 100 мг/л для элиминации агробактерий и стимуляции регенерантов. Полученные регенеранты высаживают на среду с антибиотиком канамицин (Км) в концентрации 25 мг/л.

Трансфекция генов подтверждена молекулярными анализами, такими как ПЦР и гибридизация по Саузерну.

Пример 2. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что используют Сх - 200 мг/л.

Пример 3. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что используют Сх - 300 мг/л.

Пример 4. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что в качестве эксплантов используют эмбриогенный каллус трех линий 91, А 188 и гибрид между ними (А188х91), а концентрация Сх - 100 мг/л.

Пример 5. Проводят аналогично примеру 4, с той лишь разницей, что концентрация Сх - 200 мг/л
Пример 6. Проводят аналогично примеру 4, с той лишь разницей, что используют Сх - 300 мг/л.

В результате настоящего способа обеспечено увеличение выхода канамициноустойчивых растений от 8,1 до 21,6 для незрелых зародышей и от 14,5 до 40,1 для эмбриогенного каллуса при стабильной воспроизводимости результатов, а также улучшение его технологичности по сравнению с баллистическим методом за счет неприменения энергоемкого специального оборудования и эффективного использования растительного материала.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способам генетической инженерии, и может быть использовано как в сельском хозяйстве, так и для фундаментальных исследований в области физиологии растений. Трансформированную кукурузу in vitro получают кокультивированием эксплантов растений кукурузы на питательной среде с агробактериями, предварительно активизированными экссудатом табака, с последующим добавлением антибиотиков. Кокультивирование эксплантов кукурузы проводят на газоне агробактерий в течение одного пассажа культивирования, в качестве эксплантов используют как незрелые зародыши, так и эмбриогенный каллус. Добавляют антибиотики поэтапно, сначала цефотаксим в течение шести пассажей в концентрации 100-300 мг/л, а затем канамицин для отбора канамициноустойчивых растений. Способ обеспечивает увеличение выхода канамициноустойчивых растений от 8,1 до 21,6 для незрелых зародышей и от 14,5 до 40,1 для эмбриогенного каллуса при стабильной воспроизводимости результатов, а также улучшение его технологичности по сравнению с баллистическим методом за счет неприменения энергоемкого специального оборудования и эффективного использования растительного материала. 1 табл.

Способ получения трансформированной кукурузы in vitro, заключающийся в кокультивировании эксплантов растений кукурузы на питательной среде с агробактериями, предварительно активизированными экссудатом табака, с последующим добавлением антибиотиков, отличающийся тем, что кокультивирование эксплантов кукурузы проводят на газоне агробактерий в течение одного пассажа культивирования, в качестве эксплантов используют как незрелые зародыши, так и эмбриогенный каллус, а добавление антибиотиков проводят поэтапно, сначала цефотаксим в течение шести пассажей в концентрации 100-300 мг/л, а затем канамицин для отбора канамициноустойчивых растений.