СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТЕНИЙ С КОМПЛЕКСНОЙ УСТОЙЧИВОСТЬЮ К ФИТОСТЕРИНЗАВИСИМЫМ ВРЕДИТЕЛЯМ Российский патент 1999 года по МПК A01H4/00 C12N5/04 

Изобретение относится к области сельского хозяйства и экологии, в частности, к растениеводству и охране окружающей среды и может быть использовано при производстве экологически чистых растений, подавляющих численность вредителей сельского хозяйства, зависящих в своем развитии от стеринов растений, например, фитофторы, насекомых и нематод.

Известен способ получения устойчивых к вредителям сельского хозяйства растений (1), основанный на методах генной инженерии, где в растения встраивают чужеродный ген, например ген Bt, который контролирует синтез белка-токсина, уничтожающего личинки насекомых или ген, контролирующий синтез защитных белков, что позволяет получать устойчивые трансгенные растения. К недостаткам этого метода относится то, что при встраивании в растения чужеродного гена изменяется экспрессия собственных генов растения, что приводит к нарушению свойств растения, в том числе и тех, которые связаны с урожайностью. Кроме того, введенный ген очень часто утрачивает свои свойства, перестает экспрессироваться, что сводит на нет физические и экономические затраты, связанные с получением трансгенных растений.

Известен также способ получения устойчивых к вредителям сельского хозяйства растений, основанный на явлении сомаклональной изменчивости (2), когда проводят скрининг на устойчивость среди множества растений-регенерантов, полученных из клеточных или тканевых культур. Такой подход позволяет значительно сократить время селекции. К недостаткам этого метода относится то, что отбор проводят не направленно, без специально подобранных селективных условий, и поэтому вероятность отбора растений, устойчивых к вредителям очень низкая и требует анализа большого числа растений-регенерантов. Кроме того, отбирают растения устойчивые только к определенному патогену, а не к целой группе вредителей сельского хозяйства.

Наиболее близким аналогом, выбранным в качестве прототипа (3), является способ, основанный на клеточной селекции, когда отбор устойчивых к насекомым растений осуществляется на фоне селективного агента, дающего возможность отбирать растения, у которых изменен спектр фитостеринов, необходимых насекомым для прохождения полного цикла развития. В качестве селективного агента используют полиеновый антибиотик нистатин, который является неспецифическим селективным агентом, на его фоне можно отбирать любые изменения, связанные с проницаемостью клеточной мембраны, в том числе возможен отбор клеток, а затем растений-регенерантов с измененным спектром фитостеринов, в силу чего такие растения не могут являться полноценным кормом для насекомых, что и приводит к снижению их численности. Недостатком этого способа является то, что применяемый селективный агент характеризуется широким спектром действия, что снижает, а иногда и сводит к нулю вероятность получения растений с направленно-измененным составом стеринов и нормальной морфологией. Кроме того, использование ультрафиолетового излучения, как мутагена, и отбор растений-регенерантов из устойчивых к селективному агенту клеточных культур на фоне нистатина, приводит к появлению очень большого числа аномальных растений, которые не пригодны для их использования в сельском хозяйстве.

Задачей, решаемой данным изобретением является создание способа получения высших растений с комплексной устойчивостью ко всей группе фитостеринзависимых вредителей сельского хозяйства. Этот способ позволяет на основе специально подобранных селективных агентов и без использования мутагена, отбирать только те растения, у которых направленно изменен состав фитостеринов и не изменены признаки, влияющие на продуктивность растений. Такие растения характеризуются не только комплексной устойчивостью к фитостеринзависимым вредителям, но являются и экологически чистыми, так как при их выращивании не требуется использования ядохимикатов (пестицидов). К фитостеринзависимым вредителям относятся многие виды насекомых (например, колорадский жук), патогенные грибы (например, фитофтора) и нематоды, то есть большая разнородная группа вредителей, требующая для своего уничтожения разнообразных пестицидов, которые наносят огромный вред окружающей среде, являясь высокотоксичными для всех млекопитающих, в том числе и для человеке, а кроме того, их производство является трудоемким и дорогостоящим. Данное изобретение, основанное на клеточной селекции, позволяет не только получать растения с комплексной устойчивостью ко всем перечисленным вредителям и не требует внесения дорогих ядохимикатов, но также позволяет значительно сократить время селекции (до одного года), в отличие от общепринятой традиционной селекции, которая занимает от 5 до 8 лет, а также позволяет получать сразу необходимое число растений для воспроизводства посадочного материала.

Этот результат достигается тем, что получение растений с комплексной устойчивостью к фитостеринзависимым вредителям, основанное на клеточной селекции и отличающееся тем, что селекцию проводят на уровне микрокаллусов, получаемых из протопластов известным методом (4), которые выращивают на первичной питательной среде, содержащей агар, макро и микросоли, сахарозу, добавки фитогормонов ауксина и цитокинина при температуре и длине светового дня, соответствующим активному делению клеток до формирования микрокаллуса, после чего микрокаллусы помещают в питательную среду с агентом, селектирующим клетки с измененным составом фитостеринов и подавляющим рост клеток дикого типа и культивируют устойчивые микрокаллусы до образования каллусов, затем каллусы помещают на вторичную питательную среду с составом, сходным с первичной средой с добавкой фитогормонов цитокинина, ауксина и гиббереллина при отсутствии селективного агента при температуре и длине светового дня, соответствующим активному делению клеток и получают растения- регенеранты, определяя у них состав фитостеринов, затем из выращенных растений-регенерантов отбирают экземпляры, у которых по сравнению с диким типом изменен состав фитостеринов, после чего на отобранные растения-регенеранты наносят суспензию, содержащую смесь агрессивных штаммов фитостеринзависимых грибов и отбирают не пораженные грибом экземпляры растений, устойчивые к фитостеринзависимым грибам, после чего полученные растения, устойчивые к фитостеринзависимым грибам используют в качестве единственного источника стеринов в диете фитостеринзависимых насекомых и контролируют плодовитость и репродуктивную систему этих насекомых, затем окончательно отбирают экземпляры растений, которые одновременно устойчивы к грибам и подавляют плодовитость и репродуктивную систему насекомых, формируя из них экземпляры растения с комплексной устойчивостью к фитостеринзависимым вредителям.

В частных конкретных случаях реализацию способа осуществляют получением растений с комплексной устойчивостью к фитостеринзависимым вредителям, при котором протопласты выращивают при температуре окружающей среды в пределах от 20 до 28^oC на свету, при длине светового дня не менее 10 часов в течение времени, необходимого для достижения размера микрокаллуса, содержащего не более 80-100 клеток, с последующим их культивированием на среде с селективным агентом в виде полиенового антибиотика филипина или ингибитора биосинтеза стеринов, например, байтана в течение времени, необходимого для селекции устойчивых к селективному агенту микрокаллусов при температуре окружающей среды в пределах от 20 до 28^oC на свету, при длине светового дня не менее 10 часов, причем суспензию наносят на полученные из устойчивого каллуса растения-регенеранты в виде смеси, содержащей набор агрессивных штаммов фитофторы, а стеринсодержащая диета из этих растений используется для дрозофилы.

Примеры конкретного выполнения
Растительный материал. Использовали сорта и различные формы картофеля Solanum tuberosum L.: сорта, растения-регенеранты сорта Невский (НСР), сорта Пушкинец (П-1, П-2), дигаплоид ДГ 30 (сорт Кози-ма) и дикий вид Solanum nigrum L., а также сорта томатов Утро, Таллалихин, Алпатьева, Бизон.

Методы исследований. Получение микрокаллусов, каллусов и растений-регенерантов. Протопласты получали и культивировали до стадии формирования небольших агрегатов по стандартной методике (4). Видимые невооруженным взглядом агрегаты переносили на среду Мурасиге и Скуга (МС) с ауксином и цитокинином и культивировали при температуре 24-28^oC на свету до размера микрокаллуса, содержащего 80-100 клеток. Для получения каллусных культур использовали микрокаллусы, размером не более 100 клеток, которые помещали на среду МС с ауксином и цитокинином и культивировали применительно к этим формам при температуре 24-28^oC более 10 дней. Для индукции побегообразования и получения растений-регенерантов каллусы помещали на среду с ауксином, цитокинином, а для картофеля и с гиббереллином. Чашки помещали под светоустановку с лампами дневного света при фотопериоде 16 ч/сут и температуре 26^oC.

Получение растений-регенерантов, устойчивых к байтану и филипину. В ходе осуществления способа необходим выбор сублетальной концентрации селективного агента, ингибирующей рост клеточных культур. Использовали такие селективные агенты, как филипин и ингибитор биосинтеза стеринов - байтан. Испытывали серию концентраций селективных агентов, которые значительно влияли на жизнеспособность растительных тканей. Для селекции на фоне селективного агента использовали формы с интенсивной регенерацией и сублетальные концентрации байтана и филипина. Устойчивые к селективным агентам клеточные культуры переносили на среду для регенерации без селективного агента для индукции побегообразования. Регенерирующие побеги были повторно перенесены на среду с байтаном. Подросшие устойчивые побеги укореняли и каждая форма поддерживалась индивидуально.

Анализ фитостеринов. Лиофилизированные ткани растений гомогенизировали с помощью ультрагомогенизатора в растворе метилен-хлорид-метанол. Тотальную фракцию липидов выделяли тремя последовательными экстракциями тем же растворителем. Все липидные производные сапонифицировали раствором щелочи в метаноле. Фракцию свободных стеринов экстрагировали гексаном и очищали фильтрованием через сульфат натрия. Производные стеринов анализировали методом ГЖХ на хроматографе. Различные формы стеринов идентифицировали методом масс-спектрометрического анализа.

Оценка устойчивости растений картофеля к Phytophtora infestans. Для оценки устойчивости растений к фитофторозу in vitro использовалась раса Phytophtora infestans с 14 генами вирулентности - 1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11.X. Y. Z, выделенная из Сахалинской популяции гриба. Для повышения агрессивности культуру пассировали на пробирочных растениях восприимчивого сорта.

Пример 1. Получение растений-регенерантов картофеля, устойчивых к байтану
Получение растений-регенерантов с измененным составом стеринов из устойчивых к селективному агенту каллусов осуществляли следующим образом.

Предварительно подбирали сублетальную концентрацию байтана для микрокаллусов картофеля. Установлено, что помимо фитотоксического эффекта байтан обладает свойством подавлять процессы роста тканей и регенерации. В контроле регенерацию наблюдали уже через месяц (табл.1). На среде с байтаном выживало незначительное количество каллусов, у которых на этой среде регенерация была подавлена полностью. Поэтому для получения регенерантов переносили устойчивые каллусы на среду для регенерации с повышенной концентрацией гиббереллина и не содержащей байтана, что позволило получить растения-регенеранты. Их устойчивость была подтверждена при повторном переносе регенерирующего каллуса на среду с байтаном - образовавшиеся в неселективных условиях побеги продолжали расти. На стандартной среде МС для черенкования побеги укореняли. Морфологически большинство растений-регенерантов не отличалось от контрольных растений.

Таким образом, на среде с сублетальной концентрацией байтана получено 50 растений, которые в дальнейшем были проанализированы на устойчивость к фитофторе и фитостеринзависимым насекомым.

Пример 2. Получение растений-регенерантов, устойчивых к филипину
По той же схеме регенерации из устойчивых к филипину каллусов получали растения-регенеранты картофеля. Филипин является одним из самых цитотоксичных полиеновых антибиотиков и связывается с мембранными стеринами, что приводит к деформации и разрушению мембраны и гибели клетки. Поэтому ткани и клетки, устойчивые к нему, должны иметь в мембранах другие стерины, с которыми филипин не взаимодействует и обладать измененным биосинтезом стеринов.

На среде с филипином выживало только 36,2% каллусов при 100% и 80% в контролях KI и KI+ДМСО (табл. 2). Филипин также практически полностью подавляет процесс регенерации по сравнению с контролем. Поэтому для получения регенерантов, устойчивые экспланты переносили на среду без селективного агента. Сроки регенерации во всех вариантах остались неизменными - более одного месяца. Также не было отмечено морфологических отличий устойчивых регенерантов от контрольных растений-регенерантов.

Регенерировавшие побеги были высажены на стандартную среду для черенкования. Растения были проверены на устойчивость к фитофторе, а также в модельной системе "растение-дрозофила".

Пример 3. Оценка устойчивости к фитофторе in vitro растений-регенерантов картофеля
Известно, что Phytophtora infestans зависит в своем развитии от растительных стеринов, в частности, от β ситостерина. Поэтому один из возможных способов создания растений, устойчивых к фитофторе, - изменение состава стеринов в растении.

Устойчивость растения к фитофторе определяли по двум признакам - процент некротических зон, развившихся на растении при заражении и процент спороношения гриба. При полевой, оценке главным показателем восприимчивости является спороношение, в условиях in vitro оба показателя равны по значимости. Согласно разработанной балльной шкале максимально устойчивое растение имеет 0 баллов по обоим признакам, а максимально восприимчивое - 4 балла.

Прежде всего, исходная форма картофеля П-1 оказалась максимально восприимчивой (балл 4). Спороношение отмечалось по всей поверхности растения, которое быстро гибло в результате системного некроза (табл. 3). Все контрольные растения-регенеранты оказались менее чувствительны к патогену по сравнению с исходной формой.

Растения, устойчивые к байтану и филипину (опыт), закономерно характеризовались более высокой устойчивостью к фитофторозу, чем в обоих контролях. Колебания по признаку спороношения в этой группе составили 0-2 балла (в среднем 1 балл), по признаку развития некрозов 1-2 балла (в среднем 1,5 балла). Кроме того, были растения, например образец Rf18, полностью устойчивые к фитофторе. На этих растениях отмечались только редкие и мелкие некротические зоны (0-1 балл), а процент спороношения был подавлен полностью (0 баллов). Возникшая устойчивость связана с измененным составом стеринов (табл. 4).

Пример 4. Оценка растений-регенерантов, устойчивых к филипину или байтану, в модельной системе "растение-дрозофила"
Модельная система "растение-дрозофила" позволяет выявить различия между разными генетическими формами растений по устойчивости к насекомым. Оценивали показатель, который определяет процессы кладки яиц, линьки и метаморфоза личинок мух, зависящие от наличия в корме стеринов. Контрольные растения как единственный источник корма, в том числе и стеринов, способны в достаточной мере удовлетворять эту потребность (табл. 5).

Анализ плодовитости мух (линия Canton-C) на контрольных растениях, полученных в двух вариантах контроля (KI и KI+ДМСО), показал, что эти варианты достоверно не различаются между собой, и имеют практически одинаковый средний показатель плодовитости (46,8±6,9 и 43,3±5,5). Растения-регенеранты, устойчивые к филипину, а также устойчивые к фитофторе, достоверно снижали плодовитость мух (13,3±3,7 и 11,3±1,2) по сравнению с контрольными.

Таким образом, хотя растения картофеля - непривычный корм для личинок дрозофилы, что видно из сравнения растительных и дрожжевых контролей (104±23,5), тем не менее система с дрозофилой применима для выявления форм растений с интересующим нас признаком. Итак, нами получены клеточные линии (например, ПIRf18), растения-регенеранты которой устойчивы к фитофторе и снижают плодовитость дрозофилы.

Учитывая то, что эти формы устойчивы к фитофторе и к насекомым, их можно отнести к растениям, обладающим комплексной устойчивостью к фитостеринзависимым вредителям сельского хозяйства.

Предлагаемый способ позволяет в течение года получить целую серию растений, обладающих устойчивостью к патогенам, а не в течение 5-8 лет, необходимых в традиционной селекции. Предлагаемый способ может быть предназначен для использования для многих сельскохозяйственных культур, вредителями которых являются фитостеринзависимые патогены.

Пример 5. Получение растений-регенерантов, устойчивых к байтану (сорт Таллалихин)
Предварительно подбирали сублетальную концентрацию байтана для микрокаллусов томатов. Байтан растворяли в ДМСО, поэтому в качестве еще одного контроля использовали питательную среду, в которую добавляли 1 мг/л ДМСО. Клеточная культура томатов оказалась менее чувствительной к байтану, поэтому концентрация байтана была значительно увеличена. Использовали концентрации байтана от 300 до 600 мг/л. Показано, что байтан в зависимости от концентрации подавляет не только рост микрокаллусов, но и регенерацию растений из эмбриогенных каллусов (табл.6). Концентрация байтана 600 мг/л была выбрана как сублетальная. Из устойчивых микрокаллусов были получены органогенные каллусы с последующей регенерацией из них растений. На стандартной среде МС для черенкования побеги укореняли и затем переносили в почву. Большинство растений-регенерантов не отличались от контрольных по морфологии. Полученные растения-регенеранты были проанализированы на устойчивость к фитофторе.

Пример 6. Получение растений-регенерантов, устойчивых к байтану (сорт Утро)
По той же схеме подбирали сублетальную концентрацию байтана для микрокаллусов сорта Утро. В отличие от сорта Таллалихин, микрокаллусы сорта Утро оказались более чувствительными к селективному агенту. Уже при концентрации 400 мг/л продолжали активный рост единичные микрокаллусы (табл. 7), которые формировали органогенный каллус. Из органогенного каллуса активно формировались растения-регенеранты. В результате для сорта Утро было получено большее число растений, устойчивых к байтану по сравнению с сортом Таллалихин.

Пример 7. Оценка устойчивости к фитофторе in vitro растений-регенерантов томатов
Устойчивость растения к фитофторе определяли так же, как у картофеля по двум признакам - процент некротических зон и процент спороношения гриба. Балльная шкала использована та же: 0 - устойчивое, 4 - максимально восприимчивое. Анализировали только растения с нормальным фенотипом. Каждое растение было разделено черенкованием на 4 части, поэтому возможным оказалось провести несколько повторностей опыта. В таблице 8 приведено среднее значение по каждому признаку, вычисленное на основе нескольких повторностей опытов. Изменчивость по повторностям практически отсутствовала. Исходные растения, например, сорта Утро оказались максимально восприимчивыми (балл 4). Спороношение наблюдали по всей поверхности и в результате они в течение нескольких дней гибли. Растения, выделенные как устойчивые к байтану, показали достаточно высокую степень устойчивости к фитофторе. В результате, для сорта Утро получено 9 растений, устойчивых к фитофторозу. Аналогично были получены устойчивые к фитофторозу растения для сорта Таллалихин, Алпатьева, Бизон.

Таким образом, предложенный способ позволяет получать устойчивые к патогенам, и, в частности, к фитофторозу растения разных видов: картофель, томаты. Важно, что предложенный способ не требует использования мутагенов, а полученные растения являются биологически чистыми.

Источники информации
1. J. D.Watson, M.Gilman et al. Recombinant DNA. ch.15.Genetic engineering of plants. New York. 1991. (P. 273-293).

2. В.А. Сидоров. Биотехнология растений. Клеточная селекция. Гл. 2. Сомаклональная изменчивость. Киев. Наукова Думка. 1990. (Стр. 29-49).

3. Л.А. Лутова, Е.А. Левашина, Л.В. Бондаренко, Н.Л. Байрамова, Е.В. Андронова, С.Г. Инге-Вечтомов. Мутанты высших растений по биосинтезу стеринов // Генетика. 1992. Т. 28. N 2. (Стр. 129-136).

4. Сидоров В.А., Пивень Н.М., Сытник К.М., Глеба Ю.Ю. Соматическая гибридизация пасленовых. Киев. Наукова Думка. 1985. 216 с.

Изобретение относится к сельскому хозяйству и экологии, в частности к растениеводству и охране окружающей среды, и может быть использовано при производстве экологически чистых растений, подавляющих численность вредителей сельского хозяйства, зависящих в своем развитии от стеринов растений, например растений семейства пасленовых (картофель, томаты и др.), от фитофторы и колорадского жука. В ходе клеточной селекции на фоне селективных агентов проводят отбор растений с направленным изменением в спектре фитостеринов. Полученные таким образом растения обладают комплексной устойчивостью к большой группе фитостеринзависимых вредителей (насекомые, грибы, нематоды) и являются экологически чистым, т. к. не требуют для своего выращивания пестицидов. Данное изобретение по получению растений с комплексной устойчивостью к фитостеринзависимым вредителям является экономически выгодным, т.к. позволяет сократить время селекции с 5-8 лет до одного года и также не требует использования дорогостоящих ядохимикатов. 1 з.п.ф-лы, 8 табл.

1. Способ получения растений с комплексной устойчивостью к фитостеринзависимым вредителям, основанный на клеточной селекции, включающей получение каллусов, выращивание их на первичной питательной среде, содержащей агар, макро- и микросоли, сахарозу, добавки фитогормонов ауксина и цитокинина при температуре и длине светового дня, соответствующим активному делению клеток до формирования рыхлого каллуса, разделение его на микрокаллусы, отличающийся тем, что микрокаллусы помещают в питательную среду с агентом, селектирующим клетки с измененным составом фитостеринов и подавляющим рост клеток дикого типа, и культивируют устойчивые микрокаллусы до образования каллусов, затем каллусы помещают на вторичную питательную среду с составом, одинаковым с первичной добавкой фитогормонов при отсутствии селективного агента, выращивают при температуре и длине светового дня, соответствующим активному делению клеток, и получают растения-регенеранты, определяя у них состав фитостеринов, затем из выращенных растений-регенерантов отбирают экземпляры, у которых по сравнению с диким типом изменен состав фитостеринов, после чего на отобранные растения-регенеранты наносят суспензию, содержащую смесь агрессивных штаммов фитостеринзависимых грибков, и отбирают непораженные грибом экземпляры растений, устойчивые к фитостеринзависимым грибам, после чего полученные растения, устойчивые к фитостеринзависимым грибам, используют в качестве единственного источника стеринов в диете фитостеринзависимых насекомых и контролируют плодовитость и репродуктивную систему этих насекомых, затем окончательно отбирают экземпляры растений, которые одновременно устойчивы к грибам, и подавляют плодовитость и репродуктивную систему насекомых, формируя из них экземпляры растений с комплексной устойчивостью к фитостеринзависимым вредителям. 2. Способ получения растений с комплексной устойчивостью к фитостеринзависимым вредителям, основанный на клеточной селекции по п.1, отличающийся тем, что микрокаллусы, содержащие не более 80 - 100 клеток, выращивают при температуре окружающей среды в пределах от 18 до 28^oC на искусственном свету, при длине светового дня не менее 10 ч на среде с селективным агентом в виде полиенового антибиотика филипина или ингибитора биосинтеза стеринов, например байтана, в течение времени, необходимого для селекции устойчивых к селективному агенту микрокаллусов, затем каллусы помещают на вторичную питательную среду с составом, одинаковым с первичной средой с добавкой фитогормонов при отсутствии селективного агента, и выращивают при температуре окружающей среды в пределах от 18 до 28^oC на искусственном свету, при длине светового дня не менее 10 ч до получения растений-регенерантов, причем суспензию наносят на растения-регенеранты, полученные на основе микрокаллусов в виде смеси, содержащей набор агрессивных штаммов фитофторы, а стеринсодержащая диета из этих растений используется для дрозофилы и/или колорадского жука.