Штамм бактерий BacILLUS SUвтILIS для получения препарата против возбудителя серой гнили земляники Советский патент 1992 года по МПК A01N63/00 C12N1/20 

Изобретение относится к области сельского хозяйства, а именно к разработке средств защиты ягодных культур, преимущественно земляники, от возбудителя серой гнили Botrytis cinerea.

Известна защита земляники химическими препаратами путем опрыскивания растений в период вегетации, до цветения.

Однако применение их не предотвращает поражение серой гнилью, так как в период роста и созревания ягод применение фунгицидов запрещено. В годы с дождливым и прохладным летом серая гниль почти полностью уничтожает урожай земляники.

Известны штаммы рода Bacillus - продуценты веществ, использующиеся для биологической защиты растений. Так, штамм Bacillus punellus 0097/1 используется для борьбы с возбудителем парши яблони; штамм Bacillus subtHls APPL-1 используется для борьбы с ржавчиной бобовых. Однако эти штаммы не являются антагонистами возбудителя серой гнили - Botrytls cinerea и не могут применяться на землянике.

Наиболее близким к изобретению является способ борьбы с заболеванием земляники, возбудителем которой является гриб вида Botrytis cinerea, предусматривающий обработку растений земляники в фазе роста и бутонизации (14-22 июня) антагонистом

ю о

вышеуказанного вида гриба, в качестве которого используют один из штаммов Streptomyces grlscovlrldes ATCC 39271- 39273.

Однако применение микроорганизмов p.Streptomyces в качестве агентов биологической борьбы с серой гнилью земляники сопряжено с рядом технологических трудностей, а именно:

а) для наращивания биомассы применя- ются дорогостоящие питательные среды, в т.ч. являющиеся пищевым сырьем (солодовый экстракт, казеионовый гидролизат, глюкоза или лактоза);

б)трехкратная обработка;

в)кроме того, известно, что представители указанной группы микроорганизмов - стрептомицеты, могут в отдельных случаях служить причиной заболеваний теплокровных.

Цель изобретения - получение более технологичного штамма бактерий Bacillus subtilis для получения препарата против возбудителя серой гнили земляники - Botrytis cinerea.

Поставленная цель достигается следующим образом.

Штамм выделен из почвы Киевской области, в 1982 году, идентифицирован по Краткому определителю бактерий Берд- жи.

Штамм депонирован в коллекции культур Центрального Музея промышленных микроорганизмов института ВНИИ генетика под номером: ЦМПМ В-2895, в качестве штамма, обладающего высокой антагонистической активностью.

Морфолого-культуральные признаки Bacillus subtilis ЦМПМ В-2895 - культура спороносная, аэробная, граммположитель- ная. В мазках из колоний, выросших на МПА через 18 ч, обнаруживаются прямые палочковидные клетки 1,9-2,1x0,3-0,4 мкм, расположенные одиночно, изредка цепочкой. Клетка при спорообразовании не раздува- ется, после роста на глюкозном агаре в протоплазме глобулы не обнаруживаются. На МПБ культура образует пленку.

Через 48 ч роста при +37° на среде Громыко и сусло-агаре культура имеет вид ше- роховатых плоских тусклых колоний с фестончатым краем, диаметром 5-8 мм, светло-серого или телесного цвета, пастообразной консистенции, хорошо снимается петлей с поверхности агара.

Через 48 ч роста при +37° на стрептоми- цетном и картофельном агаре культура имеет вид гладких, плоских колоний со слегка . волнистым краем, диаметром 3-4 мм, телесного цвета, пастообразной консистенции.

хорошо снимается петлей с поверхностью агара.

Минимальная температура роста Bacillus subtilis ЦМПМ В-2895 колеблется в пределах 5-20°; максимальная от +45° до +55°; оптимальная +28±37°.

РН среды минимальные 4, максимальные 8, оптимальные 6-7.

В качестве органических источников азота штамм Bacillus subtilis ЦМПМ И-2895 может использовать следующие органические соединения: пептон, гидролизат казеина, дрожжевой автолизат; неорганические соединения: аммонийные соли МНаМОз; (NH4)4S04 нитраты (ШОз; МаМОз).

Штамм хранится на МПА. среде Громыко (МПА+СА), агаризованной среде Гаузе № 2 под слоем стерильного вазелинового масла, пересев - 1 раз в год.

Маркерный признак штамма: штамм устойчив к антибиотику - полимиксину. Характерной особенностью штамма является его избирательное воздействие на возбудителя серой гнили - Botrytfs cinerea,

Физиолого-биохимические свойства.

Ферментирует глюкозу, арабинозу. маннит, ксилозу с образованием кислоты без газа. Дает положительную реакцию Фо- гес-Проскауэра, гидролизует крахмал, желатину, растет при 7% NaCI, утилизирует цитрат, пропионат не использует. Культура не растет в анаэробных условиях и при 10% NaCI, не образует газ из МОз в анаэробных условиях, не обладает аргининдигидрола- зой, лецитиназой. В протоплазме клетки не обнаруживаются включения поли-уЗ-окси- масляной кислоты.

Штамм не патогенен для теплокровных животных.

Данные о непатогенности штамма Bacillus subtilis ЦМПМ В-2895. Суспензии штамма Bacillus subtilis ЦМПМ В-2895, выращенного в течение 24 ч на мясо-пептон- ном агаре (МПА) при +30°С.

Фильтрата культуральной жидкости штамма Bacillus subtilis ЦМПМ В-2895, выращенного в течение 15 сут на жидкой среде Гаузе Ish 2 при +30°С.

Проверку патогенности осуществляли на белых мышах весом 18-20 г. Животным вводили суспензии и фильтраты в желудок через зонд и в инъекциях.

Результаты исследования токсичности фильтрата культуры Bacillus subtilis ЦМПМ В-2895 после роста на среде Гаузе № 2 представлены в табл.1.

Результаты исследования вирулентности суспензии культуры Bacillus subtllis

ЦМПМ В-2895, выращенной в течение 24 ч при +37°С на МПА представлены в табл.2.

Наблюдения за животными проводили ежедневно на протяжении 15 дней после окончания инъекции или перорального введения. В период наблюдения все животные были активны, хорошо поедали пищевые рационы, физиологические отравления у них не нарушались, поведенческие реакции были обычными, изменений со стороны шерст- ного покрова не отмечалось. Все подопытные мыши после окончания срока наблюдения были умерщвлены, вскрыты и их органы подвергнуты макроскопическому изучению.

Результаты вскрытия показали:

Сердце - обычной формы и величины.

Легкие - в объеме, не увеличены, доли легко отделяются друг от друга, поверхности гладкие, спаек не отмечается,

Желудок, петли тонкого и толстого кишечника - внешне представляются обычными, при вскрытии просвета рисунок слизистой не изменен. Печень - тёмнокрасного цвета, среднего кровонаполнения, не увеличена. Доли отделены друг от друга, поверхности гладкие.

Почки - обычных размеров и формы. Поверхности гладкие, на разрезе четкий рисунок коркового и мозгового вещества.

Селезенка - не увеличена, плотной консистенции. На разрезе пульпа умеренно полнокровна, тёмнокрасного цвета.

Таким образом, введение суспензии 24- часовой культуры Bacillus subtilis ЦМПМ В- 2895 перорально в дозах 1-5 м лрд микробных клеток и внутрибрюшинно в дозах 1-10 микробных клеток на одну мышь не вызывало у мышей каких-либо признаков заболевания. Изучение внутренних органов животных не выявило у них патологических изменений, регистрируемых макроскопически.

Введение мышам фильтратов среды роста (после культивирования штамма Bacillus subtilis ЦМПМ В-2895) на жидкой среде Гаузе № 2 не вызывало у животных патологического процесса, регистрируемого клинически или при макроскопическом изучении внутренних органов животных.

Приведеные данные дают основание считать, что штамм Bacillus subtilus ЦМПМ В-2895 не вирулентен и не токсиченен, т.е. не патогенен для теплокровных животных. Штамм обладает высокий антагонистической активностью в отношении возбудителя серой гнили земляники - Botrutis cinerea, a также к фитопатогенным бактериям и грибам, патогенным и условно патогенным микроорганизмам (табл).

Антагонистическая активность штамма Bacillus subtilis ЦМПМ В-2895 представлена в табл.3.

Получение препарата против возбуди5 теля серой гнили земляники Botrytls cinerea на основе штамма бактерий Bacillus subtilis ЦМПМ В-2895. Основные этапы изготовления препарата; подготовка штамма - засев на косячки с сусло-агаром, инкубирование

0 при +37° в течение 18-24 ч.

Пересев на бактериологические матрицы с твердой средой - сусло-агар, стоимость 1 л которого составляет 14 коп, в то время как для выращивания штаммов

5 Streptomyces grlseovirldes ATCC 39271- 39273 используются дорогостоящие питательные среды.

Инкубирование при +37° в течение 7 сут для получения спор. Срок культивирования

0 Streptomyces grlseovirides ATCC 39271- 39273 составляет 12 дней (5 дней со встряхиванием и 7 дней без встряхивания). Контроль спорообразования штамма Bacillus subtilis ЦМПМ В-2895 проводим

5 микроскопически. С агаризованной среды культуру смываем физиологическим раствором. Полученную суспензию клеток доводим до 60 и 100 млрд спор в 1 мл (по оптическому стандарту мутности).

0Биологическую активность полученной

суспензии спор (которую квалифицируем как препарат) определяют по антагонистической активности бактериальной культуры в отношении Botrytis cinerea - возбудителя

5 серой гнили земляники методом радиальных штрихов.18-часовая культура высевается в центр чашки Петри с сусло-агаром на площадь, очерченную кругом диаметром 2,5 см. Через 3 сут инкубирования при +28°

0 подсевают по радиальным штрихам тест- культуру Botrytis cinerea из бактериальной суспензии 5- 108 кл/мл. Зоны отсутствия роста учитывают через 18-24 ч инкубирования.

5 Проверка опытных серий культуры Bacillus subtflis ЦМПМ В-2895, выращенной при 37° на среде сусло-агар, содержащей 100 млрд КОЕ в 1 мл представлена в табл.4 Наличие зон отсутствия роста Botrytis

0 cinerea - 19-21 мм свидетельствует о высокой антагонистической активности штамма Bacillus subtilis ЦМПМ В-2895.

Для длительного хранения препарата в полученную суспензию клеток вносят на5 полнитель - сахарозо-желатиновую среду (4% и 1 % соответственно) к общему объему . и разливают в лотки из нержавеющей стали. Помещают в морозильную камеру при температуре не выше -20° на 48 ч. Затем проводят лиофилизацию в вакуумных сушильных

камерах в течение 36 ч при температуре от -20° до +36°. Контроль бактериальной чистоты препарата проводят методом рассева на агаризованные питательные среды (МПА, Гаузе № 2, Громыко, картофельный агар, стрептомицетный агар).

Антагонистическую активность полученного препарата на основе штамма Bacillus subtHls ЦМПМ В-2895 по отношению к тесткультуре Botrytls clnerea опреде- л я ют методом радиальных штрихов.

Антагонистическая активность опытных серий препарата на основе штамма Bacillus subtUis ЦМПМ В-2895(после лиофильной сушки) представлена в табл.5.

Пример. Препарат против возбудителя серой гнили земляники получают наращиванием штамма -Bacillus subtilis ЦМПМ В-2895 на твердой среде сусло-агар при +37° в течение 7-10 сут для получения спор. Культуру смывают физиологическим раствором. Готовят рабочую суспензию с титром 60 и 100 млрд спор в 1 мл из расчета 1 л/га. Расход рабочей жидкости 600-800 л/га.

В полевых условиях действие препара- та проверяют на устойчивом к возбудителю серой гнили Botrytis dnerea сорте земляники - Ясна. Опыты проводят на сорте Зенга- Зенгана, являющимся восприимчивым к возбудителю Botrytls clnerea, что не дает возможности делать вывод о его более высокой эффективности.

Насаждения земляники были инфицированы конидиями Botrytis clnerea. Фоновая нагрузка составляет 2-10 конидий в 1 мл. Через одни сутки делянки однократно опрыскивались препаратом на основе штамма Bacillus subtilis ЦМПМ В-2895 с титром 60 и 100 млрд спор в 1 мл в фазу

роста и начало созревания плодов, поскольку возбудитель находится на растительных остатках, черешках, чашелистиках. До фазы цветения и после сбора урожая рекомендуется применять химические средства защиты (против серой гнили - байлетон 25% с.п. с нормой расхода 0,24 кг/га, который испытан нами как эталон). В фазы после цветения, роста и созревания плодов применять химические средства защиты категорически запрещено. В благоприятные для развития болезни годы (дождливая, туманная погода) погибает практически весь урожай. Применение в этот период препарата на основе Bacillus subtilis ЦМПМ В-2895 позволит значительно сохранить урожай,

Эффективность Bacillus subtilis против серой гнили земляники в сравнении с фунгицидом ОПХ УНИИС Новоселки(фаза роста и созревания плодов) представлена в табл.6.

Опрыскивание растений препаратом на основе штамма Bacillus subtilis ЦМПМ В- 2895 снижает поврежденность ягод серой гнилью на 8,6-10.6% по сравнению с контролем, и на 6,3% по сравнению с эталоном, развитие болезни - на 46,24-57%. Предлагаемый способ борьбы с серой гнилью земляники позволяет получить прибавку урожая 1,6-2,2 ц/га (при средней урожайности плантации 50 ц/га), что составляет 228- 294 руб/га.

Формула изобретения

Штамм бактерий Bacillus subtilis ЦМПМ В-2895 для получения препарата против возбудителя серой гнили земляники.

Таблица 1

Использование: микробиологическая промышленность, сельское хозяйство, получение средств защиты ягодных культур от возбудителя серой гнили - Botrytis cinerea. Сущность изобретения: штамм бактерий Bacillus subtilis ЦМПМ В-2895 культивируют на сусло-агаре при 37°С в течение 7 сут до получения спор, смывают физиологическим раствором, полученную суспензию разводят до получения титра 60 и 100 млрд. спор в 1 мм (по оптическому стандарту мутности), вносят наполнитель - сахарно-жела- тиновую среду и лиофилизируют. Антагонистическая активность полученного препарата по отношению к Botrytis cinerea, определяемая по зоне лизиса, составляет 19-21 мм. Опрыскивание растений земляники препаратом на основе штамма Bacillus subtilis снижает повреждаемость ягод серой гнилью на 8,6-10,6% по сравнению с контролем и позволяет получить прибавку урожая на 1,6-2,2 ц/га. 6 табл. (Л

Таблица 2

Botrytis cinerea tfonilia fructigena Phizopus nigricans Xantomonas tnaivacearuri Penicillium expansum claviforme Fufcariuin oxysporum Verticillium dalle Thilaviopsis basicola Salmonella stenl ey 5266 stenlcy Proteus vulgaris F vulgaris 72

retlgeri

Slaphylococcus aureus 2 Candida albicans tropicales Ervinia euratovora Aspergillus niger fumi gattm 1 fumigatum flavura 282 fumigatura 50

Продолжение табл. 2

Таблица 3

20-21

12-16

13-15

15-17

14-16

15-17

10-13

15-17

15-1,8

32-33

40-31

25-27

40-42

30-32

20-23

40-31

10-13.

40-43

15-17

5-7

12-14

20-22

25-27

Таблица 4

Байлетон,25% с.п. норма расхода 0,24 кг/га (эталон)

Штамм Bacillus subtilis ЦМПМ

Таблица 5

Таблицаб

12,3

66,12

48,9