СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ Советский патент 1994 года по МПК C12Q1/04 

Изобретение относится к микробиологии и касается быстрого выявления микроорганизмов - продуцентов метанола.

Известен способ выявления бактерий семейства Enterobacteriaceae путем посева исследуемых микроорганизмов на плотную питательную среду, содержащую 5,2-дихлор-4-нитросалициланилид, для избирательного подавления грамположительной микрофлоры.

Известен способ выявления микроорганизмов-деструкторов неионогенных поверхностно-активных веществ.

Способ заключается в приготовлении агаризованной питательной среды, содержащей источники фосфора, азота, углерода и необходимые минеральные соли, засеве ее культурами испытуемых микроорганизмов, их выращивании и последующем анализе путем обработки культуральной среды 3-5% -ным водным раствором фенола. О наличии активных форм деструкторов судят по зоне просветления вокруг выросших колоний.

Однако известные способы не обеспечивают возможности выявления микроорганизмов - продуцентов метанола.

Целью изобретения является расширение функциональных возможностей способа при определении микроорганизмов - продуцентов метанола.

Способ заключается в следующем.

При выявлении микроорганизмов, предусматривающем приготовление агаризованной питательной среды, содержащей источники фосфора, азота, углерода и необходимые минеральные соли, засев ее культурами испытуемых микроорганизмов, их выращивание и последующий анализ культуральной среды, в качестве источника углерода используют этиленгликоль и/или диэтаноламин в концентрации 1-2 г/л среды, при анализе культуральную среду обрабатывают экстрагентом и о присутствии микроорганизмов - продуцентов метанола - судят по наличию метанола в экстрагенте.

В качестве экстрагента используют дистиллированную воду в количестве 2-3 мл на 1 г агаризованной среды.

Установлено новое свойство микроорганизмов продуцировать метанол на агаризованной питательной среде, где в качестве источника углерода присутствует этиленгликоль и/или диэтаноламин.

Предложенные концентрации диэтаноламина и/или этиленгликоля являются оптимальными и выход за их пределы в ту или другую сторону приводит к ухудшению условий решения поставленной задачи (см. табл. 1), так как количества этих веществ менее 1 г/л могут давать появление метанола в низких концентрациях, что не позволит достоверно определить его наличие в экстрагенте. Таким образом, нижний предел определяется чувствительностью применяемых способов определения метанола.

Количества веществ более 2 г/л оказывают ингибирующее действие на микроорганизмы вследствие токсичности диэтаноламина и этиленгликоля.

Объем дистиллированной воды (2-3 мл на 1 г культуральной среды), используемый в качестве экстрагента, обеспечивает оптимальные условия экстракции (см. табл. 2).

Как видно из табл. 2, объемы менее 2 мл затруднят отделение дистиллированной воды от агаризованной среды, объемы, превышающие 3 мл, дадут сильное разведение образующегося метанола, что затруднит его определение.

Способ осуществляют следующим образом. Готовят агаризованную питательную среду и разливают в чашки Петри по 10 мл. Засевают среду исследуемой ассоциацией микрооpганизмов так, чтобы на каждой чашке получить по 20-30 изолированных колоний. Культивирование микроорганизмов проводят при 28-30^оС в течение 3 сут. Затем вырезают участки культуральной агаризованной среды, прилегающие к отдельной морфологически отличающейся колонии, заливают их дистиллированной водой в соотношении 2-3 мл воды на 1 г агаризованной среды, тщательно гомогенизируют смесь в фарфоровой ступке, после чего центрифугируют полученную смесь при 5000 об/мин в течение 10-15 мин для удаления частиц агара. В надосадочной жидкости проводят определение содержания метанола, например, методом газожидкостной хроматографии.

П р и м е р 1. Готовят питательную среду следующего состава, г/л: KН₂PO₄ 0,25 K₂HPO₄ 0,15 NaCl 0,05 NH₄Cl 0,15 MgSO₄ ˙ 7H₂O 0,05 CaCO₃ 0,03
FeSO₄ ˙ 7H₂O Следы Этиленгликоль 1,0 Агар-агар 20,0 Дистиллиро- ванная вода До 1 л
Среду стерилизуют автоклавированием при 1 атм и температуре 105^оС в течение 40 мин и разливают в чашки Петри по 10 мл.

Питательную среду в чашках засевают 0,5 мл жидкости, отобранной из анаэробного блока опытно-промышленной установки микробной очистки химзагрязненных стоков.

Засеянные чашки инкубируют при 30^оС в течение 3 сут, после чего вырезают зоны агаризованной среды вокруг трех отдельных, отличающихся по морфологическим признакам колоний микроорганизмов, обозначенных ЭГ₁, ЭГ₂, ЭГ₃.

Взвешивают полученные кусочки агара на технических весах, помещают в фарфоровую ступку, заливают дистиллированной водой из расчета 2 мл воды на 1 г агаризованной среды и тщательно растворяют до получения однородной массы. Выдерживают полученную смесь в течение 30 мин для экстракции метанола, после чего центрифугируют при 5000 об/мин в течение 10 мин. В надосадочной жидкости проводят определение содержания метанола методом газожидкостной хроматографии на хроматографе с пламенно-ионизационным детектором. Хроматограф оборудован 2 м стальной колонкой с внутренним диаметром 2 мм с набивкой Porapak Q (80/100 меш). Температура в колонке и детекторе 140 и 170^оС соответственно. Проведенный анализ показывает наличие метанола в экстракте, полученном при обработке зоны агаризованной среды, прилегающей к колонии ЭГ₂ в количестве 0,25 мг на 1 мл экстракта.

П р и м е р 2. Готовят питательную среду следующего состава, г/л: KH₂PO₄ 0,25 К₂HPO₄ 0,15 NaCl 0,05 NH₄Cl 0,15 MgSO₄ ˙ 7H₂O 0,05 CaCO₃ 0,03 FeSO₄ ˙ 7H₂О Следы Диэтаноламин 1,5 Агар-агар 20,0 последовательным растворением всех компонентов в дистиллированной воде.

Далее способ осуществляют по методике, описанной в примере 1.

После культивирования получают две отличающиеся по морфологическим признакам колонии, обозначенные ДЭА₁ и ДЭА₂.

Анализ экстрактов, полученных при обработке зон агаризованной среды, прилегающей к колониям, показывает наличие метанола в одном из них (зона вокруг колонии ДЭА₁) в количестве 0,35 мг на 1 мл экстракта.

П р и м е р 3. Готовят питательную среду следующего состава, г/л: KH₂PO₄ 0,25 К₂HPO₄ 0,15 NaCl 0,05 NH₄Cl 0,15 MgSO₄ ˙ 7H₂O 0,05 CaCO₃ 0,03 FeSO₄ ˙ 7H₂O Следы Диэтаноламин 1,0 Этиленгликоль 1,0 Агар-агар 20,0 последовательным растворением всех компонентов в дистиллированной воде.

Далее способ осуществляют по методике, описанной в примере 1.

После культивирования получают три отличающиеся по морфологическим признакам колонии, обозначенные как (ЭГ + ДЭА)₁, (ЭГ + ДЭА)₂. В зоне агаризованной среды, прилегающей к колонии (ЭГ + ДЭА)₁, после обработки ее, как описывалось в примере 1, в экстрагенте обнаружен метанол в количестве 0,5 мг на 1 мл экстракта.

Данный способ выявления микроорганизмов - продуцентов метанола - более эффективен и прост по сравнению с известными способами. Это позволяет при проведени и микробиологических исследований выявлять микроорганизмы - продуценты метанола - на ранней стадии работы.

Изобретение относится к микробиологии и касается быстрого выявления микроорганизмов - продуцентов метанола. Целью изобретения является расширение функциональных возможностей способа при определении микроорганизмов - продуцентов метанола. Способ заключается в приготовлении агаризованной питательной среды, содержащей этиленгликоль и/или диэтаноламин в качестве источника углерода в концентрации 1-2 г/л среды, засеве ее культурами используемых микроорганизмов, их выращивании, обработке агаризованной среды, окружающей отдельно выросшую колонию, дистиллированной водой в количестве 2-3 мг/г среды и установлении микроорганизмов-продуцентов метанола - по наличию метанола в водном экстракте. 2 табл.

СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ , пpедусматpивающий пpиготовление питательной сpеды, содеpжащей источники углеpода, азота, фосфоpа, необходимые минеpальные соли, агаp - агаp и воду, засев ее культуpами испытуемых микpооpганизмов, их выpащивание, обpаботку культуpальной сpеды и последующий ее анализ, отличающийся тем, что, с целью pасшиpения функциональных возможностей способа пpи опpеделении микpооpганизмов - пpодуцентов метанола, - в качестве источника углеpода используют этиленгликоль и/или диэтаноламин в концентpации 1 - 2 г/л питательной сpеды, обpаботку культуpальной сpеды осуществляют дистиллиpованной водой в количестве 2 - 3 мг/г культуpальной сpеды и по наличию метанола в водном экстpакте устанавливают наличие микpооpганизмов - пpодуцентов метанола.