ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ БАКТЕРИЙ С ПОВЫШЕННОЙ ДЕСТРУКТИВНОЙ СПОСОБНОСТЬЮ Российский патент 2010 года по МПК C12N1/26 C12Q1/04 

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии и может быть использовано для выращивания углеводородокисляющих бактерий с повышенной деструктивной активностью с целью приготовления посевного материала для глубинного культивирования в ферментере при параметрах, оптимальных для микроорганизмов-деструкторов, получения биомассы и создания биопрепарата на основе нефтеокисляющих микроорганизмов.

Антропогенное загрязнение окружающей среды стало серьезной проблемой и достигло глобальных масштабов. Нефть и нефтепродукты относятся к самым массовым загрязнителям природных объектов [Лисичкин В.А., Шелепин Л.А., Боев Б.В. Закат цивилизации или движение к ноосфере (Экология с разных сторон). - М.: ИЦ-ГРАНТ, 1997. - 352 с.]. В этой связи вопросы всестороннего изучения биологических свойств микроорганизмов, особенностей процессов микробной утилизации нефти и нефтепродуктов и влияния на них различных факторов, создание условий для проявления максимальной активности штаммов-деструкторов входят в число первоочередных, стоящих перед экологической биотехнологией [Турковская О.В. Биологические и технологические аспекты микробной очистки сточных вод и природных объектов от поверхностно-активных веществ и нефтепродуктов. Автореферат дис. докт. биол. наук. - Саратов, 2000. - 43 с.].

Современная стратегия очистки окружающей среды с использованием биотехнологических подходов основывается, с одной стороны, на стимуляции естественной (аборигенной) микрофлоры, а с другой, - на интродукции специализированных углеводородокисляющих микроорганизмов [Плешакова Е.В., Дубровская Е.В., Турковская О.В. Приемы стимуляции аборигенной нефтеокисляющей микрофлоры//Биотехнология. - 2005. - № 1. - С.42-50; Дебабов В.Г. Интродукция генетически измененных микроорганизмов в окружающую среду// Биотехнология. - 1992. - № 6. - С.8-11].

Несмотря на то, что исследования по селекции мироорганизмов-нефтедеструкторов, пригодных для биотехнологии очистки окружающей среды, ведутся уже в течение довольно продолжительного времени, ощущается нехватка таких микроорганизмов и созданных на их основе биопрепаратов. Зачастую лишь единичные микроорганизмы-деструкторы из числа испытанных могут претендовать на дальнейшее углубленное изучение и последующее практическое применение. Важно при этом подчеркнуть следующее положение стратегии очистки окружающей среды от ксенобиотиков: начальным и ключевым звеном практически безотходной биотехнологии восстановления экологического статуса природных объектов является деятельность специализированных микроорганизмов, образующих трофические цепи и постадийно участвующих в процессе биодеструкции загрязнений [NIPER/DOE Conference. Application of microorganisms to petroleum technology//Enhan. Energy Recov. News. - 1987. - Vol.11, N 2.- P.1; Гвоздяк П.И., Подорван Н.И., Гвоздяк Н.П. Использование бактерий для отделения нефти от твердых частиц// Микробиол. журн. - 1990. - Т. 52, № 5. - С.38-42]. Такие специализированные микроорганизмы, как свидетельствует практика микробиологических исследований, выделяются из природных объектов, длительное время загрязненных нефтью и нефтепродуктами, довольно редко. Как правило, изучаемые пробы (почва, вода и т.д.) после отделения от твердых частиц и примесей и дополнительной процедуры очистки и обогащения для выделения микроорганизмов высевают на плотные питательные среды на основе белковых гидролизатов или перевара Хоттингера [Турковская О.В., Игнатов В.В. Роль микробиологии в разработке приемов рекультивации нефтезагрязненных почв//Фундаментальные и прикладные исследования саратовских ученых для процветания России и Саратовской губернии: Материалы научн. конф., посвященной 275-летию РАН. - 23-25 марта 1999 г. - Саратов: Изд-во СГУ, 1999. - С.276-278; Турковская О.В., Игнатов В.В. Загрязнение окружающей среды нефтью и нефтепродуктами: проблемы и пути решения//Тезисы научн. конф. «Нефтегазовая отрасль на пороге XXI века». - 17-18 августа 1999 г. - Саратов, 1999. - С.25-27]. Часто в качестве селективных используют питательные среды на основе различных сочетаний солей, в которые после стерилизации вносят нефтепродукты [Гурба А.В., Воробьева Т.И., Винаров А.Ю. Минеральная основа среды для выращивания микроорганизмов-биодеструкторов нефтезагрязнений. Медицинская промышленность и биотехнология. Наука. Производство. Маркетинг. - М.: Фарминдустрия, 1992. - Вып.5-6. - С.17-20; Турковская О.В., Шуб Г.М., Иосипенко А.Д. Способ выявления микроорганизмов-деструкторов неионогенных поверхностно-активных веществ/ А.с. СССР. № 1507794. Способ выявления микроорганизмов-деструкторов неионогенных поверхностно активных веществ, опубл. 15.09.1989; Process for cultivating microorganisms on hydrocarbons/ Deschamps A., Franckowiack S., Gatellier C. et al. Пат. GB № 1284799, опубл. 09.08.1972; Lee S., Cutright T.J. Nutrient medium for the bioremeditation of polycyclic aromatic hydrocarbon-contaminated soil/ Пат. US № 5508194, опубл. 16.04.1996].

Аналогичный подход предложен для селекции ассоциаций микроорганизмов-деструкторов токсических веществ в высококонцентрированных сточных водах [Гвоздяк П.И., Загорная И.Б., Никоненко В.У., Чеховская Т.П. А.с. СССР № 1409657, Способ селекции ассоциаций микроорганизмов-деструкторов].

Известен способ селекции углеводородокисляющих бактерий в жидкой минеральной среде с добавлением нефти с последующим отбором культур для пересева через 5, 10 и 15 дней [Сатубалдин К.К., Салангинас Л.А., патент RU № 2241745. Способ выделения деструкторов нефти и нефтепродуктов, опубл. 10.12.2004].

Выделенные из природных объектов с помощью микробиологических методов и питательных сред микроорганизмы-деструкторы при испытании часто оказываются неспособными активно утилизировать углеводороды нефти и в дальнейшем не используются, а пополняют коллекции технофильных микроорганизмов. В то же время есть свидетельства того, что процесс утилизации субстратов, в частности, углеводородов, в окружающей среде может находится под регуляторным контролем поступающих в среду легкометаболизируемых углеводов [Регуляторное действие глюкозы на активность углеводородокисляющих микроорганизмов в почве/ Гузев B.C., Халимов Э.М., Волде М.И., Куличевская И.С.//Микробиология. - 1997. - Т.66, № 2. - С.154-159]. Так глюкоза, внесенная в питательную среду в концентрации до 1,0 мг/мл, может на порядок увеличить численность углеводородокисляющих бактерий, тогда как более высокие дозы углевода значительно ингибируют этот процесс. Обнаружено также, что в почве катаболитная репрессия синтеза ферментов деградации имеет пролонгированный характер: после утилизации мономера (глюкозы) разложение растительных полимеров на значительное время задерживается, вопреки классическим представлениям о диауксическом росте [Эффект задержки в регуляции микробного разложения полимеров в почве по типу катаболитной репрессии/ Гузев B.C., Бызов Б.А., Звягинцев Д.Г., Звягинцев Н.Д.//Изв. АН СССР. Сер. биол. - 1986. - № 6. - С.834-841]. Добавленная в избыточных количествах в питательную среду с дефицитом источников минерального питания глюкоза снижает метаболическую активность микроорганизмов до минимального уровня, и у них развивается так называемое состояние «отмирания, вызванного субстратом» или «субстратной смерти» [Calcott P.M., Postage J.R. On substrate accelerated death in Klebsiella aerogenes// J. Gen. Microbiol. - 1971. - Vol.70, N 1. - P.115-122].

Относительно механизма отрицательного действия глюкозы на углеводородокисляющие микроорганизмы известно то, что данное свойство углевода связно не с некими токсичными продуктами его метаболизма, а с регуляцией экспрессии генов, кодирующих определенные ферменты [Перт С.Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток/Пер. с англ. - М.: Мир, 1978. - 332 с.]. Предполагается, что тот или иной уровень экспрессии генов определяет отрицательную обратную связь концентрации глюкозы (≥600 мг/л) с процессом утилизации ксенобиотика. При указанной концентрации глюкозы в среде культивирования было обнаружено как угнетение синтеза белков транспортной системы микроорганизма, так и нарушение регуляции активности этой системы путем активации-инактивации ее белков [Коронелли Т.В. Липиды микобактерий и родственных микроорганизмов. - М.: Изд-во МГУ, 1984. - 160 с.; Барышникова Л.М., Чемерис Н.А., Головлев Е.Л. Глюкозный эффект в регуляции транспорта глюкозы клетками Rhodococcus minimus// Микробиология. - 1994. - Т.63, вып.3. - С.405-410]. С учетом данных литературы о влиянии глюкозы на активность углеводородокисляющих микроорганизмов становится очевидной необходимость включения этого углевода в небольших количествах в питательную среду. О важности этого углевода свидетельствует опубликованные результаты по конструированию биопрепарата для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов, в состав которого входит глюкоза (от 0,9 до 1,0 мас.%) [Сваровская Л.И., Писарева С.И., Алтунина Л.К. Патент RU № 2361686, Биопрепарат для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов, опубл. 20.07.2009].

Недостатком существующих питательных сред является их изначальное предназначение для выделения микроорганизмов вообще из образцов почвы и воды, контактирующих с нефтью и нефтепродуктами, либо для стимуляции аборигенной микрофлоры при ремедиации почвы, а также для активации нефтеокисляющих микроорганизмов при нефтедобыче. Такие питательные среды в принципе не могут быть использованы для выявления в популяции выделенных микроорганизмов клонов с повышенной деструктивной активностью, перспективных для использования в биотехнологических целях. В этой связи важно подобрать такой компонентный состав питательной среды, который бы обеспечил рост активных нефтеокисляющих микроорганизмов-деструкторов, биомасса которых может быть использована для глубинного выращивания в ферментерах на ее основе, а также для лиофильного высушивания и получения маточных культур коллекционных линий микроорганизмов-деструкторов нефти и нефтепродуктов.

Наиболее близкой к заявляемой является питательная среда, предназначенная для выращивания микроорганизмов-продуцентов биосурфактантов, нашедших практическое использование в процессе повышения нефтеотдачи [Brown M.L., Moses V. Surfactants and their use/Патент GB № 2172898, опубл. 01.10.1986]. Питательная среда имеет следующий состав (оригинальная пропись среды № 2, г/л):

калий азотнокислый (КNO₃) 2,0 калий фосфорнокислый двузамещенный (К₂НРO₄) 0,5 кальций хлористый (CaCl₂·6H₂O) 0,1 магний хлористый (MgCl₂·6Н₂О) 2,0 аммоний хлористый (NH₄Cl) 1,0 железо сернокислое (FeSO₄·7H₂O) 0,003 аскорбиновая кислота (С₆Н₈О₆) 0,1 тиогликолевая кислота (HSCH₂COOH) 0,1 дрожжевой экстракт 1,0 глюкоза 20,0 агар-агар 15,0 дистиллированная вода остальное рН 7,4 ед. рН

Общим с заявляемой прописью питательной среды является минеральная основа агаризованной среды и глюкоза (20,0 г/л). Стимуляция роста микроорганизмов-продуцентов биосурфактантов обеспечивается также включением в пропись питательной среды дрожжевого экстракта. Глюкоза в указанной концентрации не позволяет использовать питательную среду для скрининга высокоактивных углеводородокисляющих микроорганизмов.

Выбор питательной среды оригинальной прописи №2 связан с тем, что микроорганизмы-продуценты биосурфрактантов клонизируют нефтяные горизонты, обладают способностью утилизировать углеводороды нефти, используя последние для биосинтеза биосурфрактанта, облегчающего нефтеотдачу. В популяции таких микроорганизмов с использованием микробиологических методов и соответствующей питательной среды можно обнаружить микроорганизмы с повышенной деструктивной активностью.

Задачей изобретения является конструирование плотной питательной среды, обеспечивающей рост и размножение популяций природных и коллекционных штаммов углеводородокисляющих бактерий, обладающих повышенной деструктивной способностью.

Технический результат, который может быть достигнут при использовании предлагаемой питательной среды - возможность выращивания бактерий любого вида и рода, содержащих наследуемые генетические детерминанты биодеструкции углеводородов нефти перспективных для создания на их основе биопрепаратов для очистки и рекультивации нефтезагрязненной почвы.

Указанная задача решена разработкой прописи плотной питательной среды на основе необходимого и достаточного количества минеральных веществ с включением в ее состав глюкозы и нефти и специальным образом обработанной с использованием ультразвука.

Разработанная плотная питательная среда успешно апробирована в процессе изучения свойств коллекционных штаммов и природных изолятов, относящихся к родам Pseudomonas, Rhodococcus, Alcaligenes, Brevibacterium, Micrococcus, позволивший выявить от 20 до 50% клонов в популяции исследованных культур, вообще не способных расти на среде и утилизировать углеводороды нефти. Отобранные с использованием предлагаемой плотной питательной среды клоны способны ассимилировать углеводороды нефти в качестве единственного источника углерода. Биомасса таких клонированных микроорганизмов при росте на плотной питательной среде с нефтью в 13-14 раз выше по сравнению с биомассой исходной популяции углеводородокисляющих бактерий. Плотная питательная среда для выращивания углеводородокисляющих бактерий с повышенной деструктивной способностью содержит солевую основу: натрий хлористый, аммоний фосфорнокислый однозамещенный, калий фосфорнокислый двузамещенный и магний сернокислый, а также агар-агар, нефть и глюкозу, при следующем количественном соотношении компонентов, г/л:

натрий хлористый (NaCl) 5,0 аммоний фосфорнокислый однозамещенный (NH₄H₂PO₄) 1,0 калий фосфорнокислый двузамещенный (К₂НРO₄) 1,0 магний сернокислый (MgSO₄·7Н₂О) 0,2 агар-агар 15,0 нефть 5,0 глюкоза 1,0 дистиллированная вода остальное рН 7,2-7,4 ед. рН

Приготовление плотной питательной среды для выращивания углеводородокисляющих бактерий с повышенной деструктивной способностью осуществляют следующим образом. Навеску солей растворяют в дистиллированной воде и устанавливают рН 7,5. Солевую основу и агар-агар стерилизуют автоклавированием (температура 121±1°С, давление пара 1,2-1,5 атм) в течение 15 мин. Сразу после автоклавирования к агаризованной солевой основе добавляют 1,0 г глюкозы, предварительно растворенной в 5,0 мл дистиллированной воды и стерилизованной фильтрованием через микропористый фильтр (размер пор 0,2 мкм), 5,0 г сырой нефти и в горячем виде подвергают обработке ультразвуковом на ультразвуковом низкочастотном диспергаторе при рабочей частоте 35±1 кГц в течение 2-2,5 мин. Полученную суспензию, содержащую эмульгированную нефть, разливают в стандартные чашки Петри. После охлаждения питательная среда с нефтью и глюкозой готова к использованию.

Обработка разогретой в процессе автоклавирования питательной среды после внесения глюкозы и нефти ультразвуком позволяет получить гомогенную, нерасслаивающуюся эмульсию агаризованной среды с нефтью, которая после охлаждения обеспечивает рост нефтеокисляющих микроорганизмов и позволяет характеризовать колонии по морфологическим признакам.

Положительной характеристикой заявляемой питательной среды является наличие в ее составе глюкозы. Учитывая регуляторное влияние глюкозы на активность углеводородокисляющих бактерий, содержащая ее плотная питательная среда с нефтью позволяет существенно расширить возможности получения биомассы микроорганизмов-деструкторов нефтезагрязнений, обладающих повышенной активностью. Глюкоза не оказывает отрицательного влияния на качество плотной питательной среды по физико-химическим и биологическим свойствам.

Разработанная питательная среда с успехом использована для выращивания углеводородокисляющих бактерий различных таксономических групп для последующего их лиофильного высушивания и в качестве посевного материала для глубинного культивирования в ферментерах и создания биопрепаратов на их основе.

Пример 1

Готовят навеску солевой основы при следующем количественном соотношении компонентов, г/л:

натрий хлористый (NaCl) 5,0 аммоний фосфорнокислый однозамещенный (NН₄Н₂РO₄) 1,0 калий фосфорнокислый двузамещенный (К₂НРO₄) 1,0 магний сернокислый (MgSO₄·7H₂O) 0,2

Навеску солей растворяют в 975,0 мл дистиллированной воды в колбе и устанавливают рН 7,5. Добавляют в колбу 15,0 г агар-агара, выдерживают 30 мин при комнатной температуре для его набухания. Солевую основу и агар-агар стерилизуют автоклавированием при температуре 121±1°С и давлении пара 1,2-1,5 атм в течение 15 мин. Готовят стерильный раствор глюкозы, растворяя 1,0 г углевода в 5,0 мл дистиллированной воды, стерилизуют фильтрованием через микропористый фильтр (размер пор 0, 2 мкм). Сразу после автоклавирования к агаризованной солевой основе добавляют 5,0 мл стерильного раствора глюкозы и 5,0 г сырой нефти, подвергают обработке ультразвуком при рабочей частоте 35±1 кГц в течение 2-2,5 мин до формирования гомогенной суспензии. Полученную суспензию разливают в чашки Петри и оставляют на 1 ч для остывания питательной среды. На затвердевшую поверхность питательной среды с нефтью в чашках Петри наносят методом отпечатков предварительно выращенные на агаре Хоттингера колонии бактерий Alcaligenes xylosoxidans ssp.xylosoxidans. Чашки Петри с посевами бактерий на питательную среду с нефтью инкубируют при температуре 37±1°С. Через 24 ч инкубации исследуют популяционный состав бактерий A. xylosoxidans ssp.xylosoxidans по способности расти на питательной среде с нефтью и, соответственно, утилизировать углеводороды нефти с последующим отбором искомых колоний бактерий с повышенной деструктивной способностью.

Пример 2

Готовят навеску солевой основы при следующем количественном соотношении компонентов, г/л:

натрий хлористый (NaCl) 5,0 аммоний фосфорнокислый однозамещенный (NН₄Н₂РO₄) 1,0 калий фосфорнокислый двузамещенный (К₂НРO₄) 1,0 магний сернокислый (MgSO₄·7H₂O) 0,2

Навеску солей растворяют в 975,0 мл дистиллированной воды в колбе и устанавливают рН 7,5. Добавляют в колбу 15,0 г агар-агара, выдерживают 30 мин при комнатной температуре для его набухания. Солевую основу и агар-агар стерилизуют автоклавированием при температуре 121±1°С и давлении пара 1,2-1,5 атм в течение 15 мин. Готовят стерильный раствор глюкозы, растворяя 1,0 г углевода в 5,0 мл дистиллированной воды, стерилизуют фильтрованием через микропористый фильтр (размер пор 0, 2 мкм). Сразу после автоклавирования к агаризованной солевой основе добавляют 5,0 мл стерильного раствора глюкозы и 5,0 г сырой нефти, подвергают обработке ультразвуком при рабочей частоте 35±1 кГц в течение 2-2,5 мин до формирования гомогенной суспензии. Полученную суспензию разливают в чашки Петри и оставляют на 1 ч для остывания питательной среды. На затвердевшую поверхность питательной среды с нефтью в чашках Петри наносят методом отпечатков предварительно выращенные на агаре Хоттингера колонии бактерий Rhodococcus erythropolis. Чашки Петри с посевами бактерий на питательную среду с нефтью инкубируют при температуре 28±1°С. Через 48 ч инкубации исследуют популяционный состав бактерий R. erythropolis по способности расти на питательной среде с нефтью и, соответственно, утилизировать углеводороды нефти с последующим отбором искомых колоний бактерий с повышенной деструктивной способностью.

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии. В состав среды входит (г/л): солевая основа: натрий хлористый 5,0, аммоний фосфорнокислый однозамещенный 1,0, калий фосфорнокислый двузамещенный 1,0, магний сернокислый 0,2, а также агар-агар 15,0, нефть 5,0 и глюкоза 1,0, дистиллированная вода - остальное. Плотная питательная среда расширяет арсенал методических подходов для выращивания микроорганизмов с повышенной способностью утилизировать углеводороды нефти, перспективных для создания на их основе биопрепаратов, предназначенных для очистки окружающей среды от нефтезагрязнения. Микроорганизмы, выращенные на плотной питательной среде, являются типичными по культурально-морфологическим и биохимическим характеристикам.

Питательная среда для выращивания углеводородокисляющих бактерий с повышенной деструктивной способностью, содержащая солевую основу: натрий хлористый, аммоний фосфорно-кислый однозамещенный, калий фосфорно-кислый двузамещенный и магний серно-кислый, а также агар-агар, нефть и глюкозу, при следующем количественном соотношении компонентов, г/л:
натрий хлористый (NaCl) 5,0 аммоний фосфорно-кислый однозамещенный (NH₄H₂PO₄) 1,0 калий фосфорно-кислый двузамещенный (К₂НРO₄) 1,0 магний серно-кислый (MgSO₄·7H₂O) 0,2 агар-агар 15,0 нефть 5,0 глюкоза 1,0 дистиллированная вода остальное

рН 7,2-7,4 ед. рН
полученная внесением солевой основы и агар-агара в дистиллированную воду, стерилизацией автоклавированием при температуре 121±1°С и давлении пара 1,2-1,5 атм в течение 15 мин, добавлением в растопленную агаризованную основу раствора глюкозы и нефти и последующей обработкой ультразвуком при рабочей частоте 35±1 кГц в течение 2-2,5 мин до формирования гомогенной суспензии.