Консорциум микроорганизмов, предназначенный для улучшения роста растений Российский патент 2023 года по МПК A01N63/20 C05F17/00 

Область техники

Изобретение относится к области сельского хозяйства и применяется в качестве микробиологического удобрения для внесения в почву перед посевом (посадкой), для предпосевной обработки семян и внесения в подкормку под все сельскохозяйственные культуры и декоративные насаждения на различных типах почв.

Уровень техники

Известен состав для осуществления способа усиления роста растения (патент РФ №2659000, дата публикации 26.06.2018г.). Состав содержит носитель и один или несколько флавоноидов. При применении жидкого носителя жидкий носитель может дополнительно включать ростовую среду для культивирования одного или нескольких микробных штаммов и содержать один или несколько полезных с сельскохозяйственной точки зрения ингредиентов, в том числе, один или несколько полезных микроорганизмов. При этом один или несколько полезных микроорганизмов включают один или несколько фосфат-солюбилизирующих микроорганизмов. Фосфат-солюбилизирующие микроорганизмы включают грибковые и бактериальные штаммы. В одном из вариантов осуществления фосфат-солюбилизирующим микроорганизмом являются микроорганизмы, выбранные из группы, состоящей, в том числе, из Bacillus amyloliquefaciens и Bacillus subtilis. В одном варианте осуществления композиции, описанные в данном документе, могут дополнительно содержать один или несколько фунгицидов. Фунгициды, пригодные для композиций, могут представлять собой биологические фунгициды, химические фунгициды или их комбинации. В конкретных вариантах осуществления биологическим фунгицидом может являться бактерия из рода, в том числе, Flavobacterium.

Недостатком известного технического решения является недостаточное ускорение роста растений.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) является способ обработки растений для улучшения свойств растения и средство для его осуществления (патент РФ №2615834, дата публикации 11.04.2017г.). Способ обработки растений для улучшения свойств растения способствует более хорошему росту, или увеличению сбора урожая, или интенсивному развитую корневой системы, или увеличению площади листьев, или увеличению интенсивности озеленения, или получению более сильных побегов. Согласно способу, средство для его осуществления наносят на растения и части растений или на их окружающую среду, место обитания или место хранения. Средство для осуществления способа содержит флуопирам, спорообразующую бактерию рода Bacillus, по меньшей мере один биологический контролирующий агент, при условии, что спорообразующая бактерия рода Bacillus и биологический контролирующий агент не являются идентичными. Спорообразующая бактерия рода Bacillus выбрана из группы, включающей, в том числе, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis. По меньшей мере один биологический контролирующий агент выбран из группы, включающей бактерии, грибы или дрожжи, простейшие, вирусы, энтомопатогенные нематоды, инокулянты, растительное сырье, и гарпин (продуцируемый Erwinia amylovora). В частном случае по крайней мере один биологический контролирующий агент выбран из группы, включающей, в том числе, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Azospirillum brasilense, Azotobacter chroococcum.

Недостатком прототипа является недостаточная скорость прироста растений.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является увеличение скорости роста растений.

Поставленный технический результат достигается за счёт того, что консорциум предназначенный для улучшения роста растений сформирован из штаммов микроорганизмов Bacillus subtilis-8 ВКПМ В-5251, Bacillus amiloliquefacienc ВКПМ В-11265, Flavobacterium arborescens L-30 ВКПМ В-1847, Azospirillum brasilense S94-3 ВКПМ В-7501, Azotobacter chroococcum BКПМ-3173.

Раскрытие изобретения

Консорциум - это сообщество двух или более микроорганизмов, которое существует как единое целое, связанное цепями питания и микроэкологией (https://nauchkor.ru/uploads/documents/5f3f2860cd3d3e000153d06c.pdf, с.6, дата обращения 20.10.21г.), совокупность различных взаимозависимых организмов, выступающих как единое целое при использовании определённого субстрата, согласно определению, приведённому в Словаре микробиологии на сайте https://dic.academic.ru/dic.nsf/dic_microbiology/535, дата обращения 16.03.2021г. Между микроорганизмами в составе консорциума существуют различные формы взаимоотношений, которые позволяет сохранять на протяжении определённого времени устойчивый симбиоз и равновесие в составе этого консорциума.

Микроорганизмы, используемые в составе данного консорциума депонированы во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (далее по тексту именуемой - ВКПМ).

В состав консорциума микроорганизмов, предназначенного для улучшения роста растений (далее именуемого иногда - консорциум микроорганизмов), входят следующие штаммы: Bacillus subtilis-8 ВКПМ В-5251, Bacillus amiloliquefacienc ВКПМ В-11265, Flavobacterium arborescens L-30 ВКПМ В-1847, Azospirillum brasilense S94-3 ВКПМ В-7501, Azotobacter chroococcum BКПМ-3173.

Штамм, согласно Энциклопедического словаря на сайте https://dic.academic.ru/dic.nsf/es/65494/штамм, дата обращения 07.10.2021г., это чистая культура микроорганизмов одного вида, выделенная из какого-либо источника и обладающая особыми свойствами.

Штамм Bacillus subtilis-8 депонирован во ВКПМ с регистрационным номером в коллекции ВКПМ В-5251. Штамм Bacillus subtilis-8 ВКПМ В-5251 выделен из почвы Московской области, город Сергиев Посад.

Питательная среда для культивирования Bacillus subtilis-8 ВКПМ В-5251 - мясопептонный бульон (далее по тексту именуемый МПБ).

Питательная среда для хранения Bacillus subtilis-8 ВКПМ В-5251 (агаризованная питательная среда) - мясопептонный агар (далее по тексту именуемый МПА).

Морфология Bacillus subtilis-8 ВКПМ В-5251: клетки палочковидные с закруглёнными концами, одиночные или соединены попарно. Клетки подвижны, размеры (0,49-0,76)×(2,07-3,30)мкм, спорообразующие. Колонии округлые, поверхность складчатая, с кратером посередине, бежево-серого цвета, край волнистый.

Bacillus subtilis-8 ВКПМ В-5251 представляет собой штамм - продуцент биофунгицида, обладает активностью в отношении фитопатогенных грибов из родов Fusarium, Microdochium, Pyrenophora, Botrytis, Alternaria и Rhizoctonia, а также обеспечивает синтез cубтилина и витаминов группы «В». Bacillus subtilis-8 ВКПМ В-5251 не является патогенным, экологически не токсичен.

Роль Bacillus subtilis-8 ВКПМ В-5251 в данном консорциуме - подавляет развитие фитопатогенных грибов, вызывающих заболевания растений.

Штамм Bacillus amyloliquefaciens депонирован во ВКПМ, регистрационный номер коллекции ВКПМ В-11265. Bacillus amiloliquefacienc ВКПМ В-11265 из ризосферы яровой пшеницы, произрастающей в Гафурийском районе республики Башкортостан.

В качестве питательной среды для культивирования Bacillus amiloliquefacienc ВКПМ В-11265 может быть применена МПА, культивируют при температуре 30°С.

Питательная среда для хранения Bacillus amiloliquefacienc ВКПМ В-11265 (агаризованная питательная среда) - МПА.

Морфология Bacillus amiloliquefacienc ВКПМ В-11265 - клетки штамма представляют собой грамположительные аэробные спорообразующие прямые палочки с закруглёнными концами размером (1,5-2,5)×(0,5-0,7)мкм, располагаются, как правило, парами или одиночно, цепочки встречаются реже, колонии телесного цвета, округлой формы, с ребристыми краями, матовые. При спорообразовании клетки не раздуваются. Споры эллипсовидные, расположены центрально.

Bacillus amiloliquefacienc ВКПМ В-11265 представляет собой штамм - продуцент биофунгицида, обладает активностью в отношении фитопатогенных грибов Claviceps purpurea (возбудитель спорыньи), Rhizopus stolonifer, Cercospora beticola, Passalora fulva, а также обеспечивает синтез брассинолида и катастерона. Bacillus amiloliquefacienc ВКПМ В-11265 является продуцентом протеазы. Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-11265 не является патогенным, экологически безопасен.

Роль Bacillus amiloliquefacienc ВКПМ В-11265 в данном консорциуме: штамм оказывает влияние на фитопатогены путём синтеза веществ, ограничивающих их рост, эти вещества способны индуцировать системную устойчивость растения к широкому спектру возбудителей болезней.

Штамм Flavobacterium arborescens L-30 депонирован во ВКПМ, регистрационный номер коллекции ВКПМ В-1847. Происхождение Flavobacterium arborescens L-30 ВКПМ В-1847: сточная вода при очистке из анилина, может быть также выделен из эпифитного микробиоценоза апикальной части корня риса.

Условия культивирования штамма Flavobacterium arborescens L-30 ВКПМ В-1847: L-среда (состав: дрожжевой экстракт - 5,0г, пептон - 15,0г, NaCl - 5,0г, агар - 15,0г, вода дистиллированная - 1,0л или иные количества, в зависимости от требуемого общего объёма) температура 28°С.

Питательная среда для хранения Flavobacterium arborescens L-30 ВКПМ В-1847 (агаризованная питательная среда) - L-среда.

Штамм Flavobacterium arborescens L-30 ВКПМ В-1847 представляет собой клетки палочковидной формы, споры не образуют, неподвижны. Колонии на капустном агаре ризоидной формы, диаметром до 3мм, плоские, блестящие, оранжевые, гладкие, края неровные. Культура использует минеральный и органический азот, желатин не разжижает, слабый рост на средах с углеводами (лактоза, арабиноза) с подкислением, способен гидролизовать крахмал, при температуре 37°С рост отсутствует, каталазоположительны, представляют собой факультативный анаэроб. Температурный интервал роста Flavobacterium arborescens L-30 ВКПМ В-1847 (22-30)°С. Оптимальная температура для роста и размножения данного штамма (25-28)°С.

Flavobacterium arborescens L-30 ВКПМ В-1847 является активным продуцентом физиологически активных веществ (индолил-3-молочной кислоты (далее по тексту - ИМК), индолил-3-карбоновой кислоты (далее по тексту - ИКК), индолил-уксусной кислоты (далее по тексту - ИУК)).

В данном консорциуме Flavobacterium arborescens L-30 ВКПМ В-1847 синтезирует ряд антибиотиков феназинового типа, которые подавляют рост и развитие фитопатогенных грибов рода Fusarium и ингибирует развитие патогенной микрофлоры. Flavobacterium arborescens L-30 ВКПМ В-1847 не является патогенным, экологически безопасен.

Штамм Azotobacter chroococcum депонирован во ВКПМ под регистрационным номером в коллекции BКПМ-3173. Azotobacter chroococcum BКПМ-3173 выделен из городской почвы по адресу улица Тимирязевская, дом 52, город Москва.

Питательная среда для культивирования Azotobacter chroococcum BКПМ-3173: среда Эшби или среда состава, мас.%: меласса - 3,0; К₂HPO₄ - 0,03; MgSO₄ - 0,03; NaCl - 0,05; К₂SO₄ - 0,02; Fe₂Cl₃ - 0,001; СаСО₃ - 0,5.

Питательная среда для хранения Azotobacter chroococcum BКПМ-3173 (агаризованная питательная среда): (мас.%) КН₂PO₄ - 0,05; MgSO₄ - 0,03; NaCl - 0,03; Fe₂(SO₄)₃ - 0,0005; MnSO₄ - 0,0005; (NH₄)₂MoO₇ - 0,0005; СаСО₃ - 0,35; меласса - 3,0; агар - 2,0.

Морфология Azotobacter chroococcum BКПМ-3173: при микроскопировании клетки мелкие палочки, слабоподвижные; зрелые клетки - мелкие палочки, кокковидной формы, неподвижные, образуют толстостенные цисты.

Azotobacter chroococcum BКПМ-3173 подавляет рост грибов Alternaria sp., Pythium de Baryanum, Fusarium oxysporum, Fusarium vasinfectum, Fusarium moniliforme, Fusarium lini, Cladosporium sp., Scolecotrychum sp., Helmintosporium sativum, Botrytis sp., Verticillium dahliae и бактерий Rhizoctonia sp., Puccinia triticina, Septoria graminum. Обладает высокой нитрогеназной активностью, способностью к синтезу индолино-уксусной кислоты.

Роль Azotobacter chroococcum BКПМ-3173 в данном консорциуме: штамм обеспечивает формирование оптимальной корневой системы растения применительно к условиям, в которых оно находится (частота посадки, свойства почвы, наличие влаги и т.п.). Azotobacter chroococcum BКПМ-3173 оказывает положительное воздействие на аборигенную микрофлору, повышает ферментативную активность и плодородие почв.

Azotobacter chroococcum BКПМ-3173 не является патогенным, экологически безопасен.

Штамм Azospirillum brasilense S94-3 депонирован по ВКПМ под регистрационным номером ВКПМ В-7501. Azospirillum brasilense S94-3 ВКПМ В-7501 выделен из ризосферы кукурузы.

Питательная среда для культивирования Azospirillum brasilense S94-3 ВКПМ В-7501: питательная среда, используемая для культивирования микроорганизмов в Американской коллекции типовых культур, с составом (г/л): KH₂PO₄ - 0,4; K₂HPO₄ - 0,1; MgSO₄⋅7H₂O - 0,2; NaCl - 0,1; СаС1₂ - 0,02; FeCl₃ - 0,01; Na₂MoO₄⋅2H₂O - 0,002; малат натрия - 5,0; дрожжевой экстракт - 0,05; глюкоза - 5,0; вода дистиллированная - до 1л; рН 7,0.

Питательная среда для хранения Azospirillum brasilense S94-3 ВКПМ В-7501 (агаризованная питательная среда): картофельный агар (далее по тексту КА), состав: отвар объёмом 1л, полученный из 200г очищенного картофеля, полученный на водопроводной воде 1л, с добавлением 20г агара, 1мл 1% спиртового раствора конго красного.

Морфология Azospirillum brasilense S94-3 ВКПМ В-7501: клетки короткие прямые палочки, по Граму окрашиваются отрицательно, обладают характерным винтообразным движением. Внутри клеток накапливаются гранулы поли-β-гидроксибутирата.

Azospirillum brasilense S94-3 ВКПМ В-7501 способен фиксировать атмосферный азот, о чём свидетельствует нитрогеназная активность, выявляемая ацетиленовым методом.

Роль Azospirillum brasilense S94-3 ВКПМ В-7501 в данном консорциуме: штамм стимулирует развитие корневой системы и увеличивает ее всасывающую способность. Azospirillum brasilense S94-3 ВКПМ В-7501 усиливает поглощение растением NPK. Azospirillum brasilense S94-3 ВКПМ В-7501 мобилизует из почвы труднодоступные элементы питания.

Azospirillum brasilense S94-3 ВКПМ В-7501 не является патогенным, экологически безопасен.

Осуществление изобретения

Изобретение реализуется следующим образом.

Далее приведён пример реализации изобретения.

Сначала выращивают штаммы Bacillus subtilis-8 ВКПМ В-5251, Bacillus amiloliquefacienc ВКПМ В-11265, Flavobacterium arborescens L-30 ВКПМ В-1847, Azospirillum brasilense S94-3 ВКПМ В-7501, Azotobacter chroococcum BКПМ-3173 на агаризованной питательной среде (твердофазное культивирование).

Готовят для каждого из штаммов (культур) Bacillus subtilis-8 ВКПМ В-5251, Bacillus amiloliquefacienc ВКПМ В-11265, Flavobacterium arborescens L-30 ВКПМ В-1847, Azospirillum brasilense S94-3 ВКПМ В-7501, Azotobacter chroococcum BКПМ-3173 агаризованную питательную среду. Описание агаризованной питательной среды для каждого штамма приведено выше. Полученные агаризованные питательные среды стерилизуют в течении 30 минут (при повышенном давлении 1,0атм или 0,5атм).

После стерилизации агаризованную питательную среду для каждого штамма помещают в отдельную стерильную посуду (стерильные чашки Петри и/или стерильные пробирки). Агаризованные питательные среды разливают горячими. Полученные чашки Петри и/или пробирки с агаризованными питательными средами оставляют на 6 часов для застывания.

Далее осуществляют посев каждой отдельной культуры в чашку Петри и/или пробирку с застывшей агаризованной питательной средой, подготовленной для этой культуры. Посев осуществляют микробиологической петлёй, методом штриха в чашки Петри и/или пробирки с застывшей агаризованной средой. Затем полученные чашки Петри и/или пробирки с культурами (штаммами) инкубируют 48 часов в термостате при 28°С.

Далее проводят оценку качества (культурально-морфологических свойств) культур (проверяется отсутствие загрязнений).

Для осуществления оценки качества берут односуточные культуры, выращенные на агаризованных питательных средах. Смывом с использованием 0,9% раствора NaCl переносят каждую культуру в отдельную стерильную пробирку. Полученные в результате смыва культуральные жидкости отбирают в объёме 0,1 мл каждой. Далее посредством микроскопирования оценивают наличия посторонней микрофлоры с каждой из культуральных жидкостей. Концентрацию микроорганизмов определяют в камере Горяева. Концентрация бактериальных культур должна составлять не менее 1,0×10¹⁰ клеток/мл.

Затем выращивают необходимое количество культур на питательных средах для культивирования (жидкой среде). Берут культуры, выращенные на агаризованных питательных средах. Для каждой культуры готовят отдельную питательную среду для культивирования. Описание сред для культивирования каждого штамма приведено выше.

В стерильную посуду для культивирования (далее - стерильный матрас) объёмом 1 л вносят 250 мл питательной среды для культивирования одной культуры. При этом для каждой культуры подготавливают отдельные стерильные матрасы с соответствующей этой культуре питательной средой для культивирования. Полученные стерильные матрасы с питательными средами для культивирования автоклавируют при повышенном давлении 1,0 атм или 0,5 атм в течение 30 минут.

Каждую культуру засевают в отдельный матрас с соответствующей этой культуре питательной средой для культивирования. При этом соблюдают соотношение: в 1 матрас вносят не менее 1,0×10⁹ клеток микроорганизмов. Культивирование всех культур проводят микроаэрофильно в течение 2-4 суток при 28°С.

Далее производят оценку качества каждой из культур (количество жизнеспособных клеток). Из каждого матраса стерильно отбирают 0,1 мл образца выращенной в нём культуральной жидкости. Полученные образцы каждой культуральной жидкости подвергают окрашиванию флюоресцентным красителем пропидий иодидом. Флюоресцентный краситель пропидий иодид окрашивает только микроорганизмы с нарушенной проницаемостью за счёт проникновения внутрь и взаимодействия с нуклеиновыми кислотами. Данный метод позволяет окрасить только мёртвые и повреждённые микроорганизмы. Далее производят микроскопирование образца каждой культуральной жидкости. Количество жизнеспособных клеток должно составлять более 98% от общего числа клеток бактериальной культуры.

Консорциум микроорганизмов формируют путём объединения культур, выращенных на питательных средах для культивирования. Для формирования консорциума из каждого матраса стерильно отбирают необходимый объём выращенной в нём культуральной жидкости и переносят в посуду для смешивания (бутылку). В частном случае, например, объёмы культуральных жидкостей в смеси составляют для Bacillus subtilis ВКПМ В-5251 - 0,25 л, Bacillus amiloliquefacienc ВКПМ В-11265 - 0,25 л, Flavobacterium arborescens ВКПМ В-1847 - 0,1 л, Azospirillum brasilense ВКПМ В-7501 - 0,2 л, Azotobacter chroococcum BКПМ-3173 - 0,2 л, всё перемешивают.

Очистка полученного биопрепарата не требуется.

В полученном биопрепарате содержание микроорганизмов составляет не менее 1,0×10⁹ клеток/мл.

Ёмкости с биопрепаратом хранят в закрытых складских помещениях, исключающих попадание атмосферных осадков, прямых солнечных лучей и грунтовых вод, в местах недоступных для детей, отдельно от пестицидов. Ёмкости с биопрепаратом хранят при комнатной температуре (20-25)°С до 12 месяцев, а при температуре от +4°С до +15°С - до 18 месяцев. Не допускается хранение ёмкостей с биопрепаратом ниже +4°С и выше плюс +25°С. При хранении следует избегать контакта с щелочами, кислотами и нефтепродуктами.

Для внесения биопрепарата используют в сельскохозяйственном производстве типовые и специальные технические средства, предназначенные для выполнения такого типа работ.

Обработку растений проводят рабочим раствором, приготовленным на основе биопрепарата. Для приготовления рабочего раствора используют нехлорированную воду, с температурой (20-25)°С. При приготовлении рабочего раствора в используемую ёмкость (бак поливочной системы или опрыскивателя) наливают воду, примерно на 2/3 объёма. При включённом перемешивающем устройстве добавляют необходимое количество биопрепарата. Доливают воду до расчётного объёма. Рабочий раствор перемешивают и проводят обработку.

Предпосевную (предпосадочную) обработку семян (клубней) зерновых, зернобобовых, технических культур, картофеля следует проводить путём опрыскивания. При небольших объёмах возможно использование бетономешалок.

Семена, посадочный материал овощных, цветочно-декоративных культур замачивают в стеклянной, эмалированной, полиэтиленовой посуде, а также в ёмкостях, изготовленных из нержавеющей стали.

Для проведения некорневой подкормки растений следует использовать любые опрыскиватели. Корневые подкормки рекомендовано проводить через системы полива (капельный полив, дождевальные и другие установки).

Не рекомендуется проводить некорневые подкормки в жаркую солнечную погоду.

Нормы расхода рабочего раствора для некорневых и корневых подкормок различных культур в сельскохозяйственном производстве - общепринятые. Некоторые примеры приведены в таблице 1.

Таблица 1 Доза применения Культура, время,
особенности применения По потребности (концентрация 100мл препарата на 1л воды) Овощные, цветочно-декоративные, плодово-ягодные культуры - замачивание семян перед посевом на 8-12 часов; черенков, корневой системы рассады, саженцев - на 3-4 часа Расход рабочего раствора - до увлажнения земляного кома (концентрация 50мл препарата на 1л воды) Овощные, цветочно-декоративные культуры (рассада) - корневая подкормка растений 2-3 раза с интервалом 7-10 дней Расход рабочего раствора - 1л на 10-30м² (концентрация 20-60мл на 10л воды) Овощные культуры, картофель, земляника, цветочно-декоративные культуры - некорневая подкормка растений в течение периода вегетации 2-3 раза с интервалом 10-15 дней Расход рабочего раствора - (2-5)л на 1м² (концентрация 20-40мл на 10л воды) Овощные культуры, картофель, земляника, плодово-ягодные, цветочно-декоративные культуры - корневая подкормка растений в течение периода вегетации 1-3 раза с интервалом 10-15 дней Расход рабочего раствора - 2-5л/м² (концентрация 60-80мл на 10л воды) Травы газонные - корневая подкормка растений после скашивания

Для предотвращения попадания биопрепарата в нижние слои почвы, корневую подкормку растений проводят после основного полива.

При использовании удобрения необходимо соблюдать общие требования безопасности (в том числе применение средств индивидуальной защиты).

Таким образом, консорциум, состоящий из штаммов микроорганизмов Bacillus subtilis-8 ВКПМ В-5251, Bacillus amiloliquefacienc ВКПМ В-11265, Flavobacterium arborescens L-30 ВКПМ В-1847, Azospirillum brasilense S94-3 ВКПМ В-7501, Azotobacter chroococcum BКПМ-3173, улучшает рост растений.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой консорциум, формирующийся из штаммов микроорганизмов Bacillus subtilis-8 ВКПМ В-5251, Bacillus amiloliquefacienc ВКПМ В-11265, Flavobacterium arborescens L-30 ВКПМ В-1847, Azospirillum brasilense S94-3 ВКПМ В-7501, Azotobacter chroococcum BКПМ-3173. Изобретение позволяет улучшить рост растений. 1 табл.

Консорциум, предназначенный для улучшения роста растений, состоящий из штаммов микроорганизмов Bacillus subtilis-8 ВКПМ В-5251, Bacillus amiloliquefacienc ВКПМ В-11265, Flavobacterium arborescens L-30 ВКПМ В-1847, Azospirillum brasilense S94-3 ВКПМ В-7501, Azotobacter chroococcum BКПМ-3173.