ШТАММЫ BACILLUS SAFENSIS ВКПМ В-12180, BACILLUS LICHENIFORMIS ВКПМ В-1224, BACILLUS PUMILUS ВКПМ В-12182, BACILLUS ENDOPHYTICUS ВКПМ В-12181 - ПРОДУЦЕНТЫ БАКТЕРИОЦИНОВ ПРОТИВ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПАТОГЕНОВ, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НИЗИНА Российский патент 2019 года по МПК C12N1/20 A01N63/02 C12P1/04 

Группа изобретений относится к биотехнологии. Штаммы Bacillus safensis ВКПМ B-12180, Bacillus licheniformis ВКПМ В-12224, Bacillus pumilus ВКПМ B-12182, Bacillus endophyticus ВКПМ В-12181 депонированы во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИгенетика и являются продуцентами бактериоцина низина, который обладает антагонистической активностью против бактериальных патогенов и может быть использован в пищевой промышленности для продления сроков годности минимально обработанных овощей. Группа изобретений также включает способ получения низина, основанный на использовании центрифугирования, фильтрации и добавлении сухого хлористого натрия.

Уровень техники

Известно, что на свежих фруктах и овощах содержится большое количество микроорганизмов. Плотность микроорганизмов, в основном, зависит от естественной изменчивости продукта, и составляет в среднем от 10³-10⁷ КОЕ/г.

Молочнокислые бактерии (например, Lactobacillus), Pseudomonas, Erwinia, Pantoea, Micrococcus, Flavobacterium и грамположительные спорообразующие бактерии (например, Bacillus, Clostridium), как правило, являются доминирующими бактериями в свежих фруктах и овощах. Кроме того, различные типы бактерий, такие как Alternaria, Penicillium, Aspergillus, Fusarium также могут быть найдены в больших количествах. Наконец, Torulopsis, Saccharomyces и Candida являются частью доминирующих микроорганизмов, особенно в тех фруктах, которые имеют высокое содержание сахара.

В отдельную группу выделяют микроорганизмы, вызывающие порчу свежих фруктов и овощей, к которым относятся грибы и бактерии. К микробной порче фруктов и овощей относится гниль, которая характеризуется изменением цвета (черный или серый), потерей текстуры (мягкая гниль), а зачастую и неприятным запахом. Повреждения, возникающие при хранении продуктов, часто в результате уборки и транспортировки, легко открывают доступ к множеству бактерий и грибов, высокое содержание воды в продукте будет способствовать их развитию. Среди наиболее важных послеуборочных грибковых патогенов, вызывающих порчу фруктов, можно выделить Penicillium expansum, Botrytis cinerea, Monilinia laxa и Rhizopus stolonifer, в связи с тем, что они имеют особую значимость при порче фруктов и овощей.

Бактериоцины - это антибактериальные вещества белковой природы, вырабатываемые бактериями и подавляющие жизнедеятельность других штаммов того же вида или родственных видов.

В настоящее время ученые многих лабораторий мира изучают пути и способы направленного синтеза бактериоцинов для создания биологическим путем различных модификаций уже известных бактериоцинов, но с более ценными свойствами.

Так, известен способ получения низина (СССР, патент 707320, опубл. 30.11.1981) путем выращивания продуцента Streptococcus lactis в питательной среде на основе молочной сыворотки, с последующей экстракцией целевого продукта из микробных клеток, отделением экстракта, его концентрированием, высаливанием, фильтрацией и высушиванием, отличающийся тем, что с целью стабилизации активности низина в процессе хранения продуцент выращивают на среде, содержащей молочную сыворотку и экстракт кормовых дрожжей, выращенных на растительных отходах, очищенную культуральную жидкость концентрируют с сорбиталем С-20, фильтрацию осуществляют через фильтр-перлит, полученную пасту низин-перлит растворяют в 0,02 н. растворе HCl, затем проводят повторную фильтрацию и концентрат высушивают в присутствии хлористого натрия напылением на казеинат натрия при их соотношении 1-2:2,3-1,3.

Недостатками данного способа являются низкая активность и нестабильность полученного препарата при хранении, а также ограниченный спектр его антимикробного действия.

Описана смесь бактериоцинов, штамм Streptococcus thermophilus -продуцент бактериоцинов и способ их получения (РФ, патент 2153505, опубл. 27.07.2000). Бактериоцины получены культивированием штамма-продуцента Streptococcus thermophilus CNCM 1-1351, выделенного из ферментированного молочного продукта из Чехословакии, в среде и условиях, благоприятных для его роста, и до содержания микроорганизмов в среде 10⁷-10⁹ КОЕ/мл с последующим центрифугированием культуры, приготовлением экстракта супернатанта, содержащего целевой продукт. Бактериоцины используют для приготовления пищевых продуктов или косметической продукции.

Недостатком данного способа является низкая продуктивность штамма.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому изобретению - ближайшим аналогом - является штамм Streptococcus lactis - продуцент бактериоцина низина, обеспечивающий стабильный биосинтез целевого продукта в процессе управляемого непрерывного культивирования (продуктивность на уровне 1440-1680 МЕ/см³ч) и характеризующийся повышенной протеолитической активностью (РФ, патент 2061042, опубл. 27.05.1996).

Основной недостаток ближайшего аналога заключается в низкой продуктивности и нестабильности биосинтеза бактериоцина.

Техническая задача, решаемая изобретением, заключается в выделении штаммов-продуцентов бактериоцина, являющихся представителями нормальной микрофлоры поверхности фруктов и овощей и обладающих широким спектром антимикробного действия по отношению к патогенным, условно-патогенным микроорганизмам и микроорганизмам, вызывающим порчу фруктов и овощей.

Раскрытие сущности изобретения

Поставленная задача решается тем, что предложены штаммы Bacillus safensis B-12180, Bacillus licheniformis В-12224, Bacillus pumilus B-12182, Bacillus endophyticus B-12181 - продуценты бактериоцина против бактериальных патогенов.

Для выделения штаммов овощи (репчатый лук, помидор, болгарский перец) тщательно промывают, измельчают в стерильных условиях и вносят в пробирки с жидкой питательной средой, либо небольшой кусочек сырья растирают по поверхности чашки с агаризованной питательной средой. Инкубируют чашки и пробирки в течение 1-5 суток.

Из пробирок с видимым ростом микроорганизмов и с суммарных газонов на чашках проводят истощающие рассевы. Выделенные микроорганизмы культивируют на агаризованных средах, клонируют до чистых культур и проводят анализ выделенных штаммов с последующим отбором наиболее активных штаммов микроорганизмов.

Отобранные штаммы исследуют как продуценты бактериоцина, в частности низина, в процессе управляемого культивирования.

Для получения фракции бактериоцина выделенные и сублимированные штаммы восстанавливают путем переноса содержимого ампул в пробирки с питательной средой МПБ. Посевы инкубируют при температуре 30°С. После восстановления культур их выращивают на питательном агаре МПА. Затем инокуляты вносят в ферментационную среду (MRS-бульон) в количестве 5%. Далее осуществляют процесс ферментации в непрерывных условиях при температуре 30°С в течение 12-24 ч.

По окончании культивирования биомассу отделяют от питательной среды центрифугированием при 8000 об/мин в течение 20 мин.

Затем концентрируют культуральную жидкость на полых волокнах, отсекающих вещества с молекулярной массой более 15 кДа; перемешивают с сухим хлористым натрием (0,5 М); центрифугируют при 10000 об/мин в течение 15 мин. Далее осадок промывают последовательно водой и изопропиловым спиртом.

Полученную массу центрифугируют, выпаривают изопропанол при температуре 60°С. Выдерживают раствор с водой и активированным углем в течение 15 мин, центрифугируют при 10000 об/мин в течение 15 мин; фильтруют через мембрану, отсекающую молекулы с молекулярной массой более 10 кДа. Полученные пептидные фракции объединяют и проводят их лиофилизацию при следующих параметрах: температура сушки 30°С, продолжительность сушки 6 ч, толщина слоя сушки 2 мм. Готовый продукт упаковывают и хранят при температуре -18°С в течение 12 месяцев.

Штаммы Bacillus safensis, Bacillus licheniformis, Bacillus pumilus, Bacillus endophyticus депонированы во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИгенетика и имеют коллекционные номера В-12180, В-12224, В-12182, В-12181, соответственно.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1

Для выделения штаммов репчатый лук тщательно промывают от земли и пыли дистиллированной водой, измельчают в стерильных условиях и вносят в количестве приблизительно 5 г в пробирки с 5 мл жидких питательных сред, либо небольшой кусочек сырья растирают по поверхности чашки с агаризованной питательной средой. Инкубируют чашки и пробирки стационарно в трех температурных режимах (30°С, 37°С и 4°С) в течение 1-5 суток.

Для первичного выделения микроорганизмов используют:

- молочную среду (МС) - стерильное обезжиренное молоко;

- бульон MRS по ISO 13721 (Whatman, Германия);

- сердечно-мозговой бульон (Bio-Rad Laboratories SAS, Франция);

- молочный агар, MA (БиоВитрум, Россия);

- рыбопептонный агар, РПА (БиоВитрум, Россия);

- агар MRS, МРСА (Panreac, Испания).

Из пробирок с видимым ростом микроорганизмов (помутнение или наличие молочного сгустка) и с суммарных газонов на чашках проводят истощающие рассевы. Выделенные микроорганизмы культивируют на агаризованных средах (РПА, МРСА и МА), клонируют до чистых культур и проводят микробиологический анализ культурально-морфологических, физиолого-биохимических и генетических свойств выделенных штаммов с последующим отбором наиболее активных штаммов микроорганизмов.

Штаммы Bacillus safensis B-12180, Bacillus pumilus B-12182, наиболее активные из всех отобранных штаммов, исследуют как продуценты бактериоцина в процессе управляемого культивирования.

Штамм Bacillus safensis B-12180 - продуцент бактериоцина -характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки.

Штамм представляет собой грамположительные подвижные за счет наличия перетрихиальных жгутиков палочки размером 0,5-2,5×1,2-10 мкм, образующие споры. Расположение клеток от одиночных до длинных цепочек.

Культуральные признаки.

Штамм образует плоские матовые однородные колонии округлой формы телесного цвета с бахромчатым краем и шероховатой поверхностью. Биохимические признаки.

Штамм растет в аэробных условиях в молоке, в сердечно-мозговом бульоне при температурах 30°С и 37°С, растет на агаризованных средах: рыбопептонном агаре, молочном агаре, MRS-агаре.

Штамм ферментирует глицерол, L-арабинозу, рибозу, D-ксилозу, L-ксилозу, рибит, D-глюкозу, D-фруктозу, рамнозу, галактит, инозитол,

манитол, сорбитол, α-метил-D-манозид, α-метил-D-глюкозид, амигдалин, арбутин, эскулин, салицин, целлобиозу, мальтозу, сахарозу, трегалозу, D-рафинозу, крахмал, гликоген, ксилит, β-генцибиозу.

Антагонистическая активность.

Штамм проявляет in vitro выраженную антагонистическую активность против некоторых грамположительных патогенов: Leuconostoc mesenteroides, Arthrobacter cumminsii.

Штамм Bacillus pumilus B-12182 - продуцент бактериоцина -характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки.

Штамм представляет собой грамположительные подвижные за счет наличия перетрихиальных жгутиков палочки размером 0,5-2,5×1,2-10 мкм, образующие споры. Расположение клеток от одиночных до длинных цепочек.

Культуральные признаки.

Штамм образует выпуклые непрозрачные однородные колонии округлой формы белого цвета с зубчатым краем и гладкой поверхностью. Биохимические признаки.

Штамм растет в аэробных условиях в молоке, в сердечно-мозговом бульоне при температурах 30°С и 37°С, растет на агаризованных средах: рыбопептонном агаре, молочном агаре, MRS-агаре.

Штамм ферментирует L-арабинозу, рибозу, D-глюкозу, D-фруктозу, D-манозу, манитол, арбутин, эскулин, салицин, целлобиозу, сахарозу, трегалозу, β-генцибиозу, D-тагатозу.

Антагонистическая активность.

Штамм проявляет in vitro выраженную антагонистическую активность против некоторых грамположительных патогенов: Leuconostoc mesenteroides, Arthrobacter cumminsii.

В результате проведения генетической идентификации штаммов они депонированы во Всероссийской Коллекции Промышленных

Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИгенетика, находящейся по адресу: 117545, Россия, г. Москва, 1-ый Дорожный проезд, д. 1:

- Bacillus safensis, регистрационный номер ВКПМ В-12180 от 18.04.2015;

- Bacillus pumilus, регистрационный номер ВКПМ В-12182 от 18.04.2015.

Данные культуры микроорганизмов хранятся в сублимационно-высушенном состоянии в ампулах при температуре 4±2°С не менее 24 месяцев.

Для получения фракции бактериоцина выделенные и сублимированные штаммы Bacillus safensis ВКПМ B-12180, Bacillus pumilus ВКПМ В-12182 восстанавливают путем переноса содержимого ампул в пробирки с питательной средой МПБ, г/л: панкреатический гидролизат рыбной муки - 12; хлорид натрия - 6; пептон ферментативный - 12. Посевы инкубируют при температуре 30°С. После восстановления культур, их выращивают на питательном агаре МПА. Затем инокуляты вносят в ферментационную среду (MRS-бульон) в количестве 5%.

Далее осуществляют процесс ферментации в непрерывных условиях при температуре 30°С в течение 12-24 ч до достижения концентраций 1,5⋅10⁸ КОЕ/мл для Bacillus safensis ВКПМ В-12180; 1,5⋅10⁶ КОЕ/мл для Bacillus pumilus ВКПМ В-12182.

Продуктивность непрерывного процесса при указанных параметрах составляет 2500 МЕ/см³ч (у ближайшего аналога известный штамм Streptococcus lactis показал продуктивность 1440-1680 МЕ/см³ч).

По окончании культивирования биомассу отделяют от питательной среды центрифугированием при 8000 об/мин в течение 20 мин.

Затем концентрируют культуральную жидкость на полых волокнах, отсекающих вещества с молекулярной массой более 15 кДа; перемешивают с сухим хлористым натрием (0,5 М) при скорости перемешивания 100 кач/мин в течение 20 мин; центрифугируют при 10000 об/мин в течение 15 мин.

Далее к осадку добавляют воду в объеме 0,1% от начального объема культуральной жидкости, суспендируют; промывают изопропиловым спиртом, взятом в объеме 0,1% от начального объема культуральной жидкости в течение 30 мин при температуре 0°С.

Полученную массу центрифугируют, выпаривают изопропанол на роторном испарителе при температуре 60°С. Далее выдерживают раствор с водой и активированным углем (0,5% w/v) в течение 15 мин, центрифугируют при 10000 об/мин в течение 15 мин; фильтруют через мембрану, отсекающую молекулы с молекулярной массой более 10 кДа. Полученные пептидные фракции объединяют и проводят их лиофилизацию при следующих параметрах: температура сушки 30°С, продолжительность сушки 6 ч, толщина слоя сушки 2 мм. Готовый продукт упаковывают и хранят при температуре -18°С в течение 12 месяцев.

Результаты определения антимикробной активности, физико-химических и биологических свойств полученной фракции представлены в таблицах 1-2.

Пример 2

Для выделения штаммов помидор тщательно промывают от земли и пыли дистиллированной водой, измельчают в стерильных условиях и вносят в количестве приблизительно 5 г в пробирки с 5 мл жидких питательных сред, либо небольшой кусочек сырья растирают по поверхности чашки с агаризованной питательной средой. Инкубируют чашки и пробирки стационарно в трех температурных режимах (30°С, 37°С и 4°С) в течение 1-5 суток.

Для первичного выделения микроорганизмов используют:

- молочную среду (МС) - стерильное обезжиренное молоко;

- бульон MRS по ISO 13721 (Whatman, Германия);

- сердечно-мозговой бульон (Bio-Rad Laboratories SAS, Франция);

- молочный агар, МА (БиоВитрум, Россия);

- рыбопептонный агар, РПА (БиоВитрум, Россия);

- агар MRS, МРСА (Panreac, Испания).

Из пробирок с видимым ростом микроорганизмов (помутнение или наличие молочного сгустка) и с суммарных газонов на чашках проводят истощающие рассевы. Выделенные микроорганизмы культивируют на агаризованных средах (РПА, МРСА и МА), клонируют до чистых культур и проводят микробиологический анализ культурально-морфологических, физиолого-биохимических и генетических свойств выделенных штаммов с последующим отбором наиболее активных штаммов микроорганизмов.

Штамм Bacillus endophyticus В-12181, наиболее активный из всех отобранных штаммов, исследуют как продуцент бактериоцина в процессе управляемого культивирования.

Штамм Bacillus endophyticus В-12181 - продуцент бактериоцина -характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки.

Штамм представляет собой грамположительные подвижные за счет наличия перетрихиальных жгутиков палочки размером 0,5-2,5×1,2-10 мкм, образующие споры. Расположение клеток от одиночных до длинных цепочек.

Культуральные признаки.

Штамм образует плоские матовые мелкозернистые колонии округлой формы белого цвета с ровным краем и гладкой поверхностью. Биохимические признаки.

Штамм растет в аэробных условиях в молоке при температурах 30°С, 37°С и 45°С, в бульоне MRS при температуре 37°С, растет на агаризованных средах: молочном агаре, MRS-агаре.

Антагонистическая активность.

Штамм проявляет in vitro выраженную антагонистическую активность против некоторых грамположительных патогенов: Leuconostoc mesenteroides, Arthrobacter cumminsii.

В результате проведения генетической идентификации штамма он депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИгенетика, находящейся по адресу: 117545, Россия, г. Москва, 1-ый Дорожный проезд, д. 1: Bacillus endophyticus, регистрационный номер ВКПМ В-12181 от 18.04.2015.

Данная культура микроорганизмов хранится в сублимационно-высушенном состоянии в ампулах при температуре 4±2°С не менее 24 месяцев.

Для получения фракции бактериоцина выделенный и сублимированный штамм Bacillus endophyticus ВКПМ В-12181 восстанавливают путем переноса содержимого ампул в пробирки с питательной средой МПБ, г/л: панкреатический гидролизат рыбной муки - 12; хлорид натрия - 6; пептон ферментативный - 12. Посевы инкубируют при температуре 30°С. После восстановления культуры ее выращивают на питательном агаре МПА. Затем инокулят вносят в ферментационную среду (MRS-бульон) в количестве 5%.

Далее осуществляют процесс ферментации в непрерывных условиях при температуре 30°С в течение 12-24 ч до достижения концентраций 1,5⋅10⁷ КОЕ/мл.

Продуктивность непрерывного процесса при указанных параметрах составляет 2500 МЕ/см³ч (у ближайшего аналога известный штамм Streptococcus lactis показал продуктивность 1440-1680 МЕ/см³ч).

По окончании культивирования биомассу отделяют от питательной среды центрифугированием при 8000 об/мин в течение 20 мин.

Затем концентрируют культуральную жидкость на полых волокнах, отсекающих вещества с молекулярной массой более 15 кДа; перемешивают с сухим хлористым натрием (0,5 М) при скорости перемешивания 100 кач/мин в течение 20 мин; центрифугируют при 10000 об/мин в течение 15 мин.

Далее к осадку добавляют воду в объеме 0,1% от начального объема культуральной жидкости, суспендируют; промывают изопропиловым спиртом, взятом в объеме 0,1% от начального объема культуральной жидкости в течение 30 мин при температуре 0°С.

Полученную массу центрифугируют, выпаривают изопропанол на роторном испарителе при температуре 60°С. Далее выдерживают раствор с водой и активированным углем (0,5% w/v) в течение 15 мин, центрифугируют при 10000 об/мин в течение 15 мин; фильтруют через мембрану, отсекающую молекулы с молекулярной массой более 10 кДа. Проводят лиофилизацию полученной пептидной фракции при следующих параметрах: температура сушки 30°С, продолжительность сушки 6 ч, толщина слоя сушки 2 мм. Готовый продукт упаковывают и хранят при температуре -18°С в течение 12 месяцев.

Результаты определения антимикробной активности, физико-химических и биологических свойств полученной фракции представлены в таблицах 1-2.

Пример 3

Для выделения штаммов болгарский перец тщательно промывают от земли и пыли дистиллированной водой, измельчают в стерильных условиях и вносят в количестве приблизительно 5 г в пробирки с 5 мл жидких питательных сред, либо небольшой кусочек сырья растирают по поверхности чашки с агаризованной питательной средой. Инкубируют чашки и пробирки стационарно в трех температурных режимах (30°С, 37°С и 4°С) в течение 1-5 суток.

Для первичного выделения микроорганизмов используют:

- молочную среду (МС) - стерильное обезжиренное молоко;

- бульон MRS по ISO 13721 (Whatman, Германия);

- сердечно-мозговой бульон (Bio-Rad Laboratories SAS, Франция);

- молочный агар, МА (БиоВитрум, Россия);

- рыбопептонный агар, РПА (БиоВитрум, Россия);

- агар MRS, МРСА (Panreac, Испания).

Из пробирок с видимым ростом микроорганизмов (помутнение или наличие молочного сгустка) и с суммарных газонов на чашках проводят истощающие рассевы. Выделенные микроорганизмы культивируют на агаризованных средах (РПА, МРСА и МА), клонируют до чистых культур и проводят микробиологический анализ культурально-морфологических, физиолого-биохимических и генетических свойств выделенных штаммов с последующим отбором наиболее активных штаммов микроорганизмов.

Штамм Bacillus licheniformis В-12224, наиболее активный из всех отобранных штаммов, исследуют как продуцент бактериоцина в процессе управляемого культивирования.

Штамм Bacillus licheniformis В-12224 - продуцент бактериоцина -характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки.

Штамм представляет собой грамположительные подвижные за счет наличия перетрихиальных жгутиков палочки размером 0,5-2,5×1,2-10 мкм, образующие споры. Расположение клеток от одиночных до длинных цепочек.

Культуральные признаки.

Штамм образует плоские матовые однородные колонии округлой формы телесного цвета с волнистым краем и гладкой поверхностью. Биохимические признаки.

Штамм растет в аэробных условиях в молоке, в бульоне MRS, в сердечно-мозговом бульоне при температурах 30°С и 37°С, растет на агаризованных средах: рыбопептонном агаре, молочном агаре, MRS-агаре.

Штамм ферментирует глицерол, L-арабинозу, рибозу, D-ксилозу, галактозу, D-глюкоза, D-фруктозу, D-манозу, рамнозу, манитол, N-ацетил-глюкозоамин, амигдалин, арбутин, эскулин, салицин, целлобиоза, мальтозу, лактозу, сахарозу, трегалозу, β-генцибиозу, глюконат.

Антагонистическая активность.

Штамм проявляет in vitro выраженную антагонистическую активность против некоторых грамположительных патогенов: Leuconostoc mesenteroides, Arthrobacter cumminsii.

В результате проведения генетической идентификации штамма он депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИгенетика, находящейся по адресу: 117545, Россия, г. Москва, 1-ый Дорожный проезд, д. 1: Bacillus licheniformis, регистрационный номер В-12224 от 17.06.2015.

Данная культура микроорганизмов хранится в сублимационно-высушенном состоянии в ампулах при температуре 4±2°С не менее 24 месяцев.

Для получения фракции бактериоцина выделенный и сублимированный штамм Bacillus licheniformis ВКПМ В-12224 восстанавливают путем переноса содержимого ампул в пробирки с питательной средой МПБ, г/л: панкреатический гидролизат рыбной муки - 12; хлорид натрия - 6; пептон ферментативный - 12. Посевы инкубируют при температуре 30°С. После восстановления культуры, ее выращивают на питательном агаре МПА. Затем инокулят вносят в ферментационную среду (MRS-бульон) в количестве 5%.

Далее осуществляют процесс ферментации в непрерывных условиях при температуре 30°С в течение 12-24 ч до достижения концентраций 1,5⋅10⁷ КОЕ/мл.

Продуктивность непрерывного процесса при указанных параметрах составляет 2500 МЕ/см³ч (у ближайшего аналога известный штамм Streptococcus lactis показал продуктивность 1440-1680 МЕ/см³ч).

По окончании культивирования биомассу отделяют от питательной среды центрифугированием при 8000 об/мин в течение 20 мин.

Затем концентрируют культуральную жидкость на полых волокнах, отсекающих вещества с молекулярной массой более 15 кДа; перемешивают с сухим хлористым натрием (0,5 М) при скорости перемешивания 100 кач/мин в течение 20 мин; центрифугируют при 10000 об/мин в течение 15 мин. Далее к осадку добавляют воду в объеме 0,1% от начального объема культуральной жидкости, суспендируют; промывают изопропиловым спиртом, взятом в объеме 0,1% от начального объема культуральной жидкости в течение 30 мин при температуре 0°С.

Полученную массу центрифугируют, выпаривают изопропанол на роторном испарителе при температуре 60°С. Далее выдерживают раствор с водой и активированным углем (0,5% w/v) в течение 15 мин, центрифугируют при 10000 об/мин в течение 15 мин; фильтруют через мембрану, отсекающую молекулы с молекулярной массой более 10 кДа. Проводят лиофилизацию полученной пептидной фракции при следующих параметрах: температура сушки 30°С, продолжительность сушки 6 ч, толщина слоя сушки 2 мм. Готовый продукт упаковывают и хранят при температуре -18°С в течение 12 месяцев.

Результаты определения антимикробной активности, физико-химических и биологических свойств полученной фракции представлены в таблицах 1-2.

Из таблицы 1 следует, что метаболиты фракции обладают антимикробными свойствами. Данные таблицы 1 также свидетельствуют о том, что фракция активна только в отношении грамположительных бактерий.

Исходя из данных таблицы 2, выделенная фракция представляет собой пептид, состоящий из 33 аминокислот, имеющий молекулярную массу 3353 Да, хорошо растворимый в воде и мало растворимый в этаноле и эфире, проявляющий антимикробное действие только по отношению к грамположительным бактериям. Данная совокупность свойств свидетельствует о принадлежности выделенной фракции к низину.

Таким образом, использование штаммов (Bacillus safensis ВКПМ В-12180, Bacillus licheniformis ВКПМ В-12224, Bacillus pumilus ВКПМ В-12182, Bacillus endophyticus ВКПМ В-12181), выделенных с поверхности овощей, позволяет получать бактериоцины, в частности низин, с высокой продуктивностью и с широким спектром антимикробного действия.

Группа изобретений относится к биотехнологии, к получению бактериоцина микроорганизмов, в частности к получению низина, и включает штаммы – продуценты бактериоцина и способ его получения. В качестве продуцентов бактериоцина используются новые штаммы бактерий Bacillus safensis ВКПМ В-12180, Bacillus licheniformis ВКПМ В-12224, Bacillus pumilus ВКПМ В-12182 и Bacillus endophyticus ВКПМ В-12181. Полученный бактериоцин низин обладает широким спектром антимикробного действия. Способ получения бактериоцина основан на культивировании штаммов - продуцентов на питательной среде, отделении культуральной жидкости, ее концентрировании и выделении бактериоцина с высокой антимикробной активностью. Группа изобретений позволяет получить бактериоцин низин с высокой антимикробной активностью. 5 н.п. ф-лы, 2 табл., 3 пр.

1. Штамм Bacillus safensis В-12180, депонированный в ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика, - продуцент бактериоцина против бактериальных патогенов.

2. Штамм Bacillus licheniformis В-12224, депонированный в ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика, - продуцент бактериоцина против бактериальных патогенов.

3. Штамм Bacillus pumilus В-12182, депонированный в ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика, - продуцент бактериоцина против бактериальных патогенов.

4. Штамм Bacillus endophyticus В-12181, депонированный в ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика, - продуцент бактериоцина против бактериальных патогенов.

5. Способ получения бактериоцина низина, включающий культивирование штаммов-продуцентов бактериоцина на питательной среде с последующим отделением биомассы и ее концентрированием, центрифугированием и очисткой на мембране, отличающийся тем, что в качестве штаммов-продуцентов бактериоцина используют штаммы Bacillus safensis В-12180, Bacillus licheniformis В-12224, Bacillus pumilus В-12182, Bacillus endophyticus В-12181, выделенные с поверхности овощей.