Способ получения штамма SтRертососсUS SaNGUIS, способного секретировать @ -1,3-глюкан-3-глюканогидролазу Советский патент 1992 года по МПК C12N15/55 

Изобретение относится к биотехнологии и фармакологии и касается способов получения препаратов для стоматологии.

Разработан способ получения штамма Streptococcus sanguis, экспрессирующего а-1,3-глюкан-3-глкжаногидролазу, заключающийся в том, что из -ДНК Bacillus circulans BC-8/1-Ferm ВР-733 выделяют EcoRI-EcoRI фрагмент размером 3 т.п.о., клонируют его в плазмиду pYEIOOl, затем в векторах pGB301, pMN2, pMNI, pMN3. Полученными плазмидами, содержащими ген а -1,3-гяюкан-З-глюканогидролазы, трансформируют клетки Streptococcus sanguis.

Пример1.В пробу почвы, содержа щую выветрившийся гранит, смешанный с торфом, и имеющую рН приблизительно 6, добавляют стерилизованную и забуфериро ванную фосфатом (рН 7) минимальную среду, содержащую 0,1 мае. % (NtafeSO, 0,005 мае. % Mo., 0,0005 мас.% FeCte 6Н20 и 0,03 мас.% нерастворимого глюкана, полученного из кариогенного штамма бактерий Streptococcus mutans ОМ Z 176, который является источником углерода, Пробы почвы инкубируют в среде в течение трех дней при 28°С.

Семейство бактерий, культивированных в этой среде, подвергают субкультивированию двенадцать раз и затем концентрируют. Получают плоские агары, содержащие 1,2 мас.% агара, в который добавляют 0,2% нерастворимого глюкана и минимальную среду. На пластинки прививают концентрированную культуру бактерий и культивируют до образования колоний. Через несколько дней, в течение которых осуществляют инкубирование при 30°С, бактерии, экспрессирующие активность глюканазы и разрушающие нерастворимый глюкан, идентифицируют при помощи образования прозрачных гало вокруг колоний.

Четыре колонии, которые образовывают наиболее заметное гало, депонированы

V|

ю о о со

00

в техническом исследовательском институте микробиологической промышленности, Япония, под номерами PERM BP-733 и PERM BP-995.

П р и ме р2. Для определения активно- сти фермента глюканазы суспензию нерастворимого глюкана (пример 1) размельчают обработкой ультразвуком и используют в качестве субстрата. Культуру Bacillus circulars БС-8 {далее БС-8) инкубируют в соевом бульоне триптиказы при 30°С. Экспрессию фермента глюканазы инициируют добавлением нерастворимого глюкана. Пробы верхнего слоя, содержащие фермент, получают центрифугированием и 10- кратной концентрацией культуральной среды. Либо верхний слой обрабатывают 75% сульфатом аммония с тем, чтобы осуществить осаждение фермента. За единицу активности фермента принимают такое ко- личество, которое продуцирует0.1 мМ глюкозы в течение 16 ч при 37°С из субстрата нерастворимого глюкана.

П р и м е р 3. Культуры бактерий БС-8 инкубируют в 500 мл соевого бульона трип- тиказы, содержащем 0,3% нерастворимого глюкана, в течение трех дней при 30°С. Верхний слой культуры, полученный центрифугированием, обрабатывают 75%-ным раствором сульфата аммония с тем, чтобы фермент перешел в осадок. Полученный осадок растворяют в 50 мМ буферного раствора фосфата (рН 7,0) и наносят на колонку из целлюлозы ДЕ-52. Фракции собирают элюированием 50 мМ раствором фосфатно- го буфера (рН 7) при увеличении концентрации NaCI от 0 до 0,5 М. Фракцию, имеющую пик активности, подвергают хроматографии на колонке Сефадекс 1-150. В результате электрофореза в геле обнаруживают две по- лосы, одна в 68 килодальтон(к Д) «другая в 54 кД (молекулярные массы). Протеин в 68 кД идентифицирован как а-1,3-глюканаза, в то время как протеин в 54 кД идентифицирован как имеющий активность а-1,б-глю- канззы.

Протеин с молекулярной массой 68 кД подвергают очистке при помощи процедуры, описанной выше, и применяют к глкжа- ну, химические связи которого типа а-1,6 предварительно разрушают в результате обработки йодной кислотой или производимой промышленностью декстраназой, имеющей только а-1,3 химические связи. Протеин с молекулярной массой 68 кД раз- рушает си-1,3 связи и дает восстановительные сахара. Фермент с молекулярной массой 54 кД обладает активностью Глюканазы, характерной для а-1,6 связи,и является, таким образом, а-1,6-глюкан-6«глюка- ногидролазой.

Несмотря на то, что химические связи нерастворимого глюкана принадлежат главным образом а-1,3 семейству и что а-1,3- глюканаза играет главную роль в ферментной деградации нерастворимого глюкана, установлено, что комбинация а- 1,3-глюканазы и а-1,6-глюканазы дает си- нергетический эффект при деградации нерастворимых глюканов. Поэтому, чтобы удалить нерастворимый глюкан, предпочтительно клонирование обоих генов как а- 1,3-глюканазы, так и а-1,6-глюканазы, и связывание их в одной плазмиде.

П р и м е р 4. Бактерии БС-8 культивируют в соевом бульоне триптиказы и ДНК экстрагируют. ДНК центрифугируют в градиенте плотности CSCI-EtBr. При этом присутствие ДНК плазмиды не выявлено. Далее единственную полосу хромосомной ДНК изолируют и подвергают очистке. ДНК диализуют и расщепляют эндонуклеазой EcoRI.

Одновременно культуру E.coli ХБ 101, содержащую производимую промышленностью плазмиду PYEI001 , культивируют в 300 мл L-бульона (содержащего 10 г пептона, 5 г экстракта дрожжей, 1 г глюкозы, 5 г NaCI и 1000 мл Н20) с рН на уровне 7,2. ДНК плазмиды PYEI001 затем экстрагируют и обрабатывают ферментом EcoRI.

Один мг ДНК - фрагмента EcoRI БС-8 и один мг ДНК плазмиды PYEI001 лигиру- ют лигазой Т4, ДНК рекомбинантной плазмиды трансформируют в штамм ХБ 101 Е. coll K12.

П р и м е р 5. Известно, что встраивание ДНК-фрагмента в сайт EcoRI гена устойчивости к хлорамфениколу (Cmr) плазмиды PYEI001 делает бактерии чувствительными к хлорамфениколу.

Среди колоний культуры E.coli, которые были трансформированы рекомбинантной плазмидной PYEI001 , отбирают клоны, обладающие Cm-чувствительностью, которые далее идентифицируют на наличие гена а-1,3 глюканазы с правильной ориента: цией.

Так как бактерия ХБ 101 требует для роста треонин, лейцин и пролин, Cm-чувствительные (Cm1) колинии E.coli культивируют на синтетической минимальной среде, содержащей небольшое количество казаминокис- лот и 0,2% размельченного ультразвуком нерастворимого глюкана в качестве единственного источника углерода. Несмотря на то, что не получено ни одного гало и предполагают, что трансформированные бактерии не

способны секретировать а-1,3-глюканазу, некоторые из колоний дают рост, это указывает на то, что они экспрессируюг продукт гена а-1,3-глюканазы и, таким образом, приобретают способность разрушать и ассимилировать нерастворимый глюкан в качестве источника углерода.

Те трансформированные культуры, которые дают рост на минимальной среде, культивируют и их ДНК экстрагируют, расщепляют эндонуклеазой EcoRI, при помощи гелевого электрофореза получают ДНК- Фрагмент размером 3,0 т.п.о.

Культуры E.coli ХБ 101, бактерии ХБ 101, трансформированные плазмидой PYEI001 и бактерии ХБ 101, трансформированные плазмидой PYEI001, включающей вставку фрагмента ДНК в 3,0 т.п.о., культивируют. Верхний слой, полученный при центрифугировании лизированных клеток из трех типов культур, анализируют на активность глюканазы в соответствии с процедурой из примера 2. В результате установлено, что только бактерии, трансформированные плазмидой PYEI001, содержащей фрагмент в 3.U т.п.о., проявляют активность глюканазы. Таким образом, это доказывает правильность вставки гена а- 1,3-глкжаназы бактерии БС-8 в плазмиду PYEIOOIE.coll.Кроме того, только клетки ХБ 101, трансформированные плазмидой PYEI001, включающей вставку в 3,0 т.п.о., способны выжить в канаминокислотах и нерастворимом глюкане.

Примерб. Штамм (№ СТС7868) бактерии Streptococcus sanguis Challis, который содержится во флоре ротовой полости, трансформируют геном, кодирующим экспрессию а-1,3-глюканазы. Среди различных бактерий S.sanguis и Streptococcus salivarius являются наиболее безвредными, в частности штамм (№ СТС7868) Streptococcus sanguis Challis является хорошим материалом для генетиков, трансформацию которого они относительно хорошо понимают. Плазмиду pGB301 используют в качестве вектора трансформации.

ДНК плаэмиды pGB301, которая содержится в цитоплазме штамма S.sanguis Challis, содержит два маркера устойчивости к лекарственным препаратам, Emr (к эритромицину) и Стг(к хлорамфениколу) с единственным сайтом Bst Е II внутри гена Cmr. ДНК плазмиды pGB301 гидролизу ют ферментом сечения Bst E II, а концы затупляют при помощи ДНК-полимеразы I.

В то же самое время плазмиду PYEI001 содержащую фрагмент в 3,0т.п.о., кодирующий экспрессию гена #-1,3-гяюканазы, обрабатывают эндонуклеазой EcoRI и концы фрагмента в 3,0 т.п.о. превращают в тупые ДНК - полимеразой I. ДНК-фрагмент плазмиды pGB301 и ДНК-фрагмент гена а-1,3- 5 глюканазы лигируют с использованием 100 ед. лигазы Т4 с целью восстановления плазмиды.

Штамм S.sanguis Challis трансформируют лигазной смесью, культивируют на пло0 ских агарах вытяжки ядра головного мозга (B.H.I), содержащей эритромицин (50 мг/мл). Каждую из этих колоний переносят на плоский агар B.H.I., содержащий хло- рамфеникол (10 мг/мл) с тем, чтобы

5 установить наличие Cms (чувствительных к хлорамфениколу) колоний.

Даже для тех штаммов S. sanguis Challls, которые обладают чувствительностью к хло- рамфениколу, фенотипная экспрессия

0 вставленного гена а-1,3-глюканззы отмечена только в одной трети трансформированных колоний. Это вызвано тем, что фрагмент гена может быть вставлен с двумя различными ориентациями. Экспрессию

5 генного продукта анализируют при помощи переноса колоний Ст8-бактерий на плоские агары с В.Н.1., содержащие нерастворимый глюкан. Ввиду того, что S.sanguis является грамположительной бактерией, возможно

0 она будет секретировать любую а-1,3-глю- каназу, которую она синтезирует. Экспрессию и секретирование глюканазы определяют наличием гало на пластинках с агаром. Таким образом, ген а -1,3-глюкана5 зы правильно введен в клетки S.sanguis бактерии, которая в общем случае присутствует в ротовой полости, и фенотипная экспрессия этого гена может быть осуществлена в этом хозяине.

0 Пример. Плазмида pGB301 имеет два стабильных маркера устойчивости к эритромицину и хлорамфениколу и имеет несколько ограничений для ее эффективного применения. Число копий плазмиды

5 pGB301 в клетке S.sanguis примерно равно десяти. Как результат небольшого числа копий весьма неэффективно культивировать небольшие количества S.sanguis, содержащие плазмиду pGB301, и выполнять про0 стые анализы размера плазмиды или выращивать большие количества трансформированных S. sanguis и получать ДНК плазмиды.

Для устранения этих ограничений плаз5 миды pGB301 и рИС9 рассекают по сайтам Sma I, что позволяет получить линейные молекулы, имеющие тупые концы с обеих сторон. ДНК-фрагменты лигируют и трансформируют в штамм IM 103 E.coli (PI).

Колонии, которые идентифицируют как содержащие маркер (ас и имеющие плазми- ды размером 12 т.п.о., отбирают, а плазмиду обозначают рМ № 1.

Эту плазмиду используют в качестве вектора - переносчика для трансформации культуры S.sanguls в соответствии с описанием, приведенным выше, наделяя трансформированную культуру стойкостью к ампициллину, а также стойкостью к хлорам- фениколу и эритромицину.

Ген СЕ-1,3- глюканазы должен быть вставлен в правильном направлении относительно синтетического промотора, который предшествует участку от В к А. В этой конфигурации можно ожидать энергичную экспрессию и получить большое количество синтезированной а-1,3- глюканазы. Так как ни один из таких штаммов не был изолирован, то сигнальный пептид генного продукта а-1,3-глюканазы бактерии БС-8 не был отсечен сигнальной пептидазой E.cotf. Кроме того, если продуцирование а-1,3-глюкана- зы при регулировании мощным синтетическим промотором является чрезмерным, бактерия-хозяин, накапливающая а-1,3- глюканазу в клетке, погибает.

В тех случаях, когда ген сс-1,3-глюкана- зы вставлен в обратном направлении, т.е. от А к В, имеет место транскрипция гена а-1,3-глюканазы бактерии БС-8 под действием регулярного промотора. Такая транскрипция снижается до весьма низкого уровня за счет сильного конкурирующего эффекта транскрипции, которая регулирует- ся синтетическим промотором. Этот факт также подтверждается экспериментом, в котором ген а-1,3-глюканазы вставляют при неиндуктивных условиях в направлении вниз от сильных промоторов таких, как про- мотор триптофан (Ptrp) или промотор лактоза (Plac) культуры E.coll. В этих случаях были получены продукты генов, вставленных как в правильном, так и обратном направлениях. Гены, вставленные в правильном направ- лении, дают значительно более энергичное продуцирование а-1,3-глюканазы.

Таким образом, чтобы эффективно продуцировать глюканазу, часть сигнального пептида секреции должна быть модифици- рована таким образом, чтобы сигнальный пептид можно было легко удалить от фермента глюканазы, а ген а-1,3-глюканазы должен быть вставлен в правильном на

правлении вниз от сильного промотора.

Примере. / -Лактамаза - продукт гена устойчивости к ампициллину (Am1), подвергается эффективной экспрессии в культуре E.coll, а также в культур

5 0 5

0 5 9 5

0

5

S.sanguls.pMN1 гидролизуют эндонуклеа- зой BstEl, а полученные концы превращают в тупые. Одновременно, плазмиду PYEI001 гидролизуют эндонуклеазой EcoRI с тем, чтобы удалить фрагмент гена глюканазы в 3,0т.п.о., а затем полученные концы превращают в тупые. Этот фрагмент затем лигиру- ,ют фрагментом pMN1.

Фрагмент гена, содержащий промотор и сигнальный пептид секреции / -лактама- зы, отсекают от плазмиды pGH54 и вставляют в сайт Nurl внутри ДНК, кодирующей ген а-1,3-глюканазы на рММ1, в которую был вставлен этот ген.

Как было установлено, сайт Nurl находится в области гена глюканазы, кодирующего амино-конец полипептида фермента. Для завершения этой конструкции используют синтетический линкер, служащий для соединения ДНК, кодирующей сигнальный пептид /J-лактамазы на фрагменте pGH54, с остатком гена глюканазы (от 3 до сайта Nurl) и снова получают ДНК (от 5 до сайта Nurl), кодирующую амино-конец этого фермента.

П р и м е р 9. Фрагмент гена, содержащий промотор и сигнальный пептид секреции для стрептокиназы, клонируют в Streptococcus equlclmllls и определяют его основную последовательность. Эта генетическая последовательность кодирует секрецию стрептокиназы клетками S. equiclmllis, а также E.coli. Плазмиду pMN3 получают в результате синтеза ДНК-последовательности, соответствующей промотору и сигнальному пептиду этого фермента гена глюканазы на участке от 5 до сайта Nurl, и лигирования синтезированной ДНК-последовательности в сайте Nurl в плазмиде pHN1, которую предварительно обрабатывают с тем, чтобы включить ген, кодирующий протеин а-1,3-глюканазы.

Культуры штамма IM103 E.coll и S.sanguis могут быть трансформированы в соответствии с процедурами, описанными вфие, при помощи плазмид pMN2 и pMN3. Трансформированные клетки будут содержать значительное количество а -1,3;глюка- назы и клетки S.sanguls будут секретировать фермент.

Таким образом устанавливается фено- типная экспрессия гена а-1,3-глюканазы в культуре S.sanguls. Вставка гена глюканазы в правильном направлении относительно промотора и замена сигнального пептида пептидом, который функционирует в клетках S.sanguis, являются важными свойствами для экспрессии и секретирования больших количеств а-1,3-глюканазы.

К бактериям, отличным от S.sanguis, которые являются естественными по отношению к ротовой полости и могут быть использованы в соответствии с изобретением, относятся другие виды Streptococcus, например Streptococcus sallvarlus. Можно ввести ген в эти бактерии при помощи процедур, аналогичных описанным для трансформации S.sanguis.

Препарации, предотвращающие кариес зубов, содержат бактерию, аборигенную относительно ротовой полости. Ген а-1,3- глюканазы и ген а -1,6-глюканазы или тот и другой продуцируют ферменты, которые разрушают нерастворимый глюкан, выраба- тываемый кариогенными бактериями, который служит причиной кариеса зубов. В соответствии с этим предмет изобретения может быть установлен на зубах при помощи какого-либо средства таким образом, чтобы экспрессия и секреция ферментов

глюканазы путем непрерывного воздействия разрушала нерастворимый глюкан, синтезированный кариогенными бактериями в ротовой полости.

Формула изобретения Способ получения штамма Streptococcus sanguls, способного секрети- ровать «-1.3-глюкан-З-глюканогидролазу, заключающийся в том, что осуществляют выделение E.coRI фрагмента ДНК Bacillus clrculans BC-8/PERM ВР-733 размером 3,0 кв, клонирование выделяемого фрагмента ДНК в плазмиду PYEI001, конструирование вектора, содержащего ген а-1,3-глюкан-3- глюканогидролазы, субклонирование ДНК фрагмента, клонированного в PYEI001 в вектор pGB3C1 или pMN1, или pMN2, или pMN3 с последующей трансформацией полученной рекомбинантной ДНК бактерий Streptococcus anguis.

Изобретение относится к биотехнологии и фармакологии и касается способов получения препаратов для стоматологии. Разработан способ получения штамма Streptococcus sanguis, продуцирующего а- 1,3-глюкан-З-глюканогидролазу, заключающийся в том, что из ДНК Bacillus circulans BC-8/Ferm ВР-733 выделяют EcoRI-EcoRI фрагмент размером 3 т.п.о., клонируют его в плазмиду pYEIOOL затем в векторах pGB301, pMN2, pMN1, pMN3. Полученными плазмидами, содержащими ген ог-1,3-глю- кан-3-глюканогидролазы, трансформируют клетки Streptococcus sanguis.