Штамм дрожжей Komagataella kurtzmanii, продуцирующий бета-глюканазу из Bacillus pumilus и бета-глюканазу из Paenibacillus jamilae Российский патент 2020 года по МПК C12N1/19 C12N15/81 C12N9/24 

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и касается получения штамма дрожжей Komagataella kurtzmanii, способного продуцировать бета-глюканазу (β-глюканазу).

β-глюканы представляют собой семейство полисахаридов, состоящих из мономеров D-глюкозы, соединенных посредством β-гликозидных связей и являются естественным компонентом клеточных стенок бактерий, грибов, дрожжей и злаков, таких как овес и ячмень. β-глюканы различного происхождения различаются структурой, уровнем разветвления и молекулярной массой, а также физико-химическими свойствами.

β-1,3-1,4-глюканы являются основными компонентами клеточной стенки представителей семейства злаковых, таких как ячмень, рожь, рис и пшеница и составляют до 70% от массы стенок эндосперма, а также встречаются в лишайниках.

β-1,3-1,4-глюканазы - ферменты, катализирующие расщепление β-глюканов с β-1,3- и β-1,4- связями находят широкое применение, в частности, в качестве пищевых добавок к кормам сельскохозяйственных животных с однокамерным желудком, а также в пивоварении [FEBS Lett., 1975, 52, 202-207].

Природными источниками β-глюканаз являются различные микроорганизмы: бактерии, грибы, дрожжи и актиномицеты.

Большинство кормовых ферментных препаратов, в состав которых входят β-глюканазы, имеют грибное происхождение. Однако, с научной и технологической точки зрения большой интерес представляет разработка рекомбинантных продуцентов ферментов на основе дрожжей, поскольку они более удобны для проведения генно-инженерных работ и быстрее накапливают целевой фермент в сравнении с грибными продуцентами. Существенным преимуществом дрожжевых продуцентов является также то, что на их основе значительно легче создавать продуценты моноферментов, тогда как грибные продуценты обычно синтезируют комплексы целлюлитических ферментов. Промышленное получение моноферментов позволяет более эффективно решать задачи составления оптимальной композиции ферментов при использовании различных субстратов.

В настоящее время наиболее перспективным является создание продуцентов на основе рекомбинантных штаммов метилотрофных дрожжей рода Pichia, Komagataella или Hansenula [J Ind Microbiol Biotechnol 2009, 36: 1435-1438].

Использование метилотрофных дрожжей позволяет достичь высоких скоростей экспрессии гетерологичных белков с высокой плотностью клеток, а также высокого уровня и качества N-гликозилирования белков.

Особенно часто для высокоуровневой экспрессии геретологичных белков используют метилотрофные дрожжи Pichia pastoris [FEMS Microbiol.Rev., 2000, 24,45-66].

Показано [J. Ind. Microbiol. Biotechnol, 2012 39(6), 869-876], что ген bgl16C1 из Penicillium pinophilum, кодирующий β-1,3-1,4-глюканазу, эффективно экспрессируется в клетках дрожжей Pichia pastoris, при этом активность рекомбинантной β-глюканазы в культуральной жидкости при культивировании в 15-литровом ферментере составляет 28721 U/ml.

Известны также рекомбинантные штаммы Pichia pastoris, продуцирующие термостабильную β-1,3-1,4-глюканазу из Bacillus amyloliquefaciens. [CN 101899458]

Komagataella kurtzmanii - новый вид метилотрофных дрожжей, выделен из Pichia pastoris [Antonie van Leeuwenhoek, 2013, 104(3), Published online, DOI 10.1007/s10482-013-9956-7]. В работе [Тюрин O.B. Разработка системы экспрессии генов на основе метилотрофных дрожжей Komagataella kurtzmanii: диссертация канд. биол. наук. ГосНИИгенетика, Москва, 2014.] описана система экспрессии для этого вида дрожжей, на модельных штаммах показана ее эффективность для продукции гетерологических белков.

Показано, что эндо-β-1,3-1,4-глюканазы из Bacillus pumilus [Биотехнология, 2018, 34 (6), 22-32] и Paenibacillus jamilae [Биотехнология, 2019, 35, 4, 15-23] обладают промышленно ценными свойствами. Известно также, что на основе Komagataella kurtzmanii получен штамм, секретирующий эндо β-1,3-1,4-глюканазу из Bacillus pumilus, продуктивность которого при культивировании в пробирках составляет 3500 ед/мл культуральной жидкости [RU 2701640].

Показана возможность использования совместной экспрессии генов, кодирующих β-глюканазы различного происхождения, в системе метилотрофных дрожжей К. kurtzmanii с целью создания промышленно-ценных штаммо [Биотехнология 2019 Т. 35 №5 С. 20-28].

Задачей заявляемого изобретения является расширение арсенала рекомбинантных микроорганизмов, продуцирующих эндо β-1,3-1,4-глюканазу.

Задача решена путем конструирования штамма дрожжей Komagataella kurtzmanii, продуцирующего эндо β-1,3-1,4-глюканазу, содержащего в составе хромосомы ген, кодирующий эндо-β-1,3-1,4-глюканазу из Bacillus pumilus, и ген, кодирующий эндо-1,3-1,4-β-глюканазу из Paenibacillus jamilae.

Особенность заявляемого штамма заключается в совместной экспрессии генов bgl из Bacillus pumilus [МН553379 GenBank] и bgl26 из Paenibacillus jamilae [MN053906 GenBank] в клетках дрожжей Komagataella kurtzmanii.

Штамм является продуцентом эндо β-1,3-1,4-глюканазы и депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика как Komagataella kurtzmanii Bg5 ВКПМ Y-4660.

Культурально-морфологические характеристики заявляемого штамма:

При культивировании при температуре 28°С в течение 48 часов на агаризованной среде YP ((мас. %): пептон - 2, дрожжевой экстракт -1, агар - 2, вода - остальное), с добавлением глюкозы (2 мас. %) клетки имеют овальную форму, 3-4 мкм в диаметре. Клетки почкуются, при этом почкование истинное, многостороннее. Истинного мицелия не образуют.

Споруляция происходит при инкубации культуры на агаризованной среде следующего состава (мас. %): хлорид калия - 1.0, ацетат натрия - 0.5, глюкоза - 1.0, агар - 2.0, вода - остальное. Аски имеют тетраэдрическую форму, включают 4 аскоспоры.

На агаризованной среде YP с добавлением глюкозы (2 мас. %) колонии светло-бежевого цвета с ровным краем, матовой поверхностью, линзовидным профилем и пастообразной консистенцией.

При росте в жидкой среде YP ((мас. %): пептон-2, дрожжевой экстракт -1, вода -остальное) с добавлением глюкозы (2 мас. %), при 28°С в течение 24 ч культивирования - жидкость мутная, осадок белый, коагуляции не наблюдается, пристеночных пленок не образует.

Физиолого-биохимические признаки:

Штамм способен к росту как в аэробных, так и в анаэробных условиях.

В качестве единственного источника углерода способен использовать метанол, этанол, глюкозу, глицерин, лактат, сукцинат, не способен ассимилировать мальтозу, сахарозу, ацетат, крахмал, лактозу.

Штамм не способен к росту при 35°С.

Штамм не способен к ассимиляции трегалозы.

При культивировании в присутствии метанола штамм способен синтезировать β-глюканазу.

Изобретение проиллюстрировано следующими фигурами:

Фиг. 1. Экспрессионная кассета 1

Фиг. 2. Экспрессионная кассета 2

Фиг. 3. Электрофорез генов bgl из Bacillus pumilus (линия 1) и bgl26 из Paenibacillus jamilae (линия 2)

Фиг. 4. Фингерпринт штамма Komagataella kurtzmanii Bg5 Y-4660

Изобретение подтверждено следующими примерами.

Пример 1. Конструирование заявляемого штамма

В качестве источника гена bgl26 используют тотальную геномную ДНК штамма Paenibacillus jamilae Bgl ВКПМ В-13193 [Биотехнология, 2019, 35, 4, 15-23]. Синтезируют ДНК гена bgl26 методом ПЦР с использованием праймеров BglP.jam-f (5'-aaagaattcgcggggaatgttttttgggaa-3') и BglP.jam-r (5'-aaagcggccgcttaattgctcgtgtattttacc-3'), содержащих на 5'-концах сайты рестрикции для клонирования - EcoRI и NotI Полученный фрагмент ДНК обрабатывают рестриктазами EcoRI и NotI и клонируют в состав экспрессионного вектора рАОХ-cre [Биотехнология 2019 Т. 35 №5 С. 20-28], в результате чего получают плазмиду pAOX-cre-Bgl26, в состав которой входят следующие генетические элементы:

1. Ген bgl26 _Paenibacillus jamilae, встроенный в единую рамку считывания с нуклеотидной последовательностью сигнального пептида α-фактора, под контролем АОХ1 промотора

2. Терминатор транскрипции ТТАОХ1

3. Кассета, фланкированная сайтами lох66 и lох71, в состав которой входит ген устойчивости к генетицину (G418) - kanМХ - под контролем дрожжевого TEF-промотора, и ген cre, кодирующий рекомбиназу бактериофага Р1 под контролем АОХ1-промотора P. pastoris

4. Селективный маркер для клеток Е.coli - ген bla, кодирующий β-лактамазу, придающий клеткам устойчивость к ампициллину.

6. Бактериальный pUC origin.

Для получения интегративной экспрессионной кассеты 1 (фиг. 1) плазмиду pAOX-cre-Bgl26 обрабатывают эндонуклеазой рестрикции BglII и используют для трансформации клеток дрожжей.

Указанную интегративную экспрессионную кассету трансформируют в клетки Komagataella kurtzmanii ВКПМ Y-727. Процедуру трансформации осуществляют методом электропорации [Тюрин О.В. Разработка системы экспрессии генов на основе метилотрофных дрожжей Komagataella kurtzmanii: диссертация канд. биол. наук. ГосНИИгенетика, Москва, 2014.].

Селекцию трансформантов ведут на агаризованной среде YPD (мас. %: дрожжевой экстракт - 1, пептон - 2, агар - 2, глюкоза - 2, вода - остальное) в течение 5 суток при температуре 30°С. В качестве селективного агента добавляют антибиотик G418 в количестве 500 мкг/мл.

Для отбора наиболее продуктивного штамма и выщепления маркерного гена проводят культивирование в жидкой ферментационной питательной среде YP (мас. %: дрожжевой экстракт - 1, пептон - 2, вода - остальное) с добавлением метанола (3 мас. %) в 96-луночных планшетах при 30°С в течение 72 ч на качалке (250 об/мин). В качестве контроля используют штамм Komagataella kurtzmanii ВКПМ Y-727.

Определение активности β-глюканазы в культуральной жидкости проводят с использованием динитросалициловой кислоты (ДНС - метод) [Anal. Chem., 1959, 31 (3), 426-428] в 96-луночном планшете следующим образом. В каждой лунке смешивают 25 мкл 1% раствора субстрата β-глюкана ячменя в 0,5 М ацетатном буфере (рН 6) и 25 мкл культуральной жидкости. Инкубацию проводят при 50°С 10 минут, после чего добавляют в лунку 50 мкл раствора ДНС. Планшет прогревают при 99°С 10 минут и измеряют оптическую плотность окрашенного раствора при длине волны 546 нм. В качестве стандарта используют раствор глюкозы.

По результатам ферментации отбирают наиболее продуктивный трансформант. Клетки отобранного трансформанта рассевают до отдельных колоний на агаризованную питательную среду YPD. Для дальнейших исследований отбирают колонии, не способные к росту в присутствии антибиотика G418. Таким образом отобран штамм Komagataella kurtzmanii Bg99 с выщепленным маркерным геном, который при культивировании в планшете синтезирует эндо-1,3-1,4-β-глюканазу в количестве 285 ед/мл культуральной жидкости.

В качестве источника гена bgl используют тотальную геномную ДНК штамма Bacillus pumilus Bg57 ВКПМ В-13195. [Биотехнология, 2018, Т. 34, №5, С. 12-22] Синтезируют ДНК гена bgl методом ПЦР с использованием праймеров bgl-pum-1 и bgl-pum-2, содержащих на 5'-концах сайты рестрикции для клонирования -EcoRI и NotI, соответственно:

Полученный фрагмент ДНК обрабатывают рестриктазами EcoRI и NotI и клонируют в состав экспрессионного вектора рАОХ-cre [Биотехнология 2019 Т. 35 №5 С. 20-28], в результате чего получают плазмиду pAOX-cre-Bglpum, в состав которой входят следующие генетические элементы:

1. Ген bgl_Bacillus pumilus, встроенный в единую рамку считывания с нуклеотидной последовательностью сигнального пептида αа-фактора, под контролем АОХ1 промотора

2. Терминатор транскрипции ТТАОХ1

3. Кассета, фланкированная сайтами lох66 и lох71, в состав которой входит ген устойчивости к генетицину (G418) - kanМХ - под контролем дрожжевого TEF-промотора, и ген сге, кодирующий рекомбиназу бактериофага Р1 под контролем АОХ1-промотора P. pastoris

4. Селективный маркер для клеток Е. coli - ген bla, кодирующий β-лактамазу, придающий клеткам устойчивость к ампициллину.

7. Бактериальный pUC origin.

Для получения интегративной экспрессионной кассеты 1 (фиг. 2) плазмиду pAOX-cre-Bglpum обрабатывают эндонуклеазой рестрикции BglII.

Указанную интегративную экспрессионную кассету трансформируют в клетки штамма Komagataella kurtzmanii Bg99. Процедуру трансформации, отбор наиболее активных клонов и выщепление маркерного гена проводят как описано выше.

Таким образом отбирают штамм Komagataella kurtzmanii Bg5 с выщепленным маркерным геном, который при культивировании в планшете синтезирует эндо-1,3-1,4-β-глюканазу в количестве 430 ед/мл культуральной жидкости. Штамм депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» ГосНИИгенетика как Komagataella kurtzmanii_Bg5 ВКПМ Y-4660.

Для подтверждения наличия в хромосоме полученного штамма вставки генов bgl26 Paenibacillus jamilae и bgl Bacillus pumilus методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) используют хромосомальную ДНК, выделенную из клеток этого штамма и пары специфических праймеров BglP.j-f/BglP.j-r и BglPumf / BglPum-r

Режим реакции ПЦР:

95°С - 3 мин - 1 цикл

30 циклов:

95°С - 30 сек.

57°С - 30 сек.

72°С - 60 сек.

72°С - 5 мин. - 1 цикл

Для контроля величины амплифицированных фрагментов ДНК при электрофорезе использован молекулярный маркер GeneRuler 1 kb DNA Ladder (Fermentas) (линия 2, фиг. 2, размер фрагментов снизу вверх 10000, 8000, 6000, 5000, 4000, 3500, 3000, 2500, 2000, 1500, 1000, 750, 500, 250 п.н.). Выявление фрагментов ДНК размером 642 п.н. (линия 1 фиг. 3) и 645 п.н (линия 2 фиг. 3) свидетельствует о присутствии в хромосоме штамма вставки генов bgl26 Paenibacillus jamilae и bgl Bacillus pumilus.

На фиг. 4 представлены результаты ПЦР-фингерпринта штамма Komagataella kurtzmanii Bg3 ВКПМ Y-4621.

Фингерпринт проведен методом полимеразной цепной реакции (PCR) с использованием неспецифических праймеров М13 (линия 2 фиг. 3) и 1254 (линия 3 фиг. 3).

Праймер М13 gagggtggcggttct

режим реакции:

1 цикл

95°С - 3 мин.

39 циклов

95°С - 30 сек.

45°С - 30 сек.

72°С - 2 мин.

1 цикл

72°С - 5 мин

Праймер 1254 ccgcagccaa

режим реакции:

1 цикл

95°С - 3 мин.

39 циклов

95°С - 30 сек.

48°С - 30 сек.

72°С - 1 мин.

1 цикл

72°С - 5 мин

Для контроля величины фрагментов ДНК при электрофорезе использован молекулярный маркер 1kb DNA GeneRuler (Fermentas) (линия 1, фиг. 3 размер фрагментов снизу вверх 10000, 8000, 6000, 5000, 4000, 3500, 3000, 2500, 2000, 1500, 1000, 750, 500, 250 п.н.).

Пример 2. .Получение эндо-1,3-1,4-β-глюканазы с использованием штамма Komagataella kurtzmanii Bg5 ВКПМ Y-4660

Посевную культуру выращивают в пробирках (50 мл) с 10 мл жидкой питательной среды YP с добавлением глюкозы (2 мас. %) при 30°С в течение 24 ч на качалке (250 об/мин). Посев ферментационной среды осуществляют в соотношении 1/10.

Ферментацию проводят при 30°С на качалке (250 об/мин) в питательной среде YP с добавлением глюкозы (1 мас. %) в пробирках (50 мл) с рабочим объемом 5 мл. Через 18 часов добавляют метанол (1 мас. %) Ферментацию продолжают в течение 72 часов, добавляя метанол (1 мас. %) через каждые 24 часа. После окончания ферментации определяют количество фермента в культуральной жидкости с использованием ДНС метода.

Через 72 часа ферментации количество эндо-1,3-1,4-β-глюканазы составила 1522 ед/мл культуральной жидкости.

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и касается получения штамма дрожжей Komagataella kurtzmanii, продуцирующего эндо-β-1,3-1,4-глюканазу. Штамм дрожжей Komagataella kurtzmanii депонирован под номером ВКПМ Y-4660. Данный штамм содержит ген, кодирующий эндо-β-1,3-1,4-глюканазу из Paenibacillus jamilae, и ген, кодирующий эндо-β-1,3-1,4-глюканазу из Bacillus pumilus. Изобретение обеспечивает расширение арсенала рекомбинантных микроорганизмов, продуцирующих эндо-β-1,3-1,4-глюканазу. 2 пр., 4 ил.

Штамм дрожжей Komagataella kurtzmanii ВКПМ Y-4660, продуцирующий эндо-β1,3-1,4-глюканазу и содержащий ген, кодирующий эндо-β-1,3-1,4-глюканазу из Paenibacillus jamilae, и ген, кодирующий эндо-β-1,3-1,4-глюканазу из Bacillus pumilus.