Способ выявления СнLамYDIа тRасноматIY Советский патент 1992 года по МПК C12Q1/04 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для диагностики урогенитальных хламидиозов.

Наиболее достоверным методом диагностического подтверждения хламидиозов у больных является выделение хламидий в культуре чувствительных клеток.

Однако, почти все возбудители вида С. trachomatis практически не обладают способностью инфицировать клетки in vitro и размножаться в них в обычных условиях.

i

В связи с этим для диагностического выделения хламидий используют перевиваемые линии клеток фибробластов мыши 1- 929, Me Coy, а также клетки человека Hela-229, которые обрабатывают различными методическими приемами, повышающими чувствительность клеток и усиливающими процессы адсорбции, проникновения и развития хламидий в них.

С этой целью применяют обработку монослоя клеток ДЭАЭ-декстраном, антимета- болитами (циклогексимидом, 5-йод-2 дезоксиуридином (ИДУ), облучение монослоя клеток у или X лучами, центрифугирование инокулята на монослой, а также сочетание физико-химических воздействий.

Используют чувствительную культуру клеток, адаптированную к среде 199 с 10% сыворотки КРС и выращенную во флаконах или пробирках в течение 24-48 ч.

При обработке-ДЭАЭ-декстраном перед заражением клеток среду роста удаляют и вносят 1 мл рабочего раствора ДЭАЭ-де- кстрана (90 мгк/мл) на 30 мин. Перед заражением монослоя среду, содержащую ДЭАЭ-декстран, удаляют. Обработанную культуру клеток инфицируют исследуемым материалом по 0,2 мл. Затем пробирки с материалом центрифугируют в горизонтальном роторе (2900 g 1 ч при 30-34°С. После

fe

ч|

hO

со

ю ю

центрифугирования инокулят удаляют, вносят 1 мл среды следующего состава: среда 199с 5% фетальной сыворотки КРС и ,0,5 мл 5%-ного раствора глюкозы, а также антиби- отики-стрептомицина 200 мкг/мл, нистатина 125 мкг/мл, канамицина 100 мкг/мл и инкубируют 48-72 ч при 36°С.

В случае использования антиметаболитов циклогексимид добавляют в среду после заражения клеток в концентрации 1-2 мкг/мл, ИДУ обрабатывают суточный монослой клеток за 3 дня до инокуляции. Оценку первичного заражения клеток проводят через 3 сут в препаратах монослоя, окрашенного по Романовскому-Гимзе (по обнаружению морфологических структур хламидий)и иммунолюминесцентным методом (по обнаружению хламидийного антигена).

При использовании указанных методов процент диагностического в.ыделения хламидий составляет от 20 до 70, а процесс изоляции хламидий продолжается 3-5 дней, так как для заражения используют 1-2-су- точную культуру чувствительных клеток,

Недостатками этого метода являются трудоемкость исследования; необходимость использования дорогостоящих дефицитных реагентов и фетальной сыворотки КРС; продолжительный срок исследования (от 3 до 5 дней).

Известен также метод выделения С. trachomatis в чувствительной перевиваемой клеточной культуре эпителия эмбриона мыши (ММС-Е) при заражении монослоя без дополнительной обработки клеток, позволяющий сократить сроки изоляции возбудителя до 1-2 дней.

Недостатки этого метода: отсутствие указанной культуры клеток в СССР, необходимость использования дефицитной фетальной сыворотки КРС.

Цель изобретения - упрощение способа, повышение эффективности и сокращение срока изоляции хламидий.

Поставленная цель достигается за счет предварительного накопления возбудителя непосредственно в эпителиальных клетках соскоба урогенитального тракта, по отношению к которым С. trachomatis обладает выраженным тропизмом и в них происходит размножение возбудителя после заражения человека; использования чувствительной клеточной культуры первично-трипсинизирован- ных клеток фибробластов эмбриона мыши; заражения указанной культуры клеток не на монослой, а во взвесь клеток без их предварительной обработки.

Обнаружение морфологических структур хламидий и их антигена проводят указанными выше методами через 24 ч после заражения, а при отрицательных результатах - через 48 ч. Срок диагностического вы- деления хламидий из исследуемого

материала от больных составляет 2-3 дня, а процент положительных находок - 63%. Этот показатель практически не уступает таковым, полученным при использовании трудоемких методов с применением дорого0 стоящих дефицитных реагентов.

Поставленная цель достигается тем, что для накопления возбудителя в эпителиальных клетках соскобного материала больных пробы инкубируют в термостате при 36°С в

5 течение 24 ч. Затем инокулят вносят непосредственно во взвесь чувствительной первично-т рипсинизированной культуры клеток фибробластов эмбриона мыши без дополнительной обработки.

0П р и м е р 1. Исследуемый материал,

взятый ложкой Фолькмана со слизистой мочеполовых органов больного, помещают во . флакон с 2 мл охлажденной транспортной Среды с антибиотиками (среда 199 с 5% сы5 воротки КРС или сахарозо-фосфатный раствор рН-7,0-7,1 с 5% той же сыворотки и гентамицина 2 мкг/мл). После 3-часовой экспозиции в холодильнике при +4°С флаконы помещают в термостат на 24 ч при 36°С.

0 Затем исследуемый материал центрифугируют при 2500 g 10 мин и центрифугат используют для заражения во взвесь чувствительных первично-трипсинизиро- ванных клеток фибробластов эмбриона мы5 шис последующей инкубацией в термостате при Зб°С в течение 24-48 ч.

Получение первйчно-трипсинизирован- ных клеток фибробластов эмбриона мыши. Белых мышей в последние дни беремен0 ности вскрывают под наркозом, извлекают эмбрионы, освобождают от внутренних органов, обезглавливают, отмывают 2-3.раза раствором Хенкса с антибиотиками, измельчают ножницами и трипсинизируют. Трип5 син удаляют и клетки вносят в среду следующего состава (среда 199+5% десятикратного концентрата этой же среды +10% бычьей сыворотки +гентамицин 2 мгк/мл). Полученную взвесь клеток эмбриона мыши

0 разливают в пенициллиновые флаконы с покровными стеклами по 1,5-2х105 клеток в 1 мл и сразу же во взвесь клеток вносят цент- рифугат соскобного материала после предварительного накопления возбудителя по

5 0,1 мл в каждый из 4 флаконов, используемых для исследования одного заражающего материала (пробы). Флаконы с инокулятом без дополнительной обработки помещают в термостат при 36°С на 24 ч. По истечении указанного срока покровные стекла с зараженным монослоем клеток из двух флаконов извлекают, промывают фосфатно-соле- вы-м буферным раствором, подсушивают на воздухе и фиксируют одно из них 10 мин в 96° этаноле, а другое - 15-20 мин в охлажденном ацетоне для окрашивания по Рома- новскому-Гимзе и иммунолюминесцентным методом соответственно. Оценку результатов заражения клеток проводят по выявлению морфологических структур хламидий (при окраске по Романовскому-Гимзе) и их антигена (в реакции иммунолюминесцен- ции).

П р и м е р 2. Больной К., 43 лет, история болезни Мг 146. Диагноз: хронический урет- ропростатит хламидийной этиологии.

Для исследования забирают соскобный материале-эпителии слизистой уретры, помещают во флакон с 2 мл транспортной среды и оставляют при +4°С на 3 ч. Затем исследуемый материал делят на 2 части. Одну часть в объеме 1 мл вносят во флакон с ростовой средой и помещают в термостат на 24 ч при J36°C для предварительного накопления возбудителя в эпителиальных клетках взятого соскоба (исследуемого материала).

По истечении указанного срока исследуемый материал центрифугируют при 2500д 10 мин и центрифугатпоО,1 мл вносят в пенициллиновые флаконы с покровными стеклами, содержащие взвесь первично- трипсинизированных клеток фибробластов эмбриона мыши, приготовленную ех tempore.

Флаконы с ин,ркулятом инкубируют в термостате при в течение 24-48 ч, после чего покровные стекла с инфицированным монослоем клеток извлекают, промывают фосфатно-солевым буферным раствором (ФСБР), подсушивают на воздухе, фиксируют 10 мин в 96° спирте для окраски по Романовскому-Гимзе и 15 мин в холодном ацетоне для окраски люминесци- рующими антителами. Другую часть исследуемого материала (без предварительного накопления возбудителя) в объеме 1 мл вносят по 0,2 мл во флаконы с выращенным на

покровных стеклах монослоем двухсуточной культуры перевиваемых клеток 1-929. Флаконы с материалом центрифугируют на горизонтальном роторе в течение 1 ч при 2400 g для принудительной адсорбции возбудителя на клетках. После этого во флако- ны вносят поддерживающую среду и инкубируют в течение 24-48 ч. Через 24-48 ч после заражения покровные стекла извлекают, фиксируют и окрашивают аналогичным способом.

В таблице приведены сравнительные показатели выделения С. trachomatis при заражении на монослой перевиваемой культуры клеток 1-929 и во взвесь первично- трипсинизированных клеток фибробластов эмбриона мыши.

Как видно из данных таблицы, процент выделения С trachomatis при заражении во

взвесь первично-трипсинизированных клеток фибробластов эмбриона мыши после предварительного накопления возбудителя в исследуемом материале был достоверно (,05) выше по сравнению с методом заражения на монослой перевиваемых клеток 1-929 с применением дополнительного центрифугирования.

Таким образом, использование исследуемого материала от больных после предверительного накопления для заражения во взвесь первично-трипсинизированных клеток эмбриона мыши позволяет упростить метод выделения хламидий, повысить эффективность выделения возбудителя и сократить срок исследования.

Формула изобретения Способ выявле ния Chlamydia trachomatis путем соскоба эпителия уроге- ниталий с последующим заражением полученным материалом клеточной культуры, инкубированием, приготовлением препаратов и их исследованием, отличающийся тем, что, с целью повышения эффективности и ускорения способа, полученный материал

предварительно выдерживают при 36°С в течение 24 ч, а для заражения используют первично трипсинизированные клетки фиб- роблэстов эмбриона мыши.

Заражение на монослой перевиваемой культуры клеток 1-929 исследуемым материалом от больных с применением дополнительного центрифугирования

Заражение во взвесь первично-трипсинизи- рованной культуры клеток фибробластов эмбриона мыши исследуемым материалом после предварительного накопления возбудителя

1(8

19 . 39.5

3-5

55

35 63,02-3

,05

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для диагностики урогенитальных хламидиозов. Целью изобретения является упрощение способа, повышение эффективности и сокращение сроков изоляции хламидий. Поставленная цель достигается предварительным накоплением возбудителя непосредственно в эпителиальных клетках соскобного материала урогенитального тракта, использованием чувствительной клеточной культуры первично-трипсинизированных клеток фибробластов эмбриона мыши, заражением во взвесь указанной культуры без предварительной обработки. Предлагаемый способ позволяет сократить сроки исследования больных и повысить эффективность диагностики. 1 табл.