ВАКЦИНА КУЛЬТУРАЛЬНАЯ ИНАКТИВИРОВАННАЯ ПРОТИВ ХЛАМИДИОЗА СВИНЕЙ Российский патент 2004 года по МПК A61K39/118 C12N1/20 

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и вирусологии, в частности к производству вакцин, применяемых для специфической профилактики и терапии сельскохозяйственных животных от заболевания хламидиозом. Вакцина содержит в качестве антигена цитопатогенный штамм Chlamydia psittaci (var. suis) ВГНКИ "SR" №14, выращенный на монослое первичной культуры клеток фибробластов эмбрионов кур (ФЭК) с титром не ниже 10^-7 ТЦД_50/мл. Вакцина также содержит инактиватор - фенол и впервые используемый адьювант - поливинилпирролидон. Вакцина специфична, высокоиммуногенна и имеет низкую реактивность.

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и вирусологии, в частности к производству вакцин, применяемых для специфической профилактики и терапии сельскохозяйственных животных от заболевания хламидиозом.

Известна вакцина против энзоотического аборта овец инактивированная, изготовленная из зараженных хламидиями куриных эмбрионов (Franc et al. Am. j. Vet. Pec., Vol. 29, p. 1441, 1968). Недостатком данной вакцины являются ее высокая стоимость, ее изготовление требует больших затрат времени, высокое содержание баластных белков снижает ее иммуногенность и повышает реактогенность. Эта вакцина не содержит специфического антигена и поэтому неиммуногенна для птиц. Данная вакцина выбрана нами в качестве прототипа.

Наиболее близким по технической сущности является патент США №4386065, А 61 К 39/118, 1983. "Вакцина против энзоотического аборта овец", которая включает в себя смесь водной суспензии, инактивированных формалином хламидийных элементарных телец, полученных из организмов chlamydia SP в пределах от 2·10⁶ до 10⁹ ELD_50/мл, размноженных в клеточной культуре, и равного количества маслянного адъюванта, представляющего собой смесь светлого минерального масла и ланолина.

Недостатком этой вакцины является то, что штамм хламидий, как продуцент, не обладает цитопатическим действием. Вследствие этого для контроля накопления хламидий необходимо ежедневно готовить мазки, проводить их окраску и подсчет зараженных клеток, а при сборе сырья требуется инфицированный монослой отделить от ростовой поверхности с помощью трипсина с верстном. Для создания нужной концентрации хламидий в вакцине культуральную суспензию подвергают центрифугированию. К тому же один стационарный монослой используется как посевной материал только для пяти чистых монослоев или их эквивалентов. Все эти операции усложняют технологический процесс производства и снижают производительность при изготовлении вакцины, что делает ее дороже. К тому же вакцина профилактирует только энзоотические аборты хламидиозной природы у овец и не профилактирует хламидиоз у свиней.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Задачей данного изобретения является создание специфичной, высокоиммуногенной вакцины для профилактики хламидиоза свиней, имеющей низкую реактогенность и получаемой более простым (в сравнении с прототипом) технологическим способом. Поставленная задача достигнута благодаря тому, что вакцина культуральная инактивированная против хламидиоза свиней в качестве антигена, содержит цитопатогенный штамм Chlamydia psittaci (var. suis) ВГНКИ "SR" №14, выращенный на монослое первичной культуры клеток фибробластов эмбрионов кур с титром не ниже 10^-7 ТЦД_50/мл, в качестве адъюванта впервые нами использован поливинилпирролидон, а также фенол при следующих процентных соотношениях:

1. Суспензия клеток ФЭК (фибробластов эмбрионов кур), инфицированных хламидиями штамм Chlamydia psittaci (var. suis) ВГНКИ "SR" №14 с титром не ниже 10^-7,0 ТЦД_50/мл - 99-99,5.

2. Фенол - 0,3-0,5.

3. Поливинилпирролидон - 0,4-0,6.

Существенным отличием данной вакцины от ее прототипа является то, что в качестве антигена берут штамм Chlamydia psittaci (var. suis) ВГНКИ "SR" №14, депонированный в коллекцию ВГНКИ ветпрепаратов. Выращивание его ведется на монослое первичной культуры ФЭК.

Целью изобретения является получение штамма Chlamydia psittaci (var. suis) ВГНКИ "SR" №14, обладающего стабильными иммуногенными свойствами, незначительной реактогенностью и высоким цитопатическим действием. Вакцинация инактивированной вакциной, изготовленной из штамма Chlamydia psittaci (var. suis) ВГНКИ "SR" №14, супоросных свиноматок при внутримышечном двукратном введении в дозе 10 мл обеспечивает сохранность новорожденных поросят на 93,3% против 43,6% у невакцинированных контрольных животных (табл. 2).

Штамм Chlamydia psittaci (var. suis) ВГНКИ "SR" №14 депонирован в коллекции Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, сертификации и стандартизации ветеринарных препаратов под номером 14. Штамм Chlamydia psittaci (var. suis) ВГНКИ "SR" №14 выделен в 1976 г. из абортированного плода свиноматки, адаптирован к монослою фибробластов эмбрионов кур (ФЭК). Штамм пассирован через организм свиньи и прошел 307 пасскажей в монослое культуры ФЭК в условиях роллера, в результате чего изменились его первоначальные свойства: возросла способность накопления, выражающаяся в эмбриональных летальных дозах (ЭЛД_50/03 мл) в указанной культуре, ускорился цикл развития цитоплазматических включений, в связи с чем появилась способность штамма оказывать высокое цитопатическое действие на монослой культуры (ФЭК), наряду с этим устойчиво повысилась иммуногенная активность и снизилась реактогенность.

Штамм бактерий Chlamydia psittaci (var. suis) ВГНКИ "SR" №14 обладает следующими свойствами.

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ. Элементарные зрелые частицы округлой формы, диаметром 180-200 нм, инициальные промежуточные формы - до 500-600 нм окрашиваются по методу Стемпа в розово-красный цвет, по Романовскому-Гимза - в темно-голубой цвет.

КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА. Культивируется в желточных оболочках 7-8-дневных куриных эмбрионов, в культуре фибробластов эмбрионов кур, в перевиваемой линии трахеи теленка при 37-37,5°С; пассируется на белых мышах при внутрибрюшинном, назальном, интрацеребральном и подкожном заражении.

АДАПТАЦИОННЫЕ СВОЙСТВА. Штамм - возбудитель хламидиоза свиней, адаптируется к куриным эмбрионам, сохраняя патогенность для свиней, адаптируясь на культуре куриных фибробластов, повышает вирулентность и иммуногенность, при этом титр при титрации на 6-7-дневных куриных эмбрионах составляет 10^6,5-10^7,5 ЭЛД_50/03 мл и сокращается время цикла развития.

ПАТОГЕННЫЕ СВОЙСТВА. Штамм патогенен для морских свинок, вызывает у них аборты, рождение мертвых детенышей и гибель части зараженных животных, патогенен для белых мышей, вызывает заболевание и 100% гибель на 4-6 сутки при интрацеребральном введении.

АНТИГЕННЫЕ СВОЙСТВА. В постановке перекрестной реакции связывания комплемента с гомологичными и гетерологичными антигенами и гипериммунными сыворотками установлено высокое антигенное родство к гомологичному антигену в титре 1:40-1:80 (в реакции связывания комплемента (РСК) по 100% гемолизу). Антигенная близость к другим видам антигенов хламидий на 3-4 разведения отстоит дальше.

ТАКСОНОМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА. Согласно решению Юридической комиссии Международной Ассоциации Микробиологических обществ (МАМО) с 1 января 1980 года определение рассматриваемых микроорганизмов, как Chlamydia, стало обязательным. В соответствии с "The Shorter Bergey's manual of determinative" (1980) хламидии отнесены к царству Procaryotae, отделу 2 прокариотов, индифферентных к свету, т.е. "скотобактериям", классу 2 Ricketsia. В класс Ricketsia включены порядки 1 Ricketsialesu 2 Chamydiales. Семейство Chlamydiaceae, роду Chlamydia, в котором описаны 4 вида: Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis, Chlamydia pecorum, Chlamydia Pneumoniae. Все виды хламидий гетерогенны.

ИММУНОГЕННЫЕ СВОЙСТВА. Пример 1. В опыте были завакцинированы 24 белые мыши инактивированной вакциной, изготовленной из штамма "SR". Вакцину вводят подкожно в дозе 0,2 мл.

Подтитрованным контрольным штаммам "Р" в дозе 0,3 мл с титром 10 ^6,0 ЛД_50/0,3 мл через 14 дней после первого введения вакцины 12 опытных и 12 контрольных белых мышей заражают подкожно. Через 20 дней после введения вакцины также заражают 12 вакцинированных и 12 невакцинированных белых мышей. Результаты представлены в табл. 1, где показано, что штамм Chlamydia psittaci (var. suis) ВГНКИ "SR" №14 обладает иммуногенными свойствами, что позволяет использовать его для изготовления инактивированной вакцины против хламидиоза свиней.

Пример 2. Приготовленную инактивированную вакцину против хламидиоза свиней из штамма Chlamydia psittaci (var. suis) ВГНКИ "SR" №14 испытывают в опытах на свиньях. Вакцину вводят внутримышечно, двукратно с интервалом в 6 дней, в дозе 10 мл шести супоросным клинически здоровым свиноматкам. В качестве контроля используют 6 супоросных невакцинированных свиноматок. Вакцинированные и контрольные животные через 24 дня заражаются внутрибрюшинно суспензией хламидий, изолированных из паренхиматозных органов мертворожденного поросенка, в титре 10⁷ ЭЛД₅₀ и в объеме 20 мл.

Результаты иммуногенности вакцины представлены в табл. 2.

Таким образом, вакцина, изготовленная из штамма Chlamydia psittaci (var. suis) ВГНКИ "SR" №14, обеспечивает у вакцинированных свиноматок сохранность поросят 93,3% против 43,6% у невакцинированных животных.

Вторым существенным отличием является то, что в качестве адъюванта в вакцину вводят поливинилпирролидон (ПВП). Поливинилпиролидон - белый порошок, хорошо растворимый в воде, применяется как пролонгатор лекарственных средств. Ему присуще дезинтоксическое и противовоспалительное действие. В нашем препарате ПВП существенно повышает иммуногенность вакцины за счет того, что связывает (адсорбирует) антигенные белки.

Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что заявляемый состав вакцины отличается от известного введением новых компонентов, а именно нового штамма Chlamydia psittaci (var. suis) ВГНКИ "SR" №14 с титром не менее 10^-7,0 ТЦД_50/мл и поливинилпирролидона в качестве адъюванта, а также соотношением компонентов.

Таким образом, заявляемое техническое решение является новым. Введение в качестве адъюванта поливинилпирролидона существенно повышает иммуногенность вакцины по сравнению с вакциной, содержащей в качестве адъюванта вазелиновое масло. Для доказательства был проведен следующий опыт. Восьми морским свинкам вводилась культуральная инактивированная вакцина, изготовленная из штамма Chlamydia psittaci (var. suis) ВГНКИ "SR" №14, содержащая в качестве адъюванта вазелиновое масло, и восьми морским свинкам - вакцина, содержащая в качестве адъюванта поливинилпирролидон. Вакцина вводилась подкожно, трехкратно с интервалом 7 дней в дозе 0,2 мл. Иммуногенность вакцины оценивалась по результатам РСК (с сывороткой крови опытных морских свинок, взятой через 20 дней после последнего введения вакцины). Результаты представлены в табл. 3.

Из табл. 3 следует, что иммуногенность вакцины с поливинилпирролидоном, используемым в качестве адъюванта, значительно выше, чем вакцины с вазелиновым маслом, использованным в качестве адъюванта.

Таким образом, данный состав компонентов придает вакцине новые свойства, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию "изобретательский уровень".

Пример 1 (оптимальный вариант)

Приготовление культуры клеток ФЭК, заражение ее хламидиями производили по общепринятой методике (Л.П.Дьяконов и др. Культивирование клеток и тканей животных. Ч. 1. - Ставрополь, 1986 г.). Затем суспензию клеток ФЭК, инфицированных хламидиями штамма Chlamydia psittaci (var. suis) ВГНКИ "SR" №14, подвергали контрольным высевам на бактериальную и грибковую контаминацию. После этого чистую, не контаминированную, суспензию брали для определения титра ТЦД_50/мл. Титр определяли по общепринятой методике и подсчитывали по методу Рида и Менча. В данном примере он равен 10^-7,0 ТЦД_50/мл.

Затем смешивали компоненты в следующих соотношениях: суспензии клеток ФЭК, инфицированных хламидиями, 99,1 мас.%, фенол 0,35 мас.%, поливинилпирролидон 0,55 мас.%. Полученную смесь выдерживали в течение 96 часов при температуре +10°С.

Далее проводили выборочный контроль на иммуногенность. Для этого брали восемь морских свинок и вводили им вакцину по следующей схеме:

1-е введение - подкожно 0,2 мл;

2-е введение - подкожно через 7 суток 0,2 мл;

3-е введение - подкожно через 14 суток 0,2 мл.

Контролем служили четыре морских свинки, которым вакцина не вводилась. Через три недели после последнего введения вакцины определяли уровень накопления антител в сыворотке крови морских свинок в реакции связывания комплемента (РСК). Результат: четыре креста в разведении 1:5, четыре - в разведении 1:10, два - в разведении 1:20.

Аналогично делали для титра 7,5; 7,75; 6,5; 6,0; 5,5 ТЦД_50/мл Сведения приведены в табл. 3.

Таким образом, титр хламидийного штамма 7,0 обеспечивает высокое накопление антител в сыворотке крови морских свинок. Вакцина с качеством, приведенным в примерах 1, 4, 5, считается пригодной для применения на свиньях. В целях экономии штамного материала при получении титра выше 7,8 ТЦД_50/мл суспензия разводится питательной средой ГЛА до титра, приведенного в примерах 1, 4, 5. Титр штамма ниже 6,5 ТЦД_50/мл (пример 6) не обеспечивает необходимого накопления хламидий и не применяется для иммунизации морских свинок.

В данном опыте отчетливо видна зависимость титра антител в сыворотке крови морских свинок от титра штамма Chlamydia psittaci (var. suis) ВГНКИ "SR" №14. Этот тест взят нами в качестве контроля иммуногенности вакцины при ее изготовлении.

Пример 7. Приготовление культуры клеток ФЭК, заражение ее хламидиями, выращивание и накопление их производили по общепринятой методике. Затем суспензию клеток ФЭК, инфицированных хламидиями штамма Chlamydia psittaci (var. suis) ВГНКИ "SR" №14, подвергали контрольным высевам для проверки на бактериальную и грибковую контаминацию и одновременно определяли усредненный титр ТЦД_50/мл, который в данном примере равен 10^-7,2 ТЦД_50/мл.

Чистую, неконтаминированную бактериальной и грибковой флорой клеточную хламидийную суспензию, объединяли в общую стерильную емкость и проводили инактивацию хламидий фенолом. Для этого в емкости смешивали компоненты в следующем соотношении: суспензии клеток ФЭК, инфицированных хламидиями, брали 99,2 мас.%, а инактиватора (фенола) добавляли 0,4 мас.%. Полученную смесь выдерживали в течение 98 часов при температуре +10°С. Затем добавляли 0,4 мас.% адъюванта (поливинилпирролидона). Затем проводили выборочный контроль на полноту инактивации. Для этого 10 развивающимся куриным эмбрионам 7-суточной инкубации стерильно вводили в полость желточного мешка 0,3 мл вакцины и инкубировали их при 37,0-37,5°С в течение 12 суток. В качестве контроля использовали 10 эмбрионов, которым вводили не инактивированную клеточную взвесь, содержащую штамма Chlamydia psittaci (var. suis) ВГНКИ "SR" №14. Условия инкубации такие же. Опытные эмбрионы оставались живыми в течение 12 суток. В мазках-отпечатках, изготовленных из оболочек желточного мешка, окрашенных по методу Романовского-Гимза, хламидии не обнаруживались. Контрольные эмбрионы пали на 5-7 сутки. Этот результат соответствует установленному контролю вакцины на полноту инактивации.

Аналогично делали для следующих количеств фенола: 0,3 мас.%; 0,2 мас.%; 0,5 мас.%; 0,6 мас.%. Результаты приведены в табл. 4. Исходя из данных приведенных в табл. 4, видно, что количество инактиватора в интервале от 0,3 до 0,5 мас.% обеспечивает полноту инактивации хламидий в суспензии. Выше 0,5 мас.% фенол не добавляют с целью его экономии, т.к. качества вакцины это не улучшает. Концентрацию инактиватора ниже 0,3 мас.% не допускают, т.к. это не обеспечивает полной инактивации хламидий.

Пример 12. Приготовление культуры ФЭК, заражение ее хламидиями, их выращивание и накопление проводили по общепринятой методике. Затем суспензию клеток ФЭК, инфицированных хламидиями штамма Chlamydia psittaci (var. suis) ВГНКИ "SR" №14, подвергали контрольным высевам для проверки на бактериальную и грибковую контаминацию. Если тест оказывался отрицательным, то выборочно определяли титр ТЦД_50/мл, который в этом примере равен 7,3 ТЦД_50/мл. Затем смешивали компоненты в следующих соотношениях: суспензии клеток, инфицированных хламидиями, брали 99,3 мас.%, фенола - 0,3 мас.% (смесь выдерживали 10° часов при -6°С). Поливинилпирролидона вводили 0,4 мас.%. Процесс вели следующим образом: навеску адъюванта и инактивированную суспензию клеток, содержащую антиген штамма Chlamydia psittaci (var. suis) ВГНКИ "SR" №14, оставляли при комнатной температуре до его полного растворения - 24 часа. Затем проводили контроль на иммуногенность так же, как в примере 1. Результат следующий: в разведении 1:5 - ++++; в разведении 1:10 - ++++; в разведении 1:20 - ++. Аналогично делали для 0,3 мас.%. Результаты приведены в табл. 5.

Как указано в табл. 5, содержание адъюванта в интервале значений от 0,4 до 0,6 мас.% обеспечивает иммуногенность вакцины в соответствии с установленным контролем. Количество адъюванта, превышающее 0,6 мас.%, не применяется с целью его экономии. Существенного улучшения качества вакцины при увеличении содержания в ней адъюванта свыше 0,6 мас.% не происходит.

Содержание адъюванта ниже 0,4 мас.% не допускается, т.к. иммуногенность такой вакцины ниже установленного контроля вакцины и она не вызывает надежного иммунного ответа у птицы.

Пример 17. Приготовление культуры клеток ФЭК, заражение ее хламидиями, их выращивание и накопление проводили по общепринятой методике. Затем суспензию клеток ФЭК, инфицированных штаммом Chlamydia psittaci (var. suis) ВГНКИ "SR" №14, подвергали контрольным высевам для проверки на бактериальную и грибковую контаминацию. При отрицательном результате теста определяли средний титр ТЦД_50/мл, который в этом примере равен 7,4 ТЦД_50/мл. Затем смешивали компоненты в следующих соотношениях: суспензии клеток ФЭК, инфицированных хламидиями, брали 99,25 мас.%; фенола - 0,35 мас.%, поливинилпирролидона - 0,4 мас.%. Затем проводили контроль на иммуногенность, как в примере 1. Результаты РСК следующие: в разведении 1:5 - ++++; в разведении 1:10 - ++++; в разведении 1:20 - +++. Аналогично делали для 99; 98; 99,5 и 99,7 мас.% суспензии клеток ФЭК, инфицированных штаммом Chlamydia psittaci (var. suis) ВГНКИ "SR" №14. Результат представлен в табл. 6.

Как указано в табл. 6, содержание суспензии клеток ФЭК, инфицированных хламидиями штамма Chlamydia psittaci (var. suis) ВГНКИ "SR" №14, в пределах от 99,0 до 99,5 мас.% обеспечивает иммуногенность вакцины в соответствии ее контролем. Количество культуральной клеточной суспензии выше 99,5 мас.% не применяется, т.к. это не улучшает качества вакцины, а увеличивает расход ее дорогостоящих компонентов. Использование культуральной клеточной суспензии в количестве ниже 99,0 мас.% также не допускается, т.к. вакцина при этом не обладает иммуногенностью, соответствующей установленному контролю вакцины, и не вызывает развитие надежного иммунитета у свиней.

ТЕХНИЧЕСКИЙ РЕЗУЛЬТАТ

Вакцина профилактирует возникновение на почве хламидиоза у свиноматок: хронического бесплодия (удлинений сервис-периода и аритмию полового цикла), выкидыши, аборты, рождение мертвого приплода, рождение клинически больных и латентно инфицированных поросят, хронические пневмонии.

У поросят: энтериты, бурситы, бронхопневмонии, задержку роста и развития на фоне иммунодефицита.

У хряков: хронические пневмонии, артриты, бурситы, воспаления семенного канатика.

Кроме того, вакцина сокращает загрязнение окружающей среды хламидиями, являющимися антропозоонозами, а также снижает затраты неблагополучного хозяйства на проведение малоэффективных лечебно-профилактических мероприятий с применением антибиотиков и других лечебных средств. Вакцина безвредна. В целом эффективность вакцины составляет 90-93%.

Источники информации

1. Л.П.Дьяконов, В.Ф.Глухов и др. Культивирование клеток и тканей животных. Учебно-методическое пособие (ч. 1). - Ставрополь, 1986 г.

2. Описание к патенту США №4386065, МКИ А 61 К 39/, 1983.

3. А.с. N 645369, з. N 2528058, МКИ С 12 К 5/00.

4. А.с. N 660390, з. N 2528670, МКИ С 12 К 5/00.

5. А.с. N 661017, з. N 2528672, МКИ С 12 К 5/00.

6. А.с. N 666203, з. N 2528672, МКИ С 12 К 5/00.

7. А.с. N 666202, з. N 2528669, МКИ С 12 К 5/00.

8. А.с. N 655160, з.N 2528668, МКИ С 12 К 5/00.

9. Описание к патенту №2125465.

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии. Вакцина содержит в качестве антигена суспензию клеток фибробластов эмбрионов кур (ФЭК), инфицированных хламидиями штамма Chlamydia psittaci (var. suis) ВГНКИ “SR” №14 с титром не ниже 10^-7 ТЦД_50/мл 99,0-99,5; фенол 0,3-0,5; поливинилпирролидон 0,4-0,6 мас.%. Вакцина обладает высокой иммуногенностью, безвредна. 6 табл.

Вакцина против хламидиоза свиней культуральная инактивированная, содержащая антиген хламидий, адъювант и инактиватор, отличающаяся тем, что в качестве антигена она содержит суспензию клеток фибробластов эмбрионов кур (ФЭК), инфицированных хламидиями штамма Chlamydia psittaci (var. suis) ВГНКИ "SP" №14 с титром не ниже 10^-7 ТЦД_50/мл, инактиватор - фенол и адъювант - поливинилпирролидон при следующем соотношении ингредиентов, мас.%:

Суспензия клеток ФЭК, инфицированных

хламидиями штамма Chlamydia psittaci (var. suis)

ВГНКИ "SR" №14 с титром не ниже 10^-7 ТЦД_50/мл 99,0-99,5

Фенол 0,3-0,5

Поливинилпирролидон 0,4-0,6