Штамм культивируемых клеток тестикул эмбриона быка, используемый для накопления вирусов крупного рогатого скота Советский патент 1991 года по МПК C12N5/06 

Изобретение относится к вирусологии, в частности к биотехнологии культуры клеток, и касается получения и применения в качестве клеточного субстрата для накопления вирусов заболеваний крупного рогатого скота.

Целью изобретения является получение перевиваемой линии клеток в качестве клеточного субстрата для репродукции и выращивания вирусов крупного рогатого скота. Для получения перевиваемой линии клеток ТЭБ в качестве исходного материала используют тестикулы эмбриона 8 месячного возраста, полученного от здоровой коровыдонора, свободной от вирусов пневмоэнте- ритов. Ткань тестикул эмбриона быка тщательно измельчают ножницами и отмывают солевым раствором Хенкса с добавлением 500 ед/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина. Кусочки ткани помещают в колбу и проводят щадящую трипсинизацию 0,25%-ным раствором трипсина при 2СЈ2°С. Цикл повторяют 5-6 раз по 5-7 мин, Полученную взвесь клеток центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 мин, Осадок ре- суспендируют в среде Игла MEM с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл ,

о о -N

00

4 Ю

стрептомицина. Клетки с концентрацией 500000 кл/мл высевают в матрасы вместимостью 1000 мл при рН 7,0-7,4. После формирования монослоя на первых -пассажах на 2-3 сут, а в последующих пассажах на 3-6 сут роста, клетки снимают со стекла 0,2%-ным раствором версена с добавлением 50мгхимопсина, подогретымдо37 ±2°С и пересевают в соотношении 1:2.

Штамм характеризуется следующими свойствами.

В условиях термостата при 37/2°С моно- слойные культуры сохраняются в течение 5-7 дней без смены питательной среды при комнатной температуре 20Й°С в течение 4 сут и при 4-6°С 3 сут. На уровне 12 и 17 пассажа заложено на хранение в жидком азоте в сосудах Дьюара соответственно 25 и 32 ампулы, содержащие,по 2 мл суспензии клеток ТЭБ с концентрацией 4-5 10е кл/мл.

Для замораживания суспензии клеток ТЭБ применяют 5 или 10%-ное криозащит- ное вещество ДМСО. Для отогрева замороженные ампулы помещают в водяную баню при 37-40°С. При длительном хранении применяют жидкий азот при минус 196°С. Для восстановления культуры, ТЭБ размораживают при 37 ± 2°С, суспендируют в ростовой среде, высевают в матрасы и культивируют1 в стационарных условиях. Пересев клеток производят через 5-7 дней. Сохранность клеток после замораживания 90-95%.

Перевиваемую линию ТЭБ культивируют при 37°С, рН 7,2-7,4, способ культивирования стационарный, среда ростовая - Игла MEM с добавлением 10%-ной сыворотки крупного рогатого скота, перевивка 1 раз в 5-7 дней. Кпетки снимают со стекла 0,02%-ным раствором версена с добавлением на 0,5 л версена 50 тг химопсина. При посевной дозе 50-100,000 мл/мл монослой образуется на 3-4 сут без смены среды. Кратность рассева 1:2 - 1:3. Монослой состоит из эпителиоподобных полигональных или окружных клеток. Цитоплазма хорошо выражена, ядра округлой формы, хроматин расположен равномерно. Почти в каждом поле зрения выявлены митозы.

Клетки имеют четко выраженный модальный класс по числу хромосом (из 46 проанализированных клеток 28 содержали по 50 хромосом). Кариотип клеток содержит акроцентрические, мета- и субметацентри- ческие хромосомы. В линии выявлено 18 различных маркерных хромосом. Наиболее постоянным для данной линии оказались 10 маркеров: МИ - Ms, Ma, Mn, .

По результатам анализа изоэнзима лак- татдегидрогеназы (ЛДГ) в исследуемой линии ТЭБ и в переично-трипсинизированных клетках почки эмбриона коровы (ПЭК) был

сделан вывод о видовой принадлежности ТЭБ к клеткам быка.

В перевиваемой линии ТЭБ размножаются с цитопатическим эффектом вирусы парагриппа (ПГ - 3, штамм 3 КСМ), вирус

инфекционного ринотрахеита (ИРТ, штамм ТК-А-ВИЭВ), вирус диареи (штамм Орегон С - 24) и аденовирусы (штамм В-10). Титры вирусов через 5-6 дней культивирования достигают соответственно значений

6,0 ±0,5 дГЦД5о/мл, 6,1 ±0,2 Ig ТЦДео/мл, 2,5 ±0,2 Ig ТЦДбО/мл и 6,1 ±0,5 Ig ТЦД-ю/мл. Штамм депонирован в коллекции ВСКК(СХЖ) № 40.

Пример 1. Культуру ТЭБ в количестве

2 3 10 в 1 мл пересевают из расчета 1:2-1:3 во флаконы вместимостью 1000мл с использованием питательной среды Игла MEM с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота. Культуру инкубируют при

37 ± 2°С в термостате в течение 7-8 дней. Ежедневно культуру просматривают под световым микроскопом. Через 7-8 дней, когда монослой клеток становится сплошным, питательную среду из флаконов сливают в сосуд для отходов, а монослой клеток промывают 3 раза солевым раствором Хен- кса для удаления следов сыворотки. Вирус ПГ-3 (шт.З КСМ) вносится в объеме 10 мл и культуру инкубируют 1 ч при 37 ± 2°С для

адсорбции вируса, затем добавляют 120 мл питательной среды без сыворотки. 2 флакона, вместимостью 1000 мл, оставляют для контроля незараженными. В контрольные флаконы вносят 120 мл питательной среды

без сыворотки. Через 6-7 дней, когда в зараженной культуре появляются дегенеративные изменения в 75-90% монослоя, культуру 3 раза замораживают при минус 20 ± 1°С и оттаивают, затем вируссодержащую жидкость сливают и титруют на пробирках для определения титра вируса. Титр вируса по результатам 3-х опытов составляет 5,9 ± 0,5 Ig ТЦДбо/мл.

П р и м е р 2. Подготовку культуры

клеток ТЭБ и процесс культивирования вируса проводят по примеру 1. Вносят вирус ИТР (штамм ТК-А-ВИЭВ) в объеме 10 мл. Через 5-6 дней, когда в культуре появляются дегенеративные изменения в 50-75% монослоя, культуру 3 раза замораживают и оттаивают, а вируссодержащую жидкость титруют на пробирках с культурой ТЭБ для установления титра вируса. Титр вируса по

результатам 3-х опытов составляет 6,0 ±0,2 1дТЦД50/мл.

Пример 3. Подготовку культуры клеток ТЭБ и процесс культивирования вируса проводят по примеру 1. Вносят адено- виру (штамм В - 10) в объеме 10 мл. Через 5 дней, когда появляются дегенеративные изменения в 75% монослоя, культуру замораживают и оттаивают 3 раза, а вирус- содержащую жидкость титруют на пробирках для установления титра вируса. Титр вируса по результатам 3-х опытов составляет 4,8 ± 0,5 Ig ТЦДбо/мл.

Пример 4. Подготовку культуры ТЭБ и культивирование вируса проводят по примеру 1. Вирус диареи (штамм Орегон С-24) вносят в объеме 10 мл. Через 10-12 дней, когда появляются дегенеративные изменения в 75-90% монослоя, культуру 3 раза замораживают и оттаивают, а вируссодер- жащую жидкость титруют для установления титра вируса. Титр вируса диареи по результатам 3-х опытов составляет 2,5 ± 0,5 Ig ТЦДбО/мл.

Использование для накопления вируса крупного рогатого скота, перевиваемой линии клеток тестикул эмбриона быка (ТЭБ) по сравнению с ранее используемыми первично-трипсинизированными культурами ТБ и ПЭК, позволяет заменить дорогостоящие первично-тримеинизированные культуры ТБ на более экономичную линию, которая характеризуется способностью легко перевиваться в условиях in vitro и размножаться с использованием доступных питательных сред и сывороток и может длительное время храниться без изменения биологических свойств в жидком азоте. В целом же перевиваемая линия клеток ТЭБ обеспечивает более высокое, чем культура ТБ, накопление вирусов пневмоэнтеритов крупного рогатого скота. Перевиваемая линия ТЭБ характеризуется стабильными морфологическими и

генетическими свойствами и простотой получения и культивирования.

Формула изобретения Штамм культивируемых клеток тестикул эмбриона быка ВСКК(СХЖ) № 40, используемый для накопления вирусов крупного рогатого скота.

Изобретение относится к области вирусологии, в частности к биотехнологии культуры клеток, и касается получения и применения в качестве клеточного субстрата для накопления вирусов заболеваний крупного рогатого скота. Целью изобретения является получение перевиваемой линии клеток в качестве клеточного субстрата для репродукции и выращивания вирусов крупного рогатого скота. Штамм получен из тестикул эмбриона, полученного от здоровой коровы путем переведения в культуру клеток. Регламент культивирования не отличается от общепринятого для культур клеток. Штамм депонирован в коллекции ВСКК /СХЖ/ N 40. Перевиваемую линию ТЭБ культивируют при физиологических условиях и при достижении конфлюентного монослоя проводят замену на среду с вирусом и инкубируют с целью адсорбции вируса с последующим сбором вируссодержащей жидкости и определением титра вируса. Штамм пригоден для накопления вируса диарен /штамм Орегон С-24/, вируса парагриппа - 3 и аденовируса /штамм В - 10/.