ВАКЦИНА КУЛЬТУРАЛЬНАЯ ИНАКТИВИРОВАННАЯ ПРОТИВ ХЛАМИДИОЗА (ОРНИТОЗА) ПТИЦ Российский патент 2006 года по МПК A61K39/118 A61P31/04 

Изобретение касается специфической профилактики и терапии хламидиоза (орнитоза) птиц. Вакцина содержит в качестве антигена цитопатогенный штамм Chlamydia psittaci var. avis "ДЖ-87" ВГНКИ №23-ДЭП, выращенный на монослое первичной культуры клеток фибробластов эмбрионов кур (ФЭК) с титром не ниже 10^-7,5 ТЦД_50/мл. Вакцина также содержит инактиватор - фенол и впервые используемый в качестве адъюванта - поливинилпирролидон. Вакцина специфична, высокоиммуногенна и имеет низкую реактивность. 6 табл. Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и вирусологии, в частности к производству вакцин, применяемых для специфической профилактики и терапии сельскохозяйственных животных, например птиц, от заболевания хламидиозом.

Известна вакцина против энзоотического аборта овец инактивированная, изготовленная из зараженных хламидиями куриных эмбрионов (Franc et al. Am. j. Vet. Pec., Vol.29, p.1441, 1968). Недостатками данной вакцины являются ее высокая стоимость, ее изготовление требует больших затрат времени, высокое содержание балластных белков, снижающее ее иммуногенность и повышающее реактогенность. Эта вакцина не содержит специфического антигена и поэтому неиммуногенна для птиц. Данная вакцина выбрана нами в качестве прототипа. Наиболее близким по технической сущности является патент США №4386065 А 61 К 39/118, 1983. "Вакцина против энзоотического аборта овец", которая включает в себя смесь водной суспензии, инактивированных формалином хламидийных элементарных телец, полученных из организмов Chlamydia SP в пределах от 2·10⁶ до 10⁹ ELD_50/мл размноженных в клеточной культуре, и равного количества масляного адъюванта, представляющего собой смесь светлого минерального масла и ланолина.

Недостатком этой вакцины является то, что штамм хламидий как продуцент не обладает цитопатическим действием. Вследствие этого для контроля накопления хламидий необходимо ежедневно готовить мазки, производить их окраску и подсчет зараженных клеток, а при сборе сырья требуется инфицированный монослой отделить от ростовой поверхности с помощью трипсина с верстном. Для создания нужной концентрации хламидий в вакцине культуральную суспензию подвергают центрифугированию. К тому же один стационарный монослой используется как посевной материал только для пяти чистых монослоев или их эквивалентов. Все эти операции усложняют технологический процесс производства и снижают производительность при изготовлении вакцины, что делает ее дороже. К тому же вакцина профилактирует только энзоотические аборты хламидиозной природы у овец и не профилактирует хламидиоз птиц.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Задачей данного изобретения является создание специфичной, высокоиммуногенной вакцины для профилактики хламидиоза (орнитоза) птиц, имеющей низкую реактогенность и получаемой более простым (в сравнении с прототипом) технологическим способом.

Поставленная задача достигнута благодаря тому, что вакцина культуральная, инактивированная против хламидиоза (орнитоза) птиц, в качестве антигена содержит цитопатогенный штамм Chlamydia psittaci "ДЖ-87" ВГНКИ №23-ДЭП, выращенный на монослое первичной культуры клеток фибробластов эмбрионов кур с титром не ниже 10^-7.5 ТЦД_50/мл, впервые используемый в качестве адъюванта - поливинилпирролидон, фенол при следующих процентных соотношениях:

1. Суспензия клеток ФЭК (фибробластов эмбрионов кур), инфицированных хламидиями штамма Chlamydia psittaci "ДЖ-87" ВГНКИ №23-ДЭП с титром не ниже 10^-7,5 ТЦД_50/мл - 99,1-99,3.

2. Фенол - 0,3-0,5.

3. Поливинилпирролидон - 0,4-0,6.

Существенным отличием данной вакцины от ее прототипа является то, что в качестве антигена цитопатогенный штамм Chlamydia psittaci var. Avis "ДЖ-87" ВГНКИ №23-ДЭП, депонированный в коллекцию ВГНКИ ветпрепаратов. Выращивание его ведется на монослое первичной культуры ФЭК. Штамм Chlamydia psittaci "ДЖ-87" ВГНКИ №23-ДЭП выделен в 1987 году из печени и селезенки больного орнитозом индюшонка птицефабрики "Мрзытайская" Джамбулской области. Выделение проводили на развивающихся 6-7-дневных куриных эмбрионах путем их заражения в полость желточного мешка. Затем штамм был адаптирован к первичной культуре клеток ФЭК. Штамм прошел 124 пассажа к культуре ФЭК в условиях роллера, в результате чего приобрел способность оказывать высокое цитопатогенное действие на монослой культуры клеток ФЭК. Наряду с этим устойчиво повысилась его иммуногенная активность и снизилась реактогенность.

Штамм Chlamydia psittaci "ДЖ-87" ВГНКИ №23-ДЭП входит в коллекцию ВГНКИ стандартизации и сертификации ветпрепаратов и хранится в музее живых культур СКЗНИВИ.

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ. Элементарные зрелые частицы округлой формы, диаметром 180-200 нм, инициальные промежуточные формы - до 500-600 нм окрашиваются по методу Стемпа в розово-красный цвет по Романовскому-Гимза в темно-голубой цвет.

КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА.

Хламидии культивируется в желточных оболочках 7-8-дневных куриных эмбрионов. Штамм Chlamydia psittaci var. Avis "ДЖ-87" ВГНКИ №23-ДЭП адаптирован к культуре ФЭК, вызывает образование цитоплазматических включений через 48 часов культивирования, проявляет цитопатическое действие.

АДАПТОГЕННЫЕ СВОЙСТВА. Штамм Chlamydia psittaci var. Avis "ДЖ-87" ВГНКИ №23-ДЭП возбудитель хламидиоза (орнитоза) птиц адаптирован к 6-7-дневным куриным эмбрионам, и культуре ФЭК, при этом сохраняет патогенность и иммуногенность. Титр хламидий, выращенных на куриных эмбрионах, составляет 10^6,5-10^7,5 ЭЛД_{50/03 мл}, титр хламидий, выращенных на культуре клеток ФЭК, 10^-7,0-10^-8,0 ТЦД_50/мл.

ПАТОГЕННЫЕ СВОЙСТВА. Штамм патогенен для индюшат, морских свинок и белых мышей - вызывает у них заболевание и гибель. В мазках-отпечатках из органов (печень, селезенка, мозг) павших и больных животных обнаруживают цитоплазматические включения и элементарные частицы хламидий при парентеральном (для птиц), интраназальном, внутрибрюшинном, интроцеребральном (для мышей) и внутрибрюшинном для морских свинок заражении.

АНТИГЕННЫЕ СВОЙСТВА. В постановке перекрестной реакции связывания комплемента (РСК) с гомологичными антигенами установлено высокое антигенное родство к гомологичному антигену в титре 1:80-1:160. Антигенное родство к другим антигенам хламидий стоит на четыре разведения дальше.

ТАКСОНОМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА. Согласно решению Юридической комиссии Международной Ассоциации Микробиологических обществ (МАМО), с 1 января 1980 года определение рассматриваемых микроорганизмов, как Chlamydia, стало обязательным. В соответствии с "The Shorter Bergey's manual of determinative" (1980), хламидии отнесены к царству Procaryotae, отделу 2 прокариотов, индифферентных к свету, т.е. "скотобактериям", классу 2 Ricketsia. В класс Ricketsia включены порядки 1 Ricketsialesu 2 Chamydiales. Семейство Chlamydiaceae, роду Chlamydia, в котором описано 4 вида: Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis, Chlamydia pecorum, Chlamydia Pneumoniae. Все виды хламидий гетерогенны.

ИММУНОГЕННЫЕ СВОЙСТВА. В опыт было взято 48 индюшат 3-недельного возраста весом 250-300 г. 24 Индюшонка было завакцинировано культуральной инактивированной вакциной, изготовленной из штамма Chlamydia psittaci (var. avis) "ДЖ-87" ВГНКИ №23 - ДЭП, подкожно в дозе 0,5 мл. Оставшиеся 24 индюшонка составили контрольную (невакцинированную) группу.

Через 14 дней после введения вакцины, приготовленной из подтитрованного контрольного штамма Chlamydia psittaci (var. avis) "ДЖ-87" ВГНКИ №23 - ДЭП с титром 10^-7,5 ТЦД_50/мл, заразили 12 опытных и 12 контрольных индюшат подкожно в дозе 1 мл. Затем через 20 дней после введения вакцины, также заразили 12 вакцинированных и 12 невакцинированных индюшат. Результаты представлены в табл. 1.

Таблица 1
Иммуногенные свойства штамма Chlamydia psittaci "ДЖ-87" ВГНКИ №23-ДЭПШтаммНаименование группыРеактогенностьРезультат ЗараженияИммунитет   14 дней20 дней14 дней20 дней"ДЖ-87"ВакцинированнаяОтсутствует3/90/12ЧастичныйПолныйВГНКИ №23-ДЭПКонтрольнаяОтсутствует12/012/0ОтсутствуетОтсутствует

Примечание. В графах 4,5 числитель обозначает число павших индюшат, знаменатель - число выживших.

Таким образом, как видно из описания и таблицы, штамм Chlamydia psittaci (var. avis) "ДЖ-87" ВГНКИ №23 - ДЭП специфичен по отношению к птицам и обладает высокими иммуногенными свойствами, что позволяет осуществить поставленную задачу.

Вторым существенным отличием является то, что в качестве адъюванта в вакцину вводят поливинилпирролидон (ПВП). Поливинилпиролидон - белый порошок, хорошо растворимый в воде, применяется как пролонгатор лекарственных средств. Ему присуще дезинтоксическое и противовоспалительное действие. В нашем препарате ПВП существенно повышает иммуногенность вакцины за счет того, что связывает (адсорбирует) антигенные белки.

Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что заявляемый состав вакцины отличается от известного введением новых компонентов, а именно нового штамма Chlamydia psittaci (var. avis) "ДЖ-87" ВГНКИ №23-ДЭП с титром не менее 10^-7,5 ТЦД_50/мл и поливинилпирролидона в качестве адъюванта, а также соотношением компонентов. Таким образом, заявляемое техническое решение является новым. Введение в качестве адъюванта поливинилпирролидона существенно повышает иммуногенность вакцины. По сравнению с вакциной, содержащей в качестве адъюванта вазелиновое масло, гидроксил или полимер №1. Для доказательства был проведен следующий опыт. Сформировали четыре группы по восемь голубей. Каждой группе вводили вакцину культуральную инактивированную, изготовленную из штамма Chlamydia psittaci (var. avis) "ДЖ-87" ВГНКИ №23 ДЭП, содержащую в качестве адъюванта в 1-й группе - вазелиновое масло, 2-й группе - поливинилпирролидон, 3-й группе - гидроксил, 4-й группе - полимер №1. Вакцина вводилась подкожно, трехкратно с интервалом 7 дней в дозе 0,2 мл. Иммуногенность вакцины оценивалась по результатам РСК (с сывороткой крови опытных голубей, взятой через 20 дней после последнего введения вакцины). Как следует из результатов опыта, поливинилпирролидон в качестве адъюванта наиболее эффективно повышает протективные свойства вакцины против хламидиоза.

Таким образом, данный состав компонентов придает вакцине новые свойства, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию "изобретательский уровень".

Пример 1. (Оптимальный вариант).

Приготовление культуры клеток ФЭК и заражение ее хламидиями производили по общепринятой методике (Л.П.Дьяконов и др., Культивирование клеток и тканей животных. Часть 1, Ставрополь, 1986 г.). Затем суспензию клеток ФЭК, инфицированных хламидиями штамма Chlamydia psittaci (var. avis) "ДЖ-87" ВГНКИ №23 - ДЭП, подвергали контрольным высевам на бактериальную и грибковую контаминацию. После этого чистую, неконтаминированную суспензию брали для определения титра ТЦД_50/мл. Титр определяли по общепринятой методике и подсчитывали по методу Рида и Менча. В данном примере он равен 10^-7,5 ТЦД_50/мл.

Затем смешивали компоненты в следующих соотношениях суспензии клеток ФЭК, инфицированных хламидиями - 99,2 мас.%, фенол - 0,4 мас.%, поливинилпирролидона - 0,5 мас.%. Полученную смесь выдерживали в течение 96 ч при температуре +10°С.

Далее проводили выборочный контроль на иммуногенность. Для этого брали восемь голубей и вводили им вакцину по следующей схеме:

1-е введение - подкожно 0,2 мл;

2-е введение - подкожно через 7 суток 0,2 мл;

3-е введение - подкожно через 14 суток 0,2 мл.

Контролем служили четыре голубя, которым вакцина не вводилась. Через три недели после последнего введения вакцины определяли уровень накопления антител в сыворотке крови голубей в реакции связывания комплемента (РСК). Результат: четыре креста в разведении 1:5, четыре - в разведении 1:10, два - в разведении 1:20.

Аналогично делали для титра 7,5; 7,75; 7,0; 6,5; 6,0; 5,5 ТЦД_50/мл. Таким образом, опыт показал, что титр хламидийного штамма 7,5 является оптимальным и обеспечивает высокое накопление антител в сыворотке крови голубей. В данном опыте отчетливо видна зависимость титра антител в сыворотке крови голубей от титра штамма Chlamydia psittaci (var. avis) "ДЖ-87" ВГНКИ №23-ДЭП.Этот тест взят нами в качестве контроля иммуногенности вакцины при ее изготовлении.

Пример 2. Приготовление культуры клеток ФЭК, заражение ее хламидиями, выращивание и накопление их производили по общепринятой методике. Затем суспензию клеток ФЭК, инфицированных хламидиями штамма Chlamydia psittaci (var. avis) "ДЖ-87" ВГНКИ №23-ДЭП, подвергали контрольным высевам для проверки на бактериальную и грибковую контаминацию, титр ТЦД_50/мл в данном примере равен 10^-7,5 ТЦД_50/мл.

Чистую, неконтаминированную бактериальной и грибковой флорой клеточную хламидийную суспензию объединяли в общую стерильную емкость и проводили инактивацию хламидий фенолом. Для этого в емкости смешивали компоненты в следующем соотношении: суспензии клеток ФЭК, инфицированных хламидиями, брали 99,1 мас.%, а инактиватора (фенола) добавляли 0,3 мас.%. Полученную смесь выдерживали в течение 98 ч при температуре +10°С. Затем добавляли 0,6 мас.% адъюванта (поливинилпирролидона). После этого проводили выборочный контроль на полноту инактивации. Для этого 10 развивающимся куриным эмбрионам 7-суточной инкубации стерильно вводили в полость желточного мешка 0,3 мл вакцины и инкубировали их при 37,0-37,5° в течение 12 суток. В качестве контроля использовали 10 эмбрионов, которым вводили неинактивированную клеточную взвесь, содержащую хламидий штамма "ДЖ-87" ВГНКИ №23-ДЭП. Условия инкубации такие же. Опытные эмбрионы оставались живыми в течение 12 суток. В мазках-отпечатках, изготовленных из оболочек желточного мешка, окрашенных по методу Романовского-Гимза, хламидий не обнаруживались. Контрольные эмбрионы пали на 5-7 сутки. Этот результат соответствует установленному контролю вакцины на полноту инактивации.

Аналогично делали для следующих количеств фенола: 0,2 мас.%; 0,3 мас.%; 0,5 мас.%; 0,6 мас.%. Опытным путем установлено, что количество инактиватора в интервале от 0,3 мас.% до 0,5 мас.% обеспечивает полноту инактивации хламидий в суспензии. Выше 0,5 мас.% фенол не добавляют с целью его экономии, т.к. качества вакцины это не улучшает. Концентрацию инактиватора ниже 0,3 мас.% не допускают, т.к. это не обеспечивает полной инактивации хламидий.

Пример 3. Приготовление культуры ФЭК, заражение ее хламидиями, их выращивание и накопление производили по общепринятой методике. Затем суспензию клеток ФЭК, инфицированных хламидиями штамма Chlamydia psittaci (var. avis) "ДЖ-87" ВГНКИ №23-ДЭП, подвергали контрольным высевам для проверки на бактериальную и грибковую контаминацию. Если тест оказывался отрицательным, то выборочно определяли титр ТЦД_50/мл, который в этом примере равен 7,5 ТЦД_50/мл. Затем смешивали компоненты в следующих соотношениях: суспензия клеток, инфицированных хламидиями, брали 99,3 мас,%, фенола - 0,3 мас.% (смесь выдерживали 10° часов при -6°С). Поливинилпирролидона вводили 0,4 мас.%. Процесс вели следующим образом: навеску адъюванта и инактивированную суспензию клеток, содержащую антиген штамма хламидий "ДЖ-87" ВГКНКИ №23-ДЭП, и составляли при комнатной температуре до его полного растворения - 24 ч. Затем проводили контроль на иммуногенность. Результат следующий: в разведении 1:5 - ++++; в разведении 1:10 - ++++; в разведении 1:20 - ++.

Пример 4. Приготовление культуры клеток ФЭК, заражение ее хламидиями, их выращивание и накопление производили по общепринятой методике. Затем суспензию клеток ФЭК, инфицированных хламидиями штамма Chlamydia psittaci (var. avis) "ДЖ-87" ВГНКИ №23-ДЭП, подвергали контрольным высевам для проверки на бактериальную и грибковую контаминацию. При отрицательном результате теста определяли средний титр ТЦД_50/мл, который в этом примере равен 7,5 ТЦД_50/мл. Затем смешивали компоненты в следующих соотношениях: суспензии клеток ФЭК, инфицированных хламидиями, брали 99,3 мас.%; фенола - 0,4 мас.%, поливинилпирролидона - 0,3 мас.%. Затем проводили контроль на иммуногенность как в примере 1. Результаты РСК следующие: в разведении 1:5 - ++++; в разведении 1:10 - ++++; в разведении 1:20 - ++.

Таким образом, вакцина, содержащая суспензию клеток ФЭК, инфицированных хламидиями штамма "ДЖ-87" ВГНКИ №23-ДЭП в пределах от 99,1 до - 99,3 мас.%, фенол в количестве 0,3-0,5 мас.%, поливинилпирролидон в количестве 0,4-0,6 мас.%, обеспечивает иммуногенность вакцины в соответствии с ее контролем и вызывает развитие надежного иммунитета у птицы.

ТЕХНИЧЕСКИЙ РЕЗУЛЬТАТ

Вакцина профилактирует возникновение у птиц на почве хламидиоза: пневмонии, артриты, аэросаккулиты. Повышает процент выводимости птенцов на 10-12%, увеличивает сохранность молодняка на 18-24%. Увеличивается яйценоскость, возрастают привесы. Кроме того, вакцина сокращает загрязнение окружающей среды хламидий, являющихся антропозоонозами, а также снижают затраты неблагополучного хозяйства на проведение малоэффективных лечебно-профилактических мероприятий с применением антибиотиков и других лечебных средств. Вакцина безвредна. В целом эффективность вакцины составляет 90-93%.

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии. Вакцина содержит в качестве антигена штамм Chlamydia psittaci (var. avis) "ДЖ-87" ВГНКИ №23-ДЭП, выращенный на монослое первичной культуры клеток (ФЭК) - фибробластов эмбрионов кур с титром не ниже 10^-7,5 ТЦД_50/мл; в качестве инактиватора - фенол, и в качестве адъюванта - поливинилпирролидон при соотношении их в мас.%: (Chlamydia psittaci (var. avis) "ДЖ-87" ВГНКИ №23-ДЭП, с титром не ниже 10^-7,5 ТЦД_50/мл - 99,1-99,3, фенол - 0,3-0,5, поливинилпирролидон - 0,4-0,6. Вакцина обладает высокой специфичностью и иммуногенностью, безвредна. 1 табл.

Вакцина культуральная инактивированная против хламидиоза (орнитоза) птиц, включающая суспензию, содержащая антиген хламидий, адъювант и инактиватор, отличающаяся тем, что в качестве антигена она содержит штамм Chlamydia psittaci (var. avis) "ДЖ-87" ВГНКИ № 23-ДЭП, выращенный на монослое первичной культуры клеток фибробластов эмбрионов кур с титром не ниже 10^-7'⁵ ТЦД5о/мл, качестве адъюванта - поливинилпирролидон, а в качестве инактиватора фенол при следующем соотношении их, мас.%:

Chlamydia psittaci (var. avis) "ДЖ-87" ВГНКИ №23-ДЭП с титром не ниже 10^-7,5 ТЦД_50/мл99,1-99,3Фенол 0,3-0,5Поливинилпирролидон 0,4-0,6