Способ выбора донора при аллотрансплантации почки Советский патент 1992 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, в частности к трансплантационной иммуноло-, гии, и касается прогнозирования криза отторжения для снижения частоты отторжения трансплантата вследствие пре- сенсибилизации реципиента к дойорским HLA-антигенам.

Целью изобретения является повышение точности выбора донора.

Способ осуществляют следующим образом.

Выделение клеток из селезенки. Селезенку донора измельчают ножницами, кусочки селезенки опускают в гомогенизатор со средой 199 и осторожно выдавливают клетки пестиком. Далее клетки помещают во флакон со средой 199. суспензия отстаивается несколько минут для осаждения крупных конгломератов, оставшуюся суспензию наносят на градиент фиколл - верог рафина и центрифугируют 35 мин при 400д. Клетки облачка, собранные из интерфазы,

отмывают один раз средой 199 и разводят до концентрации 4х106 клеток в 1 мл. К 0,2 мл суспензии лимфоцитов (конечная концентрация 2,6x106 клеток/мл) приливают 2- 2,5 мкг конканавалина А в 0,1 мл среды 199 (конечная концентрация 6,6-8,3 мкг/мл), инкубируют 50-60 мин при 37РС. Обработанные конканавалином А клетки закапывают в лунки с сывороткой реципиента для постановки микролимфоцитоксичёского теста.

Поставнока реакции. По 1 мкл сыворотки реципиента закалывают в лунку планшета Терасаки под вазелиновое масло. 1 мкл суспензии лимфоцитов (концентрация клеток 2-3 х106/мл) закапывают в лунки, инкубируют 30-40 мин при комнатной температуре, в лунки добавляют 5 мкл свежеразмороженного комплемента кролика и инкубируют один час, закапывают в лунки по 3 мкл 5%-ного водного раствора эозина, через 2 мин останавливают реакцию 5 мкл 40%-ного нейтрального формалина. Чтение

ы

к

СП

N3

реакции осуществляют при помощи инвертированного микроскопа. Реакцию оценивают как положительную, если количество мертвых клеток в опыте было на 10% выше, чем в контроле.

Пример 1. Реципиент Д., донор Т. Аллотрансплантация почки 4.02.88. Выбор донора по известному способу - рекомендована аллотрансплантация.

Определение по предлагаемому способу.

Выделение клеток из селезенки. Селезенку донора измельчают ножницами, кусочки селезёнки опускают в гомогенизатор со средой 199 и осторожно выдавливают клетки пестиком. Далее клетки помещают во флакон со средой 199, суспензия отстаивается несколько минут для осаждения -крупных конгломератов, оставшуюся сус- пензию клеток наносят на градиент фиколл .- верографина и центрифугируют 35 мин при 400д. Клетки облачка, собранные из интерфазы, отмывают один раз средой 199 и разводят до концентрации 4 х10 клеток на 1 мл. К 0,2 мл суспензии лимфоцитов (конечная концентрация 2,6х106 клеток/мл) приливают 2,5 мкг конканавалина А в 0,1 мл (конечная концентрация 8,3 мкг/мл), инкубируют 60 мин при 37°С. Обработанные конканавалином А клетки закапывают в лунки с сывороткой реципиента для постановки перекрестной пробы.

Постановка реакции. По 1 мкл сыворотки реципиента закапывают в лунку планшета Терасаки под вазелиновое масло. Суспензию лимфоцитов раскапывают по 1 мкл в лунку, инкубируют 30-40 мин при комнатной температуре. В лунку добавляют 5 мкл свежеразмороженного комплемента кролика и инкубируют один час, закапывают в лунки 3 мкл 5%-ного водного раствора эозина, через 2 мин закапывают 5 мкл 40%- ного нейтрального формалина для остановки реакции. Чтение реакции осуществляют при помощи инвертированного- микроскопа: проба оказалась положительной, так как количество мертвых клеток в лунках с сывороткой реципиента составило 50%, а в лунках без сыворотки (контроль) 5%.

Заключение. Проба положительная - операция не рекомендована. Однако, поскольку способ на стадии проверки, аллот- ранеплантация проведена 4.02,88 по показаниям известного способа. Биопсия трансплантата на четвертый день показала криз отторжения и 1.03.88 аллотрансплан- тат удалили.

Пример 2. Реципиент Я., донор К. Аллотрансплантация 1.09.87. Выбор донора

по известному способу - рекомендована аллотрансплантация.

Определение по предлагаемому способу,

Выделение клеток из селезенки. Селезенку донора измельчают ножницами, кусочки селезенки опускают в гомогенизатор со средой 199 и осторожно выдавливают клетки пестиком. Далее клетки помещают

0 во флакон со средой 199, суспензия остаи- вается несколько минут для осаждения крупных конгломератов, оставшуюся суспензию наносят на градиент фиколл - верографина и центрифугируют 35 мин при 400д.

5 Клетки облачка, собранные из интерфазы, отмывают один раз средой 199 и разводят до концентрации 4x106 клеток в 1 мл. К 0,2 мл суспензии лимфоцитов (конечная концентрация 2,6x106 клеток/мл) приливают

0 2,5 мкг конканавалина А в 0,1 мл среды 199 (конечная концентрация 8,3 мкг/мл), инкубируют 60 мин при 37°С. Обработанные конканавалином А клетки закапывают в лунки с сывороткой реципиента для постановки

5 перекрестной пробы.

Постановка реакции. По 1 мкл сыворотки реципиента закапывают в лунку планшета Терасаки под вазелиновое масло. 1 мкл суспензии лимфоцитов закапывают в лунки,

0 инкубируют 30-40 мин при комнатной температуре. В лунки добавляют 5 мкл свежеразмороженного комплемента кролика и

инкубируют один час, закапывают в лунки по 3 мкл 5%-ного водного раствора эозина.

5 через 2 мин останавливают реакцию 5 мкл 40%-ного нейтрального формалина. Чтение реакции осуществляют при помощи инвертированного микроскопа: сыворотка реципиента не проявляет цитотоксического

0 эффекта (все клетки живые).

Заключение. Проба отрицательная - пересадка рекомендована. Через полтора года почка функционирует.

Пример 3. Реципиент 3., донор К.

5 Аллотрансплантация почки 18,04.87. Выбор донора по известному способу - рекомендована аллотрансплантация.

Определение по предлагаемому способу.

0 Выделение клеток из селезенки, Селезенку донора измельчают ножницами, кусочки селезенки опускают в гомогенизатор ; со средой 199 и осторожно выдавливают клетки пестиком. Далее клетки помещают

5 во флакон со средой 199, суспензия отстаивается несколько минут для осаждения крупных конгломератов, оставшуюся суспензию клеток наносят на градиент фиколл - верографина и центрифугируют 35 мин при 400д. Клетки облачка, собранные из

интерфазы, отмывают один раз средой 199 и разводят до концентрации 4 хЮ6 клеток в мл. К 0,2 мл суспензии лимфоцитов (конечная концентрация 2,6 х10с клеток/мл) приливают 2,0 мкг конканавалина А в 0,1 мл (конечная концентрация 8,6 мкг/мл), инкубируют 50 мин при 37°С, Обработанные конканавалином А клетки закапывают в лунки с сывороткой реципиента для постановки перекрестной пробы.

Поставнока реакции. По 1 мкл сыворотки реципиента закапывают в лунку планшета Терасаки под вазелиновое масло. Суспензию лимфоцитов раскапывают по 1 мкл в лунку, инкубируют 30-40 мин при ком- натной температуре. В лунку добавляют 5 мкл свежеразмороженного комплемента кролика и инкубируют один час, закапывают в лунки 3 мкл 5%-ного водного раствора эозина, через 2 мин закапывают 5 мкл 40%- ного нейтрального формалина для останова ки реакции. Чтение реакции осуществляют при помощи инвертированного микроскоп па: проба оказалась положительной, так как количество мертвых клеток в лунках с сыво- роткой реципиента составляло 35%, а в лунках без сыворотки (контроль)5%.

Заключение. Проба положительная операция не рекомендована. Однако, поскольку способ на стадии проверки, аллот- рансплантация проведена 18.04.87 по показаниям известного способа. Аллотран- сплантат удален через 10 мес из-за некупирующейся реакции отторжения.

Для осуществления способа выбора до- нора сыворотки 56 реципиентов исследова- ли на наличие антител к донорским лимфоцитам, обработанным конканавалином А. Сыворотки 32 человек были отрицательными, у 24 в сыворотках определялйть антитела к донорским лимфоцитам, обработанным конканавалином А. Реципиенты, не имеющие антител к донорским лимфоцитам, обработанным конканавалином А имели статистически достоверно лучшие результаты аллотрансплантации почки по

сравнению с серопозитивными реципиентами (количество удаленных трансплантатов составляло 40,6 и 70,8% соответственно). Таким образом, больные, имеющие антидонорские антитела составляют группу риска (51,8%), которую позволяет выявить предлагаемый метод. Сравнивая результаты аллотрансплантации у больных, имеющих антитела к донорским клеткам, обработанным конканавалином А, с результатами пересадки, проведенной согласно результатам реакции известного способа (у всех 56 исследованных больных реакция - была отрицательная), отмечено улучшение результатов аллотрансплантации на 17% (статистически не достоверное). При сравнении данных по результатам выживаемости пересаженной почки в зависимости от результатов микролимфоцито- токсического теста по предлагаемому способу и данных по группе больных с положительными реакциями, которые по известному способу б-ыли оценены как отрицательные, т.е. рекомендовалась аллот- рансплантация почки, которая и была осуществлена, установлено, что. в 71% случаев произошло отторжение пересаженной почки, что является доказательством специфичности предлагаемого способа так как в этой группе реципиентов не была рекомендована пересадка, поскольку реакция была оценена как положительная.

. Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я

Способ выбора донора при аллотрансплантации почки, включающий постановку микролимфототоксического теста при смешивании лимфоцитов донора и сыворотки крови реципиента с последующим учетом результатов реакции, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью повышения точности способа, лимфоциты донора в конечной концентрации 2,6 106 клеток/мл предварительно инкубируют в присутствии конканавалина А в конечной концентрации 6,6-8.6 мкг/мл в течение 50-60 мин при 37°С.

Изобретение относится к медицине, преимущественно к трансплантационной иммунологии, и может быть использовано при выборе донора при аллотрансплантации почки. Целью изобретения является повышение точности выбора донора. Цель достигается за счет того, что смешивают сыворотку крови реципиента с лимфоцитами донора в концентрации 2,6 106/мл, которые предварительно инкубируются с конканавалином А в дозе 6,6-8,3 мкг/мл на 410 лимфоцитов при температуре 37°С в течение 50-60 мин, инкубируют, добавляют комплект сыворотки кролика, инкубируют и определяют количество мертвых клеток окрашиванием их водным раствором эозина. Способ позволяет повысить точность прогнозирования криза отторжения на 30% и, следовательно, повысить точность выбора донора.