СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ ПРОЛИФЕРАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ ЛИМФОЦИТОВ Российский патент 2001 года по МПК C12N5/06 

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и может быть использовано в клинической практике как метод стимулирующего воздействия на биологические процессы, протекающие в клетках и тканях.

Способность лимфоцитов участвовать в осуществлении иммунных реакций в организме определяется уровнем их пролиферативной активности.

Известен способ стимуляции пролиферативной активности лимфоцитов мышей in vitro переменным магнитным полем с частотой 100 Гц и плотностью 50 мТл, действующим в течение 60 минут на клетки селезенки (Н.Е. Щебникова, Е.Н. Антипова, А. С. Соловьев - Тезисы доклада. Материалы сборника "Проблемы укрепления здоровья, профилактики и лечения заболеваний", Смоленск, 1995, с. 220).

В последние годы в клинической практике начали широко использовать плазменные потоки. В качестве плазмообразующего газа используется гелий или аргон. Поток низкотемпературной плазмы используется при лечении трофических язв, рожистого воспаления, поверхностных гнойных и ожоговых ран. Положительный эффект плазмы связывают с усилением восстановительных процессов в ранах. Важную роль в восстановительных процессах играют иммунокомпетентные клетки (Бабаева А.Г. Кроветворные и лимфоидные органы. // Структурные основы адаптации и компенсации нарушенных функций. / Под редакцией Саркисова Д.С. - М.: Медицина, 1987, с. 328-342).

Сущность способа стимуляции пролиферативной активности лимфоцитов заключается в том, что клетки селезенки помещают в среду RFMI-1640, дополнительно содержащую 5% инактивированную человеческую сыворотку 4 группы, 2мМ 1-глютамина, 10 мМ буфера Hepes, 5•10^-5 М 2-меркаптоэтанола, 50 мкг/мл гентамицина, и подвергают воздействию аргоновой плазмы, полученной при силе тока 30 А, напряжении 20 В и расходе газа 1 л/мин. Воздействие осуществляют в течение 30 секунд с расстояния 20 см от сопла плазмотрона.

Такие оптимальные параметры были нами установлены в предварительных опытах. Другие параметры расхода газа, силы тока и напряжения, а также расстояния от сопла плазмотрона до объекта либо не изменяло пролиферативной активности лимфоцитов, либо оказывало супрессирующее действие. Добавки к среде RPMI-1640 обеспечивали жизнеспособность лимфоцитов. Соотношение компонентов являлось оптимальным.

Способ осуществляется следующим образом.

В качестве источника лимфоцитов используют клетки селезенки мышей-гибридов (СВА • C57B1/6)F1, полученных из питомника АМН "Столбовая". Забор лимфоидных органов производят с соблюдением правил асептики и антисептики. Мышей забивают путем цервикальной дислокации. Доноров лимфоидных клеток после забоя обрабатывают 2% раствором хлорамина, а затем 96^o этиловым спиртом. Стерильно извлекают селезенку, очищают от жировой и соединительной ткани, помещают в охлажденную среду 199 и тщательно раздавливают в стеклянном гомогенизаторе. Взвесь лимфоцитов фильтруют через мелкоячеистый капрон, центрифугируют в течение 7 мин при 1000 об/мин, сливают супернатант, осадок ресуспендируют в необходимом объеме среды RPMI-1640, дополненной 5% инактивированной человеческой сывороткой 4 группы, 2 мМ 1-глютамина, 10 мМ буфера Hepes, 5•10^-5 М 2-меркаптоэтанола, 50 мкг/мл гентамицина. Жизнеспособность лимфоцитов определяют в камере Горяева в смеси 0,1% растворов трипанового синего и эозина.

Под световым микроскопом МБИ-3 подсчитывают число живых лимфоцитов. Мертвых клеток должно быть не более 8-10%.

В опытах используют плазменную установку СУПР-М и физиотерапевтический плазмотрон. 20•10⁶ исследуемых клеток селезенки вносят в пластиковые флаконы в объеме 1 мл среды RPMI-1640, дополнительно содержащей 5% инактивированной человеческой сыворотки 4 группы, 2 мМ 1-глютамина, 10 мМ буфера Hepes, 5•10^-5 М 2-меркаптоэтанола, 50 мкг/мл гентамицина. Облучение лимфоцитов проводят аргоновой плазмой при силе тока 30 A, напряжении 20 B с расстояния 20 см от сопла плазмотрона.

Расход аргона составляет 1 л/мин. Клетки селезенки подвергают воздействию плазменного потока в течение 30 секунд. Все манипуляции проводят на льду для исключения теплового эффекта.

Пролиферативную активность клеток селезенки в ответ на стимуляцию Т-клеточным митогеном конканавалином-A (Кон-A) и аллоантигенами изучают в реакции бласттрансформации и в смешанной культуре лимфоцитов.

Реакцию бласттрансформации выполняют в микромодификации (Хоробрых В.В. и др. , 1983). Разведение митогена Кон-A (Serva) готовят в среде RPMI-1640. Оптимальную концентрацию митогена определяют в предварительных опытах. Она составила 12,5 мкг/мл среды культивирования, 5•10⁵ исследуемых клеток селезенки вносят в лунки микропластин (Linbro) в объеме 100 мкл и добавляют к ним 100 мкл митогена или среды RPMI-1640. Микропластины инкубируют в термостате при 37^oC в течение 72 часов в атмосфере с содержанием 5% CO₂.

За 16 часов до окончания инкубации в лунки вносят 1 мк Ku ³H-тимидина в объеме 50 мкл среды RPMI-1640. Затем с помощью 12-канального устройства пробы переносят на фильтры (Сынпор-3, Чехия), последовательно промывают лунки физиологическим раствором, 5%-ной трихлоруксусной кислотой и 96^o спиртом.

Фильтры высушивают, помещают в сцинтилляционную жидкость ЖС-8 и регистрируют число импульсов в минуту на бета-спектрометре.

Постановку реакции смешанной культуры лимфоцитов осуществляют по методу Glick et аl. (1974) в модификации Брондз Б.Д. и др. (1977). Реагирующими клетками служат 5•10⁶ клеток селезенки/мл, подвергшиеся воздействию плазменного потока. В качестве стимулирующих используют облученные клетки селезенки мышей линии BAlB/c, которые в концентрации 10•10⁶ клеток/мл суспендируют в среде RPMI-1640, дополненной 5% инактивированной человеческой сывороткой 4 группы, 2 мМ 1-глютамина, 10 мМ буфера Hepes, 5•10^-5 М 2-меркаптоэтанола, 50 мкг/мл гентамицина. Клетки помещают во флаконы на лед и облучают на аппарате РУМ-17. Условия облучения: фильтр Cu - 0,5 мм, размер поля 6 х 6 см, фокусное расстояние - 15 см, очаговая доза на глубине 1,5 см - 1,5 Гр/мин, время облучения - 15 мин, суммарная доза - 22,5 Гр.

Отвечающие клетки в объеме 300 мкл смешивают со стимулирующими в объеме 500 мкл и добавляют 200 мкл среды RPMI-1640, дополненной 5% инактивированной человеческой сывороткой 4 группы, 2 мМ 1-глютамина, 10 мМ буфера Hepes, 5•10^-5 M 2-меркаптоэтанола, 50 мкг/мл гентамицина. Смеси клеток тщательно ресуспендируют и разливают в плоскодонные 96-луночные пластинки N 3040 (Falcon Hastics, США) в объеме 200 мкл. Микропластины помещают в термостат в атмосферу с содержанием 5% CO₂ на 5 суток. За 16 часов до окончания инкубирования в лунки добавляют 1 мк Ku ³H-тимидина в объеме 50 мкл среды RPMI-1640. Регистрацию клеточного ответа осуществляют по включению ³H-тимидина в ДНК пролиферирующих клеток.

Для статистической обработки полученных результатов применяли параметрический метод определения достоверности с вычислением t-критерия Стьюдента.

Пример 1.

В опыт были взяты 3 самца-гибрида (СВА х C 57 B 1/6) F1. Мыши забиты путем цервикальной дислокации, стерильно извлечены селезенки. Взвесь лимфоцитов профильтровали через мелкоячеистый капрон, центрифугировали при 1000 об/мин в течение 7 минут. Затем слили супернатант и осадок ресуспендировали в 2 мл среды RPMI-1640, дополненной 5% инактивированной человеческой сывороткой 4 группы, 2 мМ 1-глютамина, 10 мМ буфера Hepes, 5•10^-5 M 2-меркаптоэтанола, 50 мкг/мл гентамицина. Жизнеспособность лимфоцитов определяли в камере Горяева в смеси 0,1% растворов трипанового синего и эозина 20•10⁶ клеток селезенки вносили в пластиковые флаконы в объеме 1 мл среды RPMI-1640, дополненной 5% инактивированной человеческой сывороткой 4 группы, 2 мМ 1-глютамина, 10 мМ буфера Hepes, 5•10^-5 М 2- меркаптоэтанола, 50 мкг/мл гентамицина. Лимфоциты подвергали воздействию аргоновой плазмы, полученной при силе тока 30 A, напряжении 20 B и расходе газа 1 л/мин. Воздействие на лимфоциты осуществляли в течение 30 секунд с расстояния 20 см от сопла плазмотрона. Контролем явились клетки селезенки, не подвергавшиеся воздействию аргоновой плазмы. Все манипуляции проводили на льду для исключения теплового эффекта. 5•10⁵ исследуемых клеток селезенки внесли в лунки микропластин (Linbro) в объеме 100 мкл и добавили к ним 100 мкл митогена Кон-A или среды RPMI-1640. Регистрацию клеточного ответа осуществляли по включению ³H-тимидина в ДНК пролиферирующих клеток.

Эксперименты показали, что облучение клеток селезенки аргоновой плазмой в течение 30 секунд приводило к повышению пролиферативной активности лимфоцитов в ответ на стимуляцию митогеном Кон-A (таблица).

Пример 2.

В опыт были взяты 4 самца-гибрида (CBA x C 57 B 1/6) F1. Мыши были забиты путем цервикальной дислокации, стерильно извлечены селезенки. Взвесь лимфоидных клеток получили по общепринятой методике, 20•10⁶ клеток селезенки внесли в пластиковые флаконы в объеме 1 мл среды RPMI-1640, дополненной 5% инактивированной человеческой сывороткой 4 группы, 2 мМ 1-глютамина, 10 мМ буфера Hepes, 5•10^-5 М 2-меркаптоэтанола, 50 мкг/мл гентамицина. Лимфоциты подвергали воздействию аргоновой плазмы, полученной при силе тока 30 А, напряжении 20 В и расходе газа 1 л/мин. Воздействие на лимфоциты осуществляли в течение 30 секунд с расстояния 20 см от сопла плазмотрона. Контролем явились клетки селезенки, находившиеся в тех же условиях, но без воздействия плазмы. Все манипуляции проводили на льду для исключения теплового эффекта. Пролиферативную активность лимфоцитов оценивали в ответ на стимуляцию аллоантигенами в смешанной культуре лимфоцитов.

Реагирующими клетками служили 5•10⁶ клеток селезенки/мл, подвергшиеся воздействию плазменного потока. В качестве стимулирующих использовали облученные клетки селезенки мышей линии BAlB/c, которые в концентрации 10•10⁶ помещали в среду RPMI-1640, дополненную 5% инактивированной человеческой сывороткой 4 группы, 2 мМ 1-глютамина, 10 мМ буфере Hepes, 5•10^-5 М 2-меркаптоэтанола, 50 мкг/мл гентамицина, и облучали на аппарате РУМ-17. Отвечающие клетки в объеме 300 мкл смешивали со стимулирующими в объеме 300 мкл и добавляли 200 мкл среды RPMI-1640, дополненной 5% инактивированной человеческой сывороткой 4 группы, 2 мМ 1-глютамина, 10 мМ буфера Hepes, 5•10^-5 М 2-меркаптоэтанола, 50 мкг/мл гентамицина. Смеси клеток тщательно ресуспендировали и разливали в плоскодонные 96-луночные пластинки. Регистрацию клеточного ответа осуществляли по включению ³H-тимидина в ДНК пролиферирующих клеток.

Эксперименты показали, что облучение клеток селезенки в течение 30 секунд сопровождалось усилением пролиферетивной активности лимфоцитов в ответ на стимуляцию аллоантигенами (таблица).

Испытание способа проводили на 36 самцах-гибридах (CBAxC57B1/6)F1. В каждой серии опытов клетки селезенки пулировали от 3-4 животных, 20•10^-5 клеток селезенки вносили в пластиковые флаконы в объеме 1 мл среды RPMI-1640, дополненной 5% инактивированной человеческой сывороткой 4 группы, 2 мМ 1-глютамина, 10 мМ буфера Hepes, 5•10^-5 М 2-меркаптоэтанола, 50 мкг/мл гентамицина.

Выделяли следующие группы:
1. Контрольная группа - клетки селезенки, не подвергавшиеся воздействию аргоновой плазмы.

2. Подопытная группа - клетки селезенки, подвергавшиеся воздействию аргоновой плазмы в течение 30 секунд.

После облучения изучали пролиферативную активность лимфоцитов в реакции бласттрансформации и в смешанной культуре лимфоцитов. Проведенные исследования показали, что воздействие аргоновой плазмы на лимфоциты усиливает их пролиферативную активность в ответ на стимуляцию Т-клеточным митогеном Кон-A и аллоантигенами. Результаты опытов представлены в таблице.

Использование предлагаемого способа стимуляции пролиферативной активности лимфоцитов обеспечивает следующие преимущества:
1. По сравнению с другими способами стимуляции пролиферативной активности лимфоцитов эффект достигается в результате очень короткого времени действия фактора (30 с).

2. Способ позволяет локально воздействовать на функции лимфоцитов как в культуре клеток, так и в пределах целостного организма.

Изобретение относится к медицине. Может быть использовано в клинической практике. Клетки селезенки помещают в среду RPMI-1640, дополнительно содержащую 5% инактивированную человеческую сыворотку 4 группы, 2 мМ 1-глютамина, 10 мМ буфера Hepes, 5•10^-5 М 2-меркаптоэтанола, 50 мкг/мл гентамицина. Подвергают их воздействию аргоновой плазмы, полученной при силе тока 30 А, напряжении 20 В и расходе газа 1 л/мин. Воздействие осуществляют в течение 30 с с расстояния 20 см от сопла плазмотрона. Способ обеспечивает сокращение времени воздействия физического фактора на клетки и позволяет локально действовать на функции лимфоцитов как в культуре клеток, так и в пределах организма. 1 табл.

Способ стимуляции пролиферативной активности лимфоцитов, находящихся в среде RPMI - 1640, физическим фактором, отличающийся тем, что среда дополнительно содержит 5% инактивированной человеческой сыворотки 4 группы, 2 мМ 1-глютамина, 10 мМ буфера Hepes, 5 • 10^-5 M 2-меркаптоэтанола, 50 мкг гентамицина, а в качестве физического фактора используют аргоновую плазму, полученную при силе тока 30 А, напряжении 20 В и расходе газа 1 л/мин и осуществляют воздействие на лимфоциты в течение 30 с с расстояния 20 см от сопла плазмотрона.