Способ определения интерлейкина-1 моноцитов человека Советский патент 1992 года по МПК G01N33/53 

Изобретение отностися к медицине, преимущественно к иммунологии, и может быть использовано в диагностике состояния иммунной системы.

Цель изобретения - упрощение, ускорение и повышение точности определения ИЛ-1 моноцитов человека.

Поставленная цель достигается тем, что моноциты крови после отделения от лимфоцитов в пластиковых лунках посредством адгезии промывают, активируют липополисахаридом в течение 1,5-3 ч, повторно промывают и вносят в лунки равный объем (0,2 мл) суспензии аутологических лимфоцитов и фитогемагглютинин и после культивирования смеси клеток подсчитывают по сравнению с контрольными пробами индекс восстановления реакции бласттрансформа- ции.

Способ осуществляют следующим образом.

Гепаринизированную(20 ЕД), венозную кровь в объеме 5-6 мл наслаивают на 2 мл градиента Фиколл-Гипак (1,077 г/см3) в центрифужной пробирке и центрифугируют при 400 g 40 мин. Фракцию мононуклеаров, находящуюся в интерфазном слое, собирают, отмывают три раза физиологическим раствором и приготавливают суспензию клеток до кон центрации 2 х 106 в 1 мл среды RRM1 -1640 с 10%-ной инактивированной AB(IV) сывороткой. Для разделения прилипающих и не- прилипающих клеток суспензию мононуклеарных клеток разливают по 0,2 мл на одну лунку в пластиковые плоскодонные планшеты для культивирования клеток и инкубируют в течение 45 мин при 37°С и 5% С02. Неприлипшие клетки, состоящие на 95% из лимфоцитов (окраска азур-эозином)

Ч

СО

8

ю

4Ьь

собирают и хранят при 4°С до использования. Прилипшие клетки, состоящие на 92% из моноцитов (окраска на неспецифическую эстеразу), осторожно промывают несколько раз средой 199 и во все лунки добавляют по 0,1 мл среды РРМ1-1640. Клетки активируют липополисахаридом Е. Coli (ЛПС Sen/a) импульсным методом. Для этого в часть лунок с моноцитами вносят по 0,02 мл (20 мкг/мл) ЛПС, в другие - 0,02 мл среды RPM1-1640 и инкубируют при 37°С и 5% С02 в различные интервалы времени (0,5; 1,5; 3,0 ч). По окончании удаляют всю над- осадочную жидкость и лунки с клетками осторожно промывают три раза средой 199. Затем в монослой моноцитов (активированных и неактивированных ЛПС) вносят по 0,2 мл суспензии аутологичных неприлипших клеток (лимфоцитов) в концентрации 2x10 на 1 мл среды RPM1-1640 с 20 мМ глутами- на, 10% инактивированной АВ (IV) сыворотки и 50 мкг/мл гентамицина. В часть лунок (опыт) с клеточными смесями, состоящими из активированных или интактных моноцитов и лимфоцитов, добавляют субоптимальную дозу(1 мкг/мл) Ф ГА в объеме 0,02 мл. В другие (контроль) вносят равный объем среды RPM1- 1640. Планшеты помещают в термостат при 37°С с 5% СОа и культивируют в течение 72 ч. По окончании реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) готовят мазки клеток, в которых определяют бластные клетки.

РБТЛ с исходными мононуклеарными клетками и с неприлипшими клетками (лимфоциты) ставят с целью контроля спонтанного и митоге- ниндуцированного пролиферативного ответа клеток. Для этого в лунки помещают по 0,2 мл суспензии клеток с концентрацией 2x10 на 1 мл среды RPM1-1640 с 20 мМ глутамина, 10% инактивированной AB(IV) сыворотки и 50 мкг/мл гентамицина. В опытные лунки добавляют 0,02 мл ФГА(10 мкг/мл), в контрольные лунки -такое же количество среды и культивируют при 37°С с 5% С02 в течение 72 ч с последующим определением бластных клеток. РБТЛ во всех исследованиях оценивают по индексу активации (ИА) - отношение числа бластных клеток в культурах, обработанных ФГА (опыт), к количеству бластных клеток в культурах, не обработанных ФГА (контроль).

Для оценки продукции ИЛ-1 моноцитами используют индекс восстановления реакции бласттрансформации (ИВРБ).

Лимфоциты + моноциты, активированные ИА импуль- сным методом, или интакт- ные моноциты - ИА (лимфоциты)

ИА (мононуклеары) ИА (лимфоциты)

В части исследований ИЛ-1 определяют в суточных супернатантах моноцитов, активированных ЛПС импульсным методом, а также в суточных супернатантах интактных моноцитов согласно изобретению. Для этого монослой клеток инкубируют с или без ЛПС в течение 0,1; 1,5; 3 ч. Затем их осторожно промывают три раза средой 199 от индуктора, суспензируют в среде RPM1- 1640 и культивируют в течение 1 сут при 37°С с 5% . Затем собранные суперна- танты центрифугируют при 400д 15 мин и определяют в них активность ИЛ-1. Полученные данные выражают в ИВРБ.

ИА (лимфоциты) + ИЛ) - ИА (лимфоциты)

ИА (мононуклеары ) - ИА (лимфоциты)

где ИЛ - суточные супернатанты моноцитов, активированных импульсным методом ЛПС или интактных моноцитов.

Полученные результаты подвергают статистической обработке с применением критерия Стьюдента.

Результаты. Интактные моноциты стимулируют пролиферативный ответ аутологичных лимфоцитов в ответ на субоптимальную дозу ФГА по сравнению с пролиферацией одних лимфоцитов (фиг.1). Однако эти клетки не способны восстанавливать пролиферацию лимфоцитов до показателей, полученных в РБТЛ с мононуклеарными клетками, так как ИВРБ равен 0,6 ±0,09. После активации моноцитов ЛПС в течение 0,5 ч их способность стимулировать пролиферацию лимфоцитов существенно не отличается от действия интактных клеток (фиг.1), Пролиферативный ответ лимфоцитов значительно возрастает (Р 0,05) после активации моноцитов ЛПС в течение 1,5 ч и сохраняется при применении моноцитов, активированных ЛПС 3 ч (фиг.1). Полученные данные свидетельствуют о том, что после импульсной активации ЛПС моноциты приобретают способность усиливать пролиферативный ответ аутологичных лимфоцитов в ответ на субоптимальную дозу ФГА.

ЛПС является хорошим индуктором продукции ИЛ-1 моноцитами. Поэтому предполагается, что после импульсной активации ЛПС моноциты человека приобретают способность продуцировать ИЛ-1, который стимулирует пролиферацию аутологичных лимфоцитов. Для подтверждения этого с помощью известного способа определяют ИЛ-1 в суточных супернатантах моноцитов, активированных ЛПС импульсным методом. Кроме того, известным способом определяют ИЛ-1 в суточных супер- натантах интактных моноцитов человека, Оказалось, что супернатанты интактных клеток стимулируют пролиферацию лимфоцитов в ответ на субоптимальную дозу ФГА. ИВРБвэтихслучаях равен 0,92 ± 0,12 (фиг.2), что видно по результатам, полученным согласно известному способу. Увеличение ИВРБ наблюдается при использовании супернатантов моноцитов, активированных ЛПС импульсным методом в течение 1,5 и 3 ч (фиг.2), в то время как супернатанты моноцитов, активированных ЛПС в течение 0,5 ч, не обладают таким действием (фиг.2).

Результаты этих исследований свидетельствуют о том, что моноциты,активированные ЛПС импульсным методом, приобретают способность продуцировать ИЛ-1, который определяется в суточных су- пернатантах этих клеток с помощью известного способа.

Таким образом, приведенные данные показывают, что моноциты, активированные ЛПС импульсным методом, продуцируют ИЛ-1, который определяется по стимуляции пролиферации аутологичных лимфоцитов в ответ на субоптимальную дозу ФГА.

П р и м е р 1. Исследования проведены на крови 25 доноров станции переливания крови. Статистически обработанные результаты представлены на фиг.1. После активации моноцитов ЛПС в течение 0,5 ч их способность стимулировать пролиферацию аутологичных лимфоцитов в ответ на субоптимальную дозу ФГА существенно не отличается от действия интактных моноцитов. Это указывает на то, что в обоих случаях определяется одинаковая способность моноцитов человека продуцировать ИЛ-1. При активации моноцитов ЛПС в течение 1,5 и 3 ч возрастает (,05) пролиферативный ответ лимфоцитов на субоптимальную концентрацию ФГА, На основании полученных данных можно считать, что моноциты человека, активированные ЛПС импульсным

методом (1,5-3 ч), продуцируют ИЛ-1, который определяется по способности стимулировать пролиферацию аутологичных лимфоцитов, стимулированных субоптимальной дозой ФГА.

П р и м е р 2, Проведено определение ИЛ-1 моноцитов человека по известному и предлагаемому способам у 30 доноров станции переливания крови.

Данные представлены в таблице.

При использовании известного способа определено одинаковое количество ИЛ-1 (ИВРБ 0,92 ±0,12). При определении ИЛ- 1 моноцитов человека предлагаемым способом ИВРБ равен 1,35 ±0,1, что выше данных по известному способу. Следовательно, предлагаемый способ повышает точность определения ИЛ-1 моноцитов человека.

Положительный эффект изобретения заключается в упрощении, ускорении и повышении точности определения ИЛ-1 моноцитов человека за счет импульсной активации моноцитов липополисахаридом и

использования аутологичной системы им- мунокомпетентных клеток (моноциты и лимфоциты).

Формула изобретения Способ определения интерлейкина-1

моноцитов человека путем оценки влияния продуктов культивирования моноцитов на пролиферативную активность ФГА-стиму- лированной культуры лимфоцитов человека, отличающийся тем, что, с целью

упрощения, ускорения и повышения точности определения, моноц-иты крови после отделения от лимфоцитов в пластиковых лунках посредством адгезии промывают, активируют липополисахаридом в течение

1,5 - 3 ч, повторно промывают и вносят в лунки в объеме 0,2 мл суспензии аутологичных лимфоцитов с фитогемагглютинином и после культивирования оценивают по сравнению с контрольными пробами индекс восстановления реакции бласттрансформации.

UBPB

W 7,2

1,0 0,8 0,6 DM 02

Q -Моноциты, актибироданные NIC импульсным методом

Щ-Цнтактные моноциты

Использование: изобретение относится к медицине, преимущественно к иммунологии, и может быть использовано в диагностике состояния иммунной системы. Цель изобретения - упрощение, ускорение и повышение точности определения ИЛ-1 моноцитов человека. Моноциты крови после отделения от лимфоцитов в пластиковых лунках посредством адгезии промывают, активируют липополисахаридом в течение 1,5-3 ч, повторно промывают и вносят в лунки равный объем (0,2 мм) суспензии ауто- логичных лимфоцитов и фитогемагглютинин в субоптимальной дозе и после культивирования подсчитывают по сравнению с контрольными пробами индекс восстановления реакции бласттрансфор,мации. Положительный эффект изобретения заключается в уп- рощении.ускорении и повышении точности определения ИЛ-1 за счет импульсной активации (1,5-3 ч) моноцитов липополисахаридом и использования аутологичной системы иммунокомпетентных клеток (моноцитов и лимфоцитов). 2 ил. 1 табл.

0,5

1$ ,0 бремя схтиосции. тоноци.поо АЛС(чс.сь1) фиг,1

R BimPXffl™ оноцито8 вмпиоирооанных uMnuAhT