Способ проведения микрохирургических операций с яйцеклетками и эмбрионами Советский патент 1992 года по МПК A61D19/04 C12N5/00 C12Q1/24 

-

fe

Использование: биотехнология, трансплантация эмбрионов млекопитающих. Сущность изобретения: Эмбрионы крупного рогатого скота на стадии морулы получают на 7-й деньпослеосеменения. Помещают их в 1,5 М раствор сахарозы в фосфатно-срле- вом буфере Дюльбекко. Заточенной микропипеткой делают прокол оболочки и извлекают содержимое клетки. Зародыш без оболочки переносят в изотонический раствор. Производят разделение зародыша на две половинки. Две части эмбриона переносят в 1,5 М раствор сахарозы. Каждую из частей зародыша помещают во внеклеточную оболочку и переносят в физиологический раствор. 2 ил., 1 табл.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к микррхирургии биологических объектов, имеющих внеклеточную оболочку, и может быть использовано в трансплантации эмбрионов млекопитающих.

Целью изобретения является повышение сохранности биологического объекта и повышение технологичности операции.

Поставленная цель достигается тем, что биологический объект извлекают из внеклеточной оболочки в гипертоническом растворе непроникающих через мембрану клетки веществ концентрации 1,2-1,5 М в среде, обеспечивающей жизнеспособность.

Через оболочку вводят капилляр, втягивают в него клеточную массу биологического объекта и извлекают ее из оболочки, проводят микрохирургические операции с клеточной массой в растворе, обеспечивающем жизнеспособность, затем при необходимости помещают снова ее в одну или несколько внеклеточных оболочек в гипертоническом растворе и переносят в изотонический физиологический раствор.

Способ проведения микрохирургических операций основан на том, что внеклеточная оболочка биологического объекта, в частности прозрачная оболочка (зона пел- люцида) яйцеклеток и эмбрионов, не обладает избирательной проницаемостью, в то время как цитоплазматиче.ские мембраны клеток, в частности яйцеклеток и бластоме- ров эмбрионов, обладают избирательной проницаемостью. Это приводит к тому, что при помещении в гипертонические растворы непроницаемых через цитоплззматиче- ские мембраны качеств, например хлористого натрия, сахарозы осмомолярно- стью 1,2-1,5 М, обьем клеточной массы биологического объекта уменьшается ч 2.5-2.8

ю

ы

00

N5. ГО

I

раза, а размеры внеклеточной оболочки не изменяются.

На фиг.1 на примере 2-клеточного эмбриона отображены объемы внутриклеточной массы зародыша, находящегося в изотоническом растворе; на фиг.2 - то же, в гипертоническом растворе осмомолярно- стью 1,2-.1,5-М. v

Выбор концентрации 1,2-1,5 М обусловлен тем, что п$ и более низкой концентрации еныиеййе.объема клеточной массы незначительно и извлечь ее из внеклеточной оболочки трудно,а более высокая концентрация непроаникающих веществ повреждает клетки (см. таблицу.).

Сущность способа заключается в следующем.

Биологический объект, имеющий внеклеточную оболочку, находящийся в физиологическом растворе, переносят в гипертонический раствор непроникающих веществ осмомолярностью 1,2-1,5 М. Выдерживают в растворе в течение 1 мин, а затем фиксируют положение микросоской. Микроиглой или микроножом делают прокол или разрез внеклеточной оболочки, вводят микропипетку и вынимают целый или часть биологического объекта из собственной оболочки. Переносят его в изотонический раствор; где объект принимает прежние форму и размеры. Проводят необходимые операции и снова переносят целый или часть объекта в гипертонический рас твор, где они уменьшаются в объеме. При необходимости помещают часть или целый биологический объект в пустую внеклеточную оболочку.

Пример. Эмбрионы крупного рогатого скота на стадии морулы получают на 7-й день после осеменения. Пригодные к работе эмбрионы помещают в 1,5 М раствор са- харозы в фосфорно-солевом буфере Дюльбекко. В таком растворе объем внутриклеточной массы зародыша уменьшается в 2,8 раза, а размеры внеклеточной оболочки не изменяются, при этом пространство между оболочкой и цитоплазматической мембраной увеличивается. Микрохирургическую операцию проводят под микроскопом Биолам Р-2 с помощью двух

позиционеров микроманипулятора, эмбрионы удерживают микроприсоской. Заточен ной микропипеткой с диаметром, сравнимым с размерами внутриклеточной

массы, находящейся в гипертоническом растворе, делают прокол оболочки и извлекают содержимое клетки. При этом разрыв внеклеточной оболочки незначителен, а собственно эмбрион извлекают из нее без

повреждений. Зародыш без оболочки переносят в изотонический раствор, где эмбрион восстанавливает свой первоначальный объем, и производят разделение зародыша стеклянной иглой на две половинки. Затем

две части эмбриона переносят в 1,5 М раствор сахарозы снова, где размеры половинок уменьшаются. Одну из частей зародыша помещают, через отверстие во внеклеточную оболочку, из которой эмбрион был извлечен, а вторую часть зародыша - в другую оболочку, из которой предварительно извлечено содержимое. После проведения микрохирургической операции половинки эмбрионов, находящиеся во внеклеточной

оболочке, переносят в физиологический раствор.

Результаты эксперимента показывают, что использование гипертонического раствора при удалении внеклеточной оболочки

позволяет манипулировать с эмбрионами без риска их повреждения и, следовательно, повысить процент жизнеспособных половинок после разделения зародышей.

Формула изобретения

Способ проведения микрохирургических операций с яйцеклетками и эмбрионами, включающий извлечение их из внеклеточной оболочки с последующим возвращением в пустую оболочку, отличающийся тем, что, с целью повышения сохранности биологического объекта и повышения технологичности операции; извлечение яйцеклеток и эмбрионов из

внеклеточной оболочки и возвращение их в пустую оболочку осуществляют в гипертоническом растворе непроникающих веществ осмомолярностью 1,2-1,5 М в среде, обеспечивающей жизнеспособность, объектов.

Биологические объекты помещают в гипертонический раствор, выдерживают в течение 1 ч, возвращают в физиологические условия и культивируют вне организма.

Биологические объекты культивируют вне организма в изотоническом растворе.

ZW/