Способ отбора клеток-доноров ядер у низших позвоночных Советский патент 1992 года по МПК C12N5/00 A01K61/00 C12N15/00 

Изобретение относится к способам генной инженерии и разведения рыб, культивирования или сохранения тканей и живых клеток и может быть применено в селекции и выведении новых пород рыб, в практике исследований по сохранению и реализации генетической информации редких и исчезающих видов низших позвоночных, а также в фундаментальных и прикладных экспериментально-эмбриологических исследованиях, имеющих в своей основе метод трансплантации ядер зародышевых и соматических клеток в яйцеклетки.

Известен способ отбора клеток-доноров ядер у низших позвоночных, предусматривающий ведение клеточных культур

эмбриональных или дифференцированных соматических клеток и синхронизацию их по стадиям митотического цикла.

За прототип может быть выбран способ отбора клеток-доноров ядер у низших позвоночных, который заключается в том, что берут клетки эмбрионов амфибий и выводят их в монослойную клеточную культуру.

Целью предлагаемого способа является упрощение способа отбора клеток-доноров ядер и, повышение точности и надежности метода за счет использования зародышей костистых рыб, а также проведения визуальной идентификации и отбора клеток по стадиям митотического цикла.

«xd

VJ

О

«-л

vj О

Поставленная цель достигается тем, что зародышей костистых рыб на различных стадиях эмбриогенеза освобождают от оболочек известным микрохирургическим методом, диссоциируют на отдельные клетки в бескальциевом физиологическом растворе для холоднокровных животных, после чего проводят визуальную идентификацию и отбор клеток-доноров по стадиям митотиче- ского цикла.

Использование зародышей костистых позволяет сразу после диссоциации зародыша на отдельные клетки производить визуальную идентификацию и отбор клеток-доноров ядер непосредственно перед опытом под контролем светооптических приборов. Это существенно упрощает способ.

Визуальный отбор позволяет использовать клетки на единственно возможных для опыта стадиях цикла, что повышает точность метода. Отказ от предварительного вывода клеток в культуру предохраняет от появления в опыте различных аномалий.

Предлагаемый способ реализуется следующим образом.

П р и м е р 1. Зародышей вьюна освобождают от оболочек двумя остро заточен- ными препаравальными иглами и диссоциируют на отдельные клетки в/бескальциевом физиологическом растворе для холоднокровных в течение 10 минут при комнатной температуре. После этого предметное стекло с каплей раствора, в которой находятся клетки, помещают в поле зрения бинокулярного микроскопа с общим увеличением 16х-32х и отбирают клетки с округлым тонко оконтуренным ядром на стадии поздней интерфазы клеточного цикла, после чего ядра трансплантируют в неоплодотворенныеискусственно

активированные водой яйцеклетки вьюна по соответствующей методике (5). Дробление яйцеклеток-реципиентов происходит в 100% случаев (см. табл. 1).

П р и м е р 2. Опыт проводят по схеме, как в примере 1, но диссоциацию клеток ведут в течение 20 мин и отбирают клетки, в которых ядра имеют более четко прорисованный утолщенный контур, соответствующий стадии профазы клеточного цикла, и трансплантируют их в яйцеклетки-реципиенты по той же методике (5). Дробление яйцеклеток-реципиентов происходит в 100% случаев (см. табл. 1).

Формула изобретения

Способ отбора клеток-доноров ядер у низших позвоночных, включающий использова- ние зародыша низших позвоночных, обработку клеток бескальциевым раствором

для диссоциации с последующим определением стадии митотического цикла, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, повышения его трчности и надежности, в качестве зародыша, низших позвоночных используют зародыши костистых рыб, а определение диссоциированных клеток на стадиях поздней интерфазы и профазы митотического цикла с последующим отбором осу- ществляют визуально под контролем

светооптических систем.

Использование: селекция и выведение новых пород рыб, исследования по сохранению и реализации генетической информации редких и исчезающих видов низших позвоночных, фундаментальные и прикладные экспериментально-эмбриологические исследования. Сущность изобретения: зародыши костистых рыб на различных стадиях эмбриогенеза освобождают от оболочек, диссоциируют на отдельные клетки в бескальциевом физиологическом растворе для холоднокровных животных, после чего проводят визуальную идентификацию и отбор клеток-доноров ядер по стадиям митотиче- ского цикла.

Результаты экспериментов по трансплантации ядер, находящихся на различных стадиях митотического цикла, в неоплодотворенные яйцеклетки вьюна