Способ получения жизнеспособных поздних бластоцист лошадей IN VIтRо Советский патент 1989 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к эмбриотех- нологии, а именно к способам культивирования эмбрионов лошадей.

Цель изобретения - получение жизнеспособных поздних бластоцист лоша- дей in vitro.

Поставленная цель достигается тем, что эмбрионы после извлечения .помещают в питательную среду, инкубируют в термостате в течение 12- 24 ч, а затем отбирают бластоцисты с поверхности питательной среды, содержащей желток куриного яйца и фос- фатно-солевый буфер Дюльбекко и/или кобылье молоко при следующем соотношении компонентов: желток куриного яйца: фосфатно-солевый буфер Дюяьбек- ко (1-3):(2-4); желток куриного яй- ца: кобылье молоко (1-4): (1-4), желток куриного яйца фосфатно-солевый буфер Дюльбекко: кобылье молоко (1-3):(1-3):(1-ЗГ.

Для определения оптимальных соот ношений вводимых в среду компонентов используют принцип треугольной трех- компонентной диаграммы Гиббса-Розе- бома. В одной серии опытов готовят 21 вариант среды с .20%-ным интервалом ,концентрации базового раствора, желтка- и молока. Всего проводят 2 серии опытов. В первой серии опытов .зародыши культивируют в течение 12 ч, а во второй в течение 24 ч.

Способ осуществляют следующим образом.

В стерильный флакон последовательно добавляют желток куриного яйца, ФБС Дюльбекко и/или кобылье молоко в указанных соотношениях.

Компоненты осторожно перемешива- . ют, не допуская образования пены, до получения однородной смеси. Флакон со средой помещают в термостат для подогрева до оптимальной температу1

со

N-

СП

3149

ры. Извлеченный 8-дневньш эмбрион лошади пипеткой переносят в культу- ральную среду и инкубируют при , До и после культивирования проводят оденку и измерение эмбрионов под мик- роскопом МСБ-9.

Интенсивность роста бластоцист в среде,состоящей из желтка куриного яйца и ФБС Дюльбекко в соотношениях (1-3):(2-4), приведены в табл. 1.

Наилучший результат получен при культивировании в среде 3 (6 мл желтка и 4 мл ФЭБ Дюльбекко).

Интенсивность роста бластодист в среде, состоящей из желтка куриного яйца и кобыльего молока в соотношениях (1-4):(1-4), приведено в табл. 2

Стабильный рост бластоцист наблюдают в среде 8, содержащей 4 мл желтка куриного яйца и 6 мл стерильного кобьшьего молока.

Интенсивность роста бластоцист в среде, содержащей желток куриного яйца, ФБС Дюльбекко и кобылье молоко в соотношениях (1:3):(1:3):(1:3) , и приведена в табл. 3.

Анализ результатов культивировани показывает, что бластоцисты развивают- ся как при 12-часовом, так и при 24-часо вом культивировании, причем рост является стабильным.Наилучшие результаты получают при культивировании эмбрионов в среде 14, которая содержит 4 мл желтка куриного яйца 2 мл ФБС Дюльбекко и 4 мл стерилизованного кобыльего молока.

.Таким образом, устанавливают, что восьмисуточные лощадиные эмбрионы в период 12-24 часового пребывания в культуральных средах, состояшлх из смеси желтка с кобыльим молоком и/или фосфатно-солевым буферным раствором Дюльбекко, продолжают интенсивно увеличиваться в размерах. При просмотре под микроскопом у большинства прокультивированных в этих средах зародышей не отмечают каких-либо отклонений от нормы. Клетки трофо- бласта и эмбриобласта четко выраже- ны, зародьш полупрозрачен, правиль-. ной шаровидной формы. Эмбрионы, помещенные на 12-24 ч в чистый желток или фосфатно-солевый буферный раствор Дюльбекко, не растут. При осмот- ре под микроскопом у 1шх обнаруживают признаки дегенерации: клетки тро- фобласта сморщиваются и сжимаются в плотный помутневший комок, оболоч0

21

г

5

р

п 5

5 Q 5

54

ка-бластолемма резко отделяется от клеточной массы по всему периметру. Часть помещенных в чистое кобылье молоко либо смесь кобыльего молока с фосфатно-солевым буферным раствором Дюльбекко эмбрионов увеличивается в размерах незначительно. Эти зародыши, как правило, сохраняют ндр- мальную клеточную структуру, полупрозрачны, но у них по периметру просматриваются участки с частично отделенной от клеточной массы оболоч- кой-бластолеммой.

Во время проведения опытов неожиданно обнаружено, чем эмбрионы с нормальной клеточной структурой, помещенные в среды 2-4, 7-9, 11-16, всплывают к поверхности жидкости и приближаются к стенкам стеклянного сосуда, где могут быть легко обнаружены визуально. Эмбрионы с нарушенной клеточной структурой постепенно погружаются в толщу жидкости. Кроме того,.плавающие у поверхности блас- тодисты за период культивирования существенно увеличиваются в размерах. Опустившиеся в толщу жидкости зародьш1и не растут.

Клеточная структура плавающих после культивирования у поверхности зародьш1ей не отличается от нормы. Опустившиеся в толщу эмбрионы всегда имеют сморщенные и спавшие клетки трофо- и эмбриобласта и отслоенную оболочку бластолемму.

Формула изобретения

1.Способ получения жизнеспособных поздних бластоцист лошадей

in vitro, включающий извлечение эмбрионов помещение их в питательную среду, содержащую желток куриного яйца и фосфатно-солевой буфер Дюльбекко и/или кобылье молоко, с последующей инкубацией в термостате в течение 12-24 ч и отбором бластоцист с поверхности питательной среды. .

2.Способ по п. 1, отличающийся тем, что желток куриного яйца и фосфатно-солевой буфер Дюльбекко берут в соотношении (1-3): :(2-4).

3.Способ по п. 1, отличающийся тем, что желток куриного яйца и кобылье молоко берут в соотношении (1:4)-(1:4).

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что желток куриного яйца, фбсфатно-солевой буфер Дюльбекко и кобылье молоко берут в соотношении (1-3):(1-3):(1-3).

Изобретение относится к эмбриотехнологии, а точнее к способам культивирования эмбрионов лошадей. Целью изобретения является обеспечение нормального роста и развития поздних бластоцист лошади IN VITRO и разработка способа оценки их жизнеспособности. Для этого бластоцисты после извлечения и оценки помещают на 12 - 24 ч в культуральную среду, содержащую желток диетического куриного яйца, фосфатно-солевой буферный раствор Дюльбекко (ФБС Дюльбекко) и/или стерилизованное кобылье молоко , и культивируют в обычной газовой атмосфере. При остальных равных условиях наилучший результат получается при культивировании бластоцист в среде, содержащей, мас.%: желток 40

ФБС Дюльбекко 20

молоко 40 . Жизнеспособность эмбрионов определяют визуально по месту их расположения в толще жидкости. 3 з.п. ф-лы, 5 табл.

Соотношение ингредиентов Увеличение объема бластоцист, Средав среде, мл% к начальному объеь5у

Желток ФБС Дюльбекко при 12-часовом при 2 4-часовом

культивировании культивировании

1010

22 8336,7610,4

364425,91005,0 4 46305,7324,3

582 - 429,9

Таблица 2

Соотношение ингредиентов Увеличение объема бластоцист, Среда в среде, мл% к начальному объему

-г:Т

Желток Молоко при 12-часовом при 24-часовом

культивировании культивировании ..-..««.«.--«1--«-..««-

6О10176,1

728 340,4368,1 84 6 304,9773,9

964490,9232,8

1010О.--.

Таблица 3

Соотношение ингредиентов Увеличение объема бластоцист, Средав среде, мл 7, к начальному объему

при 24-часовом культивировании

12244275,070У,7

13-262125,8626,7

14424413,9844,5

15442133,2864,2

16622116,7767,8

Составитель И.Тареева Редактор Н.Киштулинец Техред М.Ходанич Корректор С.Черни

Заказ 4406/29Тираж 501Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат Патент, г.Ужгород, ул. Гагарина,101

Таблиц