Способ определения адгезивности тромбоцитов Советский патент 1992 года по МПК G01N33/53 

(Л

С

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для определения адгезивности тромбоцитов путем подсчета относительного количества их в плазме до и после пропускания еэ через коллагеновый пористый материал, содержащий в своем составе 0,5-0,25% аденозиндифосфорный кислоты. Различия в индексе адгезивности здоровых и больи ых людей позволяет определить их функциональную неполноценность, а также длет объективную величину активности различных антиагрегантов и лекарственных средств. Способ позволяет определять адгезивность тромбоцитов в тромбоцитопенической плазме в условиях клиники, не прибегая к их выделению и концентрированию. Способ позволяет дифференцировать активные и неактивные тромбоциты при vx. дефиците в случае тром- боцитопении.

Изобретение относится к медицине, в частности к способам оценки функциональной активности тромбоцитов, и может применяться для диагностики функциональной патологии тромбоцитов, а также для контроля за действием лекарств, влияющих на функциональную активность тромбоциточ,

Известен способ определения адгезив- ности тромбоцитов в условиях клиники , за- ключающийся в подсчете количества тромбоцитов в цитратной до и после пропускания ее через попихлорвиниловую трубку, заполненную мелкими стеклянными шариками. Расчет индекса адгезивности тромбоцитов представляет собой выраженное в процентах отношение количества тромбоцитов, задержавшихся на стеллян- ных шариках к исходному количеству тромбоцитов в крови.

Для осуществления этого теста нужно 2 мл цитарной крови и инфузионный насос, обеспечивающий непрерывное равномерное продвижение исследуемой крови по ко- лонке со стеклянными шариками. Недостатком спосс&д является также и то, что при пропускании интактной тромбоци- тарной плазмы через колонку со стеклянными шариками прилипания тромбоцитов не происходит.

Целью изобретения является повышение чувствительности, упрощение и ускорение способа, з также возможность определения адгезивности тромбоцитов в плазме.

Следует отметить, что обеспечение возможности исследования тромбоцитарной плазмы является значительным достижением, поскольку при этом возможна стандартизация количества тромбоцитов в

ч

CJ

о ю :о

исследуемом образец, что повышает достоверность определения путем разделения тромбоцитарной плазмы человека его же быстротромбоцитарной плазмой до стандартного количества, например, 100000 или 200000 тромбоцитов в 1 мкл и устраняется возможное влияние других клеток крови (эритроцитов, лейкоцитов), на адгезивность тромбоцитов,

Указанная цель достигается тем, что в качестве материала, с которым взаимодействуют тромбоциты, сохраняющие хотя бы минимальную способность к адгезии, используют коллагеновый материал, содержащий АДФ (аденозиндифосфорная кислота), при соотношении коллаген-АДФ (мас.%), (99,5-99,75) - (0,5-0,25).

Способ осуществляют следующим образом.

Из коллагенового материала вырезают цилиндрический кусочек толщиной 5-7 мм и диаметром 5-7 мм, который вставляют в пластиковый наконечник стандартной автоматической лабораторной пипетки на 200-500 мл и опускают его в пластиковую пробирку соответствующих размеров (для сбора профильтрованной плазмы). После этого из исследуемой тромбоцитарной плазмы берут пробу для подсчета исходного количества тромбоцитов, а затем 200-400 мкл тромбоцитарной плазмы вносят в наконечник с коллагеновым материалом, после чего наконечник присоединяют к пипетке и нажатием колпачка пропускают плазму через коллагеновую губку. Пропущенную плазму встряхивают и отбирают от нее пробу для подсчета количества тромбоцитов. По результатам подсчета тромбоцитов в плазме до и после прохождения ее через коллагеновый материал, рассчитывают как обычно ин- деке адгезивности тромбоцитов,

Для целей диагностики и контроля за действием ингибиторов адгезивно-агрега- ционной функции тромбоцитов используют коллагеновый материал, который в норме задерживает не менее 30% тромбоцитов, содержащихся в плазме. Такие свойства присущи коллагеновому материалу, приготовленному из раствора коллагена в сочета- нии с АДФ при соотношении коллаген-АДФ, равном (мас.%); (99,5-99,75)- (0,5-0,25).

П р и м е р 1. Диагностика врожденного нарушения функциональной активности тромбоцитов (тромбоцитопатии). Описанным способом со стандартной тромбици- тарной плазмой (200000 тромбоцитов в 1 мкл) определяют адгезивность тромбоцитов у 10 здоровых людей и больного с врожденным нарушением секреторной реакции

тромбоцитов, установленным на основании тщательных исследований системы гемостаза, включающих определение адгезивности тромбоцитов обычным способом, а также агрегацию тромбоцитов при стимуляции АДФ, коллагеном, адреналином и рис- томицином. У здоровых людей индекс адгезивности колебался в пределах 35-65% и составил в среднем 50И%, индекс адгезивности у больного составил 8%. Получаемое различие в индекс адгезивности тромбоцитов позволяет диагностировать их функциональную неполноценность (тром- боцитопатия).

П р и м е р 2. Оценка активности ингибитора функции тромбоцитов. Определяют адгезивность тромбоцитов в нормальной плазме, содержащей водорастворимый аспирин в концентрации 1 ммоль/л и в нормальной плазме, к которой был добавлен вместо аспирина адекватный объем физиологического раствора NaCI. При исследовании плазмы, содержащей антиагрегат, индекс адгезивности тромбоцитов равнялся 2, в контроле 47%, Различие в индексе адгезивности тромбоцитов дает объективную величину активности ингибитора.

Предлагаемый способ пригоден для определения адге: ивности тромбоцитов в тромбоцитопенической плазме. Известно, что оценка адгезивно-агрегационной активности тромбоцитов при тромбоцитопении обычными методами невозможна. При необходимости исследователи прибегают к выделению тромбоцитов из большого объема плазмы посредством центрифугирования или гельфильтрации и последующему их концентрированию посредством ресуспен- дирования в очень небольшом объеме специально приготовленного буферного раствора.

Поскольку эти методы являтюся очень трудоемкими и дорогостоящими, они практически не применяются в клинических условиях и доступны лишь некоторым исследователям.

Предлагаемый способ дает возможность определять адгезивность тромбоцитов в условиях кпиники, не прибегая к их выделению и концентрированию. Это достигается тем, что подсчет тромбоцитов в тромбоцитопенической плазме до и после пропускания через коллагеновую губку с повышенной тромбоцитзадерживающей способностью ведется не в обычном объеме плазмы, а в несколько большем объеме плазмы, Например, если обычно плазму для посчета тромбоцитов в тромбоцитарном счетчике разводят в 3000 раз (3,3 мкл плазмы разводят в 10000 мкл изотона).то при

ромбоцитопении разводят в 500-670 раз 15- 20 мкл плазмы разводят в 10000 мкл изото- на.

П р и м е р 3. Определение адгезивности плазмы при тромбоцитопении. При подсче- 5 те количества тромбоцитов в крови и плазме больного оказалось, что их было меньше 30000 в 1 мкл. Поэтому определить адгезив- ность тромбоцитов известным методом при столь небольшом количестве их практиче- 10 ски невозможно, поскольку количество задерживающихся тромбоцитов находится в пределах ошибки метода.

Производят подсчет тромбоцитов в плазме, взяв не 3,3 мкл плазмы, как это 15 делается обычно, а 20 мкл. При этом количество тромбоцитов в плазме оказалось равным 194000 в 1 мкл.

Пропускают 200 мкл тромбоцитопени- ческой плазмы больного через коллагено- 20 вую губку и снова подсчитывают количество тромбоцитов в 200 мкл. Аналогичным обра- зом определяют индекс адгезивности тромбоцитов в 10 пробах нормальной плазмы, предварительно подсчитав количество тром-15 боцитов в тромбоцитарной плазме и затем разведя ее быстромбоцитарной плазмой до содержания менее 30000 тромбоцитов в 1 мкл, т.е. определяют индекс адгезивности тромбоцитов в 10 пробах нормальной плаз- 30 мы с очень низким содержанием тромбоцитов.

Сравнивают индекс адгезивности в норме (при искусственной тромбоцитопении в нормальной плазме), который колебался в пределах 11-30% и равнялся в среднем 20. 3%, и больного тромбоцитопенией, у которого индекс адгезивности составил 0%. Эти результаты позволяют диагностировать у больного тромбоцитопеническую тромбо- цитопатию, т.е. наличие у больного не только дефицита, но и дефекта тромбоцитов.

Таким образом, предлагаемый способ заметно повышает чувствительность метода, достаточного для дифференциации активных и неактивных тромбоцитов при их дефиците.

Формула изобретения

Способ определения адгезивности тромбоцитов путем фильтрации крови с последующим подсчетом количества тромбоцитов крови, задерживающихся на фильтре, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности, упрощения и ускорения способа, а также возможности определения адгезивности тромбоцитов в плазме, подсчитывают количество тромбоцитов в цитратной крови или плазме до и после фильтрации через материал, содержащий коллаген дермы и аденозиндифос фат при их соотношении (мас.%); (99,5-99,75) - (0,5-0,25), и рассчитывают в процентах количество тромбоцитов, задерживающихся в материале.