2-ПРОИЗВОДНЫЕ 1,1,1-ТРИХЛОР-4-(2,4-ДИХЛОРФЕНИЛ)-БУТАН-4-ОНА, ПРОЯВЛЯЮЩИЕ ПРОТИВОМИКРОБНУЮ АКТИВНОСТЬ, И 1,1,1-ТРИХЛОР-2-ОКСИ-4-(2,4-ДИХЛОРФЕНИЛ)-БУТАН-4-ОН В КАЧЕСТВЕ ПОЛУПРОДУКТА ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ 2-ПРОИЗВОДНЫХ 1,1,1-ТРИХЛОР-2-ОКСИ-4-(2,4-ДИХЛОРФЕНИЛ)-БУТАН-4-ОНА Советский патент 1994 года по МПК C07C49/697 C07C49/747 A61K31/12 

Изобретение относится к области химии производных хлораля, а именно к новым производным 1,1,1-трихлор-4-(2,4-дихлорфенил)-бутан-4-она формулы I
CCl₃--CH₂-Cl где Х - ОС(О)СH₃ или Cl, проявляющим противомикробную активность и которые могут найти применение в медицине, и к 1,1,1-трихлор-2-окси-4)-(2,4-дихлорфенил)-бутан-4-ону формулы II
в качестве полупродукта для получения производных 1,1,1-трихлор-4-(2,4-дихлорфенил)-бутан-4-она.

Целью изобретения является изыскание в ряду производных хлораля новых соединений, проявляющих более высокую противомикробную активность.

П р и м е р 1. Синтез 1,1,1-трихлор-2-окси-4-(2,4-дихлорфенил)-бутан-4-она (исходное).

Смесь 18.7 г , (0,1 М) 2,4-дихлорацетофенона, 17,6 г (0,12 М) хлораля, 0,82 г (0,01 М) безводного ацетата натрия и 50 мл м-ксилола кипятят 40 ч, после охлаждения фильтруют, упаривают, остаток перекристаллизовывают из гексана, получают 20,5 г 1,1,1-трихлор-2-окси-4)-(2,4-дихлорфенил)-бутан-4-она, выход 61% , Т_пл 85-86^оС.

Найдено, % : С 36,0, 35,8; H 1,9, 2,0; Cl 53,1; 53,2.

Брутто-формула C₁₀H₇Cl₅)O₂.

Вычислено, % : C 35,7; H 2,1; Cl 52,7.

ПМР ( δ м. д. , ацетон-d₆): 3,40-3,65 (м. , 2Н, СН₂), 4,78 (м. , 1Н, МН), 6,15 (дд. , 1Н, ОН), 7,50-7,75 (м. , 3Н, С₆Н₃).

П р и м е р 2. Синтез 1,1,1-трихлор-2-ацетокси-4-(2,4-дихлорфенил)-бутан-4-она (1а).

Смесь 3,36 г (0,01 М) 1,1,1-трихлор-2-окси-4-(2,4-дихлорфенил)-бутан-4-она и 10 мл хлористого ацетила нагревают при 40^оС 10 мин и затем оставляют на 8 ч при комнатной температуре. Хлористый ацетил упаривают, образовавшийся осадок перекристаллизовывают из гексана. Получают 3,48 г 1,1,1-трихлор-2-ацетокси-4-(2,4-дихлорфенил)-бутан-4-она, выход 92% , Т_пл.79-80^оС.

Найдено, % : C 37,8, 37,7; H 2,3, 2,2; Cl 46,5, 46,3.

Брутто-формула C₁₂H₉Cl₅O₃.

Вычислено, % : C 38,0; H 2,4; Cl 46,8.

ПМР (м. д. , ацетон-d₆): 2,11 (c. , 3H, CH₃), 3,61-3,91 (м. , 2Н, СH₂), 6,12 (дд. , 1Н, ОН), 7,51-7,77 (м. , 3Н, С₆Н₃).

П р и м е р 3. Синтез 1,1,1,2-тетрахлор-4-(2,4-дихлорфенил)-бутан-4-она (1б).

Мелкоизмельченную смесь 3,36 г (0,01 М) 1,1,1-трихлор-2-окси-4-(2,4-дихлорфенил)-бутан-4-она, 1,07 г (0,02 М) хлористого натрия медленно присыпают при перемешивании к 35 мл концентрированной серной кислоты. После окончания выделения газа выдерживают 30 мин и выливают на лед. Осадок отфильтровывают, промывают на фильтре водой 4 раза по 20 мл до нейтральной реакции промывных вод. Перекристаллизовывают из гексана, получают 2,91 г 1,1,1,2-тетрахлор-4-(2,4-дихлорфенил)-бутан -4-она, выход 87% , Т_пл92-93^оС.

Найдено, % : C 34,1, 33,9; H 1,5, 1,7: Cl 58,9, 59,3.

Брутто-формула C₁₀H₆Cl₆О.

Вычислено, % : C 33,9; H 1,7; Cl 59,9.

ПМР (м. д. , ацетон-d₆): 3,80-4,15 (м. , 2Н, СН₂), 5,26 (дд. , 1Н, СН), 7,53-7,81 (м. , 3Н, С₆Н₃).

Соединения, полученные по примерам 1-3, хорошо растворимы в полярных органических растворителях, таких как ацетон, диметилсульфоксид и не растворимы в воде.

Изучение противомикробной активности соединений формулы I: противомикробную активность определяют в пробирках методом двукратных серийных разведений в жидких питательных средах. Для культивирования грибов и дрожжей используют бульон Сабуро (рН 6,8) с добавлением 2% глюкозы и 2% мальтозы, для культивирования бактерин - бульон Хоттингера (120 мг% аминного азота, рН 7,2-7,3). Для приготовления исходных растворов изучаемые соединения предварительно растворяют в 0,5 мл диметилсульфоксида (ДМСО) с последующим разведением в соответствующих питательных средах. Двукратные разведения веществ готовят в интервале испытуемых концентраций от 250 до 0,007 мкг/мл.

Пpотивогрибковую активность определяют в отношении 18 клинических штаммов грибов-дерматофитов (Microsporum, Trichophytum spp) и дрожжей рода Candida, выделенных от больных. Исследуемые штаммы грибов и дрожжей получают из лаборатории микрологии Центрального кожно-венерологического института.

Антибактериальную активность определяют в отношении следующих референс-штаммов:
Staphylococcus aureus АТСС 25923
Streptococcus pyogenes " 12354
Bacillus subtilis " 6633
Escherichia coli АТСС 25922
Proteus vulgatus " 4636
Для приготовления ионокулятов микроорганизмов используют двухнедельные культуры грибов и суточные бульонные культуры дрожжей и бактерий. Конечные инокуляты для грибов и дрожжей составляют 3-4˙10⁶КОЕ/мл, для бактерий - 1-2˙10⁵ КОЕ/мл.

Учет результатов противогрибковой активности в отношении дрожжей проводят через 24 ч, дерматофитов - через 6 сут инкубирования при 25-28^оС. Антибактериальную активность учитывают через 18-20 ч инкубирования при 35-37^оС. Активность соединений выражают в минимальных подавляющих концентрациях (МПК) в мкг/мл. МПК определяют визуально по последней пробирке, в которой отсутствует видимый рост испытуемых микроорганизмов.

Контролем служат пробирки с питательными средами без соединений, в которые добавляют по 0,5% ДМСО и инокуляты соответствующих штаммов микроорганизмов. Условия инкубации контрольных пробирок были аналогичны основному опыту.

Сравнительное изучение противомикробной активности соединений I проводят с 4,4,4-трихлор-1-(4-бромфенил)-бут-2-ен-1-о-ном (II) аналогичными методами в параллельных опытах.

Результаты сравнительного изучения противомикробной активности соединений (1а, 1б) и их структурного аналога (II) представлены в табл. 1 и 2.

Для статистической обработки данных, представленных в табл. 1, а также для оценки активности заявляемых соединений в отношении всей популяции грибов и дрожжей, были рассчитаны среднегеометрическая МПК (МПК) и концентрация, подавляющая 90% штаммов популяции (МПК₉₀).

Как видно из данных, приведенных в табл. 1, соединения I обладают высокой противогрибковой активностью против всех испытанных штаммов грибов-дерматофитов рода микроспорум (МПК от 0,5 до 3,9 мкг/мл), трихофитон (МПК от 0,5 до 3,9 мкг/мл), дрожжей (МПК от 0,5 до 3,9), превосходящей активность структурного аналога.

Как видно из результатов, представленных в табл. 2, заявляемые соединения значительно превосходят по антибактериальной активности соединение сравнения в отношении стафилококков, стрептококков и бацилл.

Изучение активности заявляемых соединений в отношении облигатных анаэробных бактерий. Изучение активности соединений формулы I в отношении облигатных анаэробных бактерий проводят методом двукратных серийных разведений в жидкой питательной среде для культивирования анаэробов (ЖСД) на основе мясопептонного бульона (аминный азот - 120 мг % ) с добавлением экстракта кормовых дрожжей, Л-цистеина, глюкозы и резазурина. Непосредственно, перед использованием среду регенерируют на водяной бане, после чего добавляют гемин и витамин К в форме менадиона.

Для определения активности заявляемых соединений в качестве тест-объектов используют клинические штаммы грамотрицательных и грамположительных облигатных неспорообразующих анаэробных бактерий Bacteroides melaninogenicus, Fusolacterium varium, Peptococcus micros.

Посевы культивируют в указанной среде ЖСА в атмосфере трехкомпонентной газовой смеси (азот 80% , водород 10% и углекислый газ 10% ) в микроанаэростате МИ-752 при 37^оС в течение 48 ч, МПК соединений определяют указанным выше методом. Конечный инокулят составляет 5˙10⁶КОЕ/мл.

Результаты представлены в табл. 3.

Таким образом, заявляемые соединения обладают значительно более высокой (4-70 раз) активностью в отношении как грамположительных, так и грамотрицательных анаэробных бактерий, по сравнению со структурным аналогом.

Изучение оксидантной активности. Антиоксидантная активность соединений формулы I изучают методом люминолзависимой хемилюминесценции нейтрофилов на хемилюминометре ХМЛ 1Ц-01. Для этого оценивают спонтанную люминолзависимую хемилюминесценцию, а также ХЛ нейтрофилов, активированных тест-штаммов Staphylococcus aureus N 9198.

Нейтрофилы человека получают из периферической крови доноров в прерывистых градиентах плотности фиколлгипака. Конечная концентрация клеток составляет 10⁶ кл/мл.

Изучаемые соединения растворяют в диметилсульфоксиде (ДМСО) и готовят десятикратные разведения в реакционной смеси: 100, 10 и 1,0 мкг/мл. Указанная смесь содержит 0,2 мл клеток, 0,04 мм микробной взвеси в концентрации 10⁹ КОЕ/мл (из расчета 200 микробных клеток на 1 нейтрофил). Бактерии и нейтрофилы суспендируют в растворе Хэнкса без индикаторов. После 30 мин инкубации смеси при 37^оС в нее добавляют 1,6 мл среды, содержащей люминол. Оценку антиоксидантной активности проводят по максимальному и среднему (плато) количеству импульсов в 1 с и по времени наступления эффекта (мин). Результаты изучения оксидантной активности представлены в табл. 5.

Спонтанный уровень ХЛ составил 3200±500 имп/с. Добавление растворителя (ДМСО) незначительно подавляет активность нейтрофилов: с 3200 имп/с с выходом через 6,7 мин на плато - 1100±150 имп/с. Уровень ХЛ активированных нейтрофилов составляет в среднем 25550±1500 имп/с.

Как видно из табл. 4, соединения обладают выраженным гасящим эффектом.

Изучение острой оральной токсичности заявляемых соединений. Острую токсичность (ЛД₅₀) соединений I изучают на нелинейных половозрелых белых мышах-самцах массой 18-20 г.

Соединения растворяют в 4-6 каплях твин-80 и дистиллированной воде. Растворы вводят животным внутрь однократно в объеме 0,5 мл в диапазоне доз от 500 до 2000 мг/кг. Смертность животных регистрируют в течение 5 последующих суток.

Статистическую обработку результатов и расчет показателей ЛД₅₀проводят методом пробит-анализа по Литчфилд-Уилкоксону (табл. 5).

Установлено, что соединения хорошо переносятся животными в дозах от 1948,2 до 436,1 мг/кг при р = 0,05.

Как видно из данных таблицы, заявляемые соединения обладают высоким ЛД₅₀, что позволяет отнести их к классу мало- (Ia)и умеренно- (Iб) токсичных веществ при введении в желудок.

Таким образом, соединения формулы I проявляют более высокую противомикробную активность и обладают низкой токсичностью. (56) Общий практикум по органической химии. - Мир, М. : 1965, с. 505, 393.

Патент ФРГ N 869487, кл. 12^о 19^о3, 1954.

Использование: в медицине как проявляющее противомикробную активность в качестве полупродукта для получения 2-производных 1,1,1-трихлор-4-(2,4-дихлорфенил)-бутан-4-она. Сущность изобретения: продукт: 2-производные 1,1,1-трихлор-4-(2,4-дихлорфенил)-бутан-4-она CCl₂-CH(X)-CH₂-C(O)-C₆H₃-Cl₂-2,4 , где X=OC(O)CH₃, T_пл 79 - 80 С, БФ C₁₂H₉Cl₅O₃ , X=Cl T_пл 92 - 93С, БФ C₁₀H₆Cl₆O 1,1,1-трихлор-2-окси-4(2,4-дихлорфенил)-бутан-4-он БФ C₁₀H₇Cl₅O₂ , выход 61% . T_пл 85 - 86С. Реагент 1: 2,4-дихлорацетофенон. Реагент 2: хлораль. Условия реакции: кипятят 40 ч в присутствии ацетата натрия с последующим выделением продукта и добавлением к нему хлористого натрия и концентрированной серной кислоты или хлористого ацетила. 5 табл.

2-ПРОИЗВОДНЫЕ 1,1,1-ТРИХЛОР-4-(2,4-ДИХЛОРФЕНИЛ)-БУТАН-4-ОНА, ПРОЯВЛЯЮЩИЕ ПРОТИВОМИКРОБНУЮ АКТИВНОСТЬ, И 1,1,1-ТРИХЛОР-2-ОКСИ-4-(2,4-ДИХЛОРФЕНИЛ)-БУТАН-4-ОН В КАЧЕСТВЕ ПОЛУПРОДУКТА ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ 2-ПРОИЗВОДНЫХ 1,1,1-ТРИХЛОР-2-ОКСИ-4-(2,4-ДИХЛОРФЕНИЛ)-БУТАН-4-ОНА
1. 2 - Пpоизводные 1,1,1-тpихлоp-4-(2,4-дихлоpфенил)-бутан-4-она фоpмулы 1
CCl₃--CH₂-Cl
где X - OC(O)CH₃, Cl,
пpоявляющие пpотивомикpобную активность.

2. 1,1,1-Тpихлоp-2-окси-4-(2,4-дихлоpфенил)-бутан-4-он фоpмулы

в качестве полупpодукта для получения 2-пpоизводных 1,1,1-тpихлоp-4-(2,4-дихлоpфенил)-бутан-4-она.