Способ получения науплиусов артемии в эмбриональной оболочке Советский патент 1992 года по МПК A01K61/00 

Изобретение относится к биотехнологии, преимущественно рыбного хозяйства, и может быть использовано для получения науплиусов в эмбриональной оболочке, с максимальным содержанием питательных веществ, в качестве корма для молоди ценных пород рыб

Интерес к жаброногим рачкам Artemia sp. вызван тем, что науплиусы. вышедшие из цист, являются прекрасным стартовым кормом для молоди ценных пород рыб. Кроме того, из науплиусов можно получать биологически активные соединения, необходимые для фармакологии и пищевой промышленности. Науплиусы в момент вы- лупления содержат 25% жирных кислот от общего веса. Однако ценность науплиусов в качестве стартового корма значительно уменьшается после их выхода из эмбриональной оболочки. Обусловлено это тем, что первые два дня после вылупления свободно плавающие науплии не нуждаются в пище.

обходясь собственными запасами. Это приводит к снижению содержания жирношс- лотного состава рачков до 10-15% от общей ма ссы тела Вышеуказанную проблему можно было бы избежать, если бы инкубируемая партия цист артемии вылупляясь одновременно Однако, известные в настоящее время способы стимуляции (температура. забуференность среды инкубации, аэрация, обязательное присутствие в среде раствора хлорида натрия в диапазоне 3-10%) вы- клева науплиусов из цист артемии не дают возможность получения рачков как с максимальным с содержанием запасенных питательных веществ, так и 100% выхода науплиусов. Максимальный выход составляет: 60-70% на 24 ч инкубации и 80-95% на 48 ч. Это происходит в результате неодновременности созревания эмбрионов и вы- клева науплиусов из цист инкубируемой партии. Даже при соблюдении перечисленных условий стимуляции выклева науплиу

сое из цист продолжается 6-7 ч при 24-часовой инкубации, а при 48-часовой - ЗОК31 ч, Это соответственно приводит к снижению пищевой ценности науплиусов.

Известен способ получения науплиусов путем химической декапсуляции цист арте- мии раствором гипохлорита натрия. Околоплодная стенка цист (хорион) разжижается посредством замачивания сухих цист в растворе гипохлорита натрия (0,8% гипохло- рит. 0,32 М NaOH, 48 мМ ) в течение 1,5 ч при 23°С и слабом перемешивании. Когда шероховатая часть стенок цист удаляется (оценивается по степени окрашивания раствора (среды инкубации) в оранжевый цвет), цисты промывают 10+12 раз водой, с последующей одноразовой промывкой цист в растворе 25 мМ HCI и 0,2 Nad. В дальнейшем цисты помещают на ночь в 2,0%-ный раствор NaCI при 4°С. После этого, повторно промывают цисты дистиллированной НаО и собирают с помощью фильтра. Собранные цисты помещают в раствор сахарозы (0,25 М). содержащий твин 80 (0,1%), и разрывают капсулу цист посредством перемешивания среды с помощью магнитной мешалки при о°С в течение 20,5+3,0 ч (при соотношении цист к объему : 10 г + 100 мл).

Таким образом, для получения науплиусов путем химической декапсуляции цист артемии необходима обязательная последовательность технических приемов: 1) приготовление раствора гипохлорита натрия, внесение в нее цист и инкубация при постоянной температуре; 2) определение времени удаления шероховатой поверхности стенок цист, проводимое по степени окрашивания среды инкубации; 3) промывка (до 10-12 раз) водой цист от раствора гипохлорита натрия; 4) приготовление раствора 25 мМ HCI, 0,2%-го NaCI и разовая промывка ею цист артемии; 5) инкубация цист в 2%- ном растворе NaCI при 4°С в течение 16-17 ч; 6) промывка дистиллированной НаО и сбор цист с использованием фильтра; 7) приготовление раствора сахарозы (0,25 М), содержащий твин 80(0,1 %), внесение в него цист артемии с последующим перемешиванием, используя при этом магнитную мешалку при 0°С, которая приводит к разрыву капсулы и выходу науплиусов в эмбриональной оболочке (длительность перемешивания зависит от соотношения веса цист к объему)

Однако известный способ получения науплиусов в эмбриональной оболочке из цист артемии не лишен недостатков. Во- первых, гипохлорит натрия - сильный бкси- дант и взаимодействует с липидами и белками, разрушая их. Время реакции гипр

хлорита натрия (концентрированного) составляет примерно 8 мин. Нетрудно оценить время взаимодействия гипохлорита натрия непосредственно с эмбрионом, лишенным хориона. К тому же, время взаимодействия раствора гипохлорита натрия с поверхностью цист оценивается визуально по степени окрашивания в оранжевый цвет среды инкубации и зависит от соотношения

0 количества цист к объему жидкости. Во-вторых, даже после стимуляции выклева, выход науплиусов из цист растягивается от 6-7 ч до 30-31 ч, т.е. остается неоднозначность развития эмбрионов артемии от времени

5 инкубации. В связи с этим декапсуляция гипохлоритом натрия цист артемии приводит к получению неоднородных по степени созревания декапсулированных науплиусов и соответственно по содержанию в них ко0 личества и качества питательных веществ.

Целью изобретения является упрощение способа получения науплиусов в эмбриональной оболочке из цист артемии.

Поставленная цель достигается тем, что

5 согласно известному способу декапсуляции цист артемии, включающему операции приготовления декапсулирующего раствора, его внесение для проведения декапсуляции цист, оценки времени реакции раствора ги0 похлорита натрия с поверхностью цист; промывку водой цист от раствора гипохлорита натрия; приготовление раствора, содержащего 0.2% NaCI. 25 мМ НС и промывка им цист артемии; промывка цист

5 дистиллированной НаО и сбор их с использованием фильтра; приготовление раствора сахарозы (0,25 М) с твином 80 (0,1 %) и инкубация в нем цист с использованием магнитной мешалки для перемешивания при 0°С,

0 для разрыва капсулы исключают.

Для достижения поставленной цели цисты артемии инкубируют в забуференном растворе хлорида натрия, приготовленном на дистиллированной НгО при20-22°С. с добав5 лением в среду для стимуляции процесса эмбриогенеза раствор ферроцианида калия (10 М). Инкубирование цист артемии в забуференном растворе хлорида натрия с добавлением в среду ферроцианида калия

0 стимулирует эмбриональное развитие, вы- клев и отделение от капсулы полностью сформировавшихся науплиусов в эмбриональной оболочке и, с последующей, до четырех часов задержкой появления свободно

5 плавающих науплиев.

Использование для стимуляции эмбриогенеза - продувка среды воздухом не дает требуемого эффекта - получения науплиусов в эмбриональной оболочке. Это связано, во-первых, с максимальной активацией

обменных процессов в эмбрионе, что приводит к минимальному по времени наличия стадии науплиусов в эмбрионалной оболочке. Во-вторых, постоянное перемешивание среды инкубации за счет продувки воздухом приводит к механическому разрыву эмбриональной оболочки, что в свою очередь не дает возможность фиксировать наличие фазы (стадии) - науплиусов в эмбриональной оболочке.

Пример. Замачивание и инкубирование цист в солевом (NaC - 5%) забуферен- ном (рН 8.0) растворе проводилось по общепринятой методике, в соотношении навески цист к объему среды - 1 мг:2 мл, соответственно.

Объектом исследования были цисты Anemia sp.

Пример 1. Выход свободно плавающих науплиев и или полностью сформировавшихся науплиев в эмбриональной оболочке, инкубируемых в растворе хлористого натрия, приготовленного на водопроводной и дистиллированной НгО в зависимости от температуры и времени инкубации представлены в табл. 1.

а)Среда инкубации приготовлена на водопроводной НгО. Как видно из данных. представленных в табл. 1. при инкубации.в солевом растворе,приготовленном на водопроводной Н20, выклевывались только свободно плавающие науплии и не отмечалось выклева науплиусов в эмбриональной оболочке. Процент выхода науплиусов зависит от температуры. Максимальный выход науплиусов данной популяции от температуры 22°С и выше.

б)Среда инкубации приготовлена на дистиллированной НгО. Как видно из табл. 1, при инкубации в солевом растворе на дистиллированной Н20 происходит выход науплиев в эмбриональной оболочке из капсулы. Оптимальный диапазон температуры находится в пределах 20-22°С. Ниже 20° уменьшается процент выхода науплиев в эмбриональной оболочке, выше 22°С параллельно с выходом науплиев в эмбриональной оболочке, появляются свободно плавающие науплии.

Пример 2. Стимуляция развития эмбриогенеза добавлением в среду инкубации раствора ферроцианида калия представлена в табл. 2 и 3.

0 В примере 1 определен оптимальный температурный режим выхода свободно плавающих науплиусов и науплиусов в эмбриональной оболочке (t 20 - 22°С). Поэтому, в данном пункте мы приводим примеры

5 по стимуляции эмбриогенеза при оптимальной температуре 22°С.

а)Среда инкубации приготовлена на водопроводной НгО. Как видно из табл. цент выхода свободно плавающих 0 науплиусов увеличивается в среде с ферроци- анидом калия от 5 да 15%. Максимальный эффект стимуляции выклева науплиусов достигается при концентрации K4Fe(CN)5 10 М.

б)Среда инкубации приготовлена на ди- 5 стиллированной НгО. Как видно из табл. 3

процент выхода науплиев в эмбриональной оболочке также увеличивается в среде, содержащей ферроцианид калия от 5 до 18%. Максимальный эффект стимуляции эмбрио0 генеза достигается при концентрации (CN)e. равной Ю 4 М.

Формула изобретения Способ получения науплиусов артемии в эмбриональной оболочке, предусматрива5 ющий инкубацию цист артемии в забуфе- ренном растворе хлорида натрия и последующее изъятие науплиусов, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, в качестве растворителя хлорида на0 трия используют дистиллированную воду, дополнительно в раствор вводят ферроцианид калия до концентрации М, а инкубацию цист проводят при в течение 24-48 ч.

Таблица 1

Продолжение табл.1

Использование: получение науплиусов артемии в эмбриональной оболочке в качестве живого корма для молоди рыб при искусственном выращивании. Сущность изобретения: инкубацию цист артемии проводят в забуференном растворе хлорида натрия на дистиллированной воде с добавлением в него ферроцианида калия до концентрации 10 М. 3 табл.

с.п.н. - свободно плавагющие науплиусы н.вэ.о,- науплиусы в эмбриональной оболочке

Таблица2

ТаблицаЗ