СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ НАРУШЕННОГО СПЕРМАТОГЕНЕЗА И СИНТЕЗА ТЕСТОСТЕРОНА С ПОМОЩЬЮ ТРАНСПЛАНТАЦИИ НЕОНАТАЛЬНОЙ ТЕСТИКУЛЯРНОЙ ТКАНИ Российский патент 2018 года по МПК A61M37/00 A61K35/48 A61P15/08 

Изобретение относится к медицине, а именно к урологии и андрологии, и направлено на повышение эффективности лечения половых расстройств с помощью клеточной и тканевой терапии.

Проблема сохранения мужского здоровья, в частности, половой функции, приобретает все большее значение в связи с изменением образа жизни населения и ухудшения экологической ситуации. Возрастает частота развития эректильной дисфункции и мужского бесплодия. Наиболее часто это состояние связано с развитием андрогенного дефицита (снижением концентрации тестостерона и дигидротестостерона в крови) вследствие возрастных, профессиональных или медицинских причин (Ferrini М.G., Gonzalez-Cadavid N.F., Rajfer J. Aging related erectile dysfunction-potential mechanism to halt or delay its onset. Transl. Androl. Urol. 2017 Feb; 6(1): 20-27. doi: 10.2103/tau.2016.11.18).Процент бесплодных супружеских пар, в которых причиной бесплодия является нарушения сперматогенеза, достигает 15-20% (Punab М., Poolamets О., Paju P., Vihljajev V., Pomm К., Ladva R., Korrovits P., Laan M. Causes of male infertility: a 9-year prospective monocentre study on 1737 patients with reduced total spermcounts. Hum. Reprod. 2017. Jan; 32 (1): 18-31. Тюзиков И.А. Метаболический синдром и мужское бесплодие (обзор литературы). Андрология и генитальная хирургия. 2013; 2: 5-10). Причины ухудшения сперматогенеза могут быть различными - генетические нарушения, крипторхизм, перенесенные инфекционные заболевания, токсические воздействия, радиация, химиотерапия и др., но в конечном итоге они сводятся к 2 патологическим изменениям: блокированию созревания сперматозоидов на разных уровнях и нарушение синтеза тестостерона с развитием андрогенной недостаточности.

Наиболее распространенным способом лечения эректильной дисфункции и нарушений сперматогенеза является гормональная терапия с использованием различных препаратов тестостерона разной длительности действия (Davidiuk A.J., Broderick G.A. Adult-onset hypogonadism: evaluation and role of testosterone replacement therapy. Transl. Androl. Urol. 2016 Dec; 5 (6): 824-833. doi: 10.21037/tau.2016.09.02. Shoskes J.J., Wilson M.K., Spinner M.L. Pharmacology of testosterone replacement therapy preparations. Transl. Androl. Urol. 2016. Dec; 5 (6): 834-843. doi: 10.21037/tau.2016.07.10.). Однако, при длительном применении эффективность этой терапии снижается и часто развиваются побочные эффекты в виде метаболических нарушений и аллергических реакций, что заставляет отменять эту терапию (Sperling Н. Side effects of erectile dysfunction drug treatment. Urologe A. 2017. Mar 1. doi: 10.1007/s00120-017-0341-4).

Развитие клеточных технологий с использованием трансплантации стволовых клеток открывает новые возможности в лечении этих состояний.

Известен способ лечения андрогенной недостаточности путем трансплантации в яичко аллогенных тестостерон-продуцирующих клеток Лейдига (Кирпатовский И.Д., Дендеберов Е.С. Аллотрансплантация культуральных неонатальных андрогенпродуцирующих клеток Лейдига. Вестник Российской академии медицинских наук 1994; 4: 42-46).

Также известны способ стимуляции нарушенного сперматогенеза и коррекции андрогенной недостаточности с помощью интратестикулярной трансплантации стволовых клеток костного мозга (Lue Y., Erkkila К., Liu P.Y., Ma K., Wang С., Hikim A. S., Swerdloff R.S. Fate of bone marrow stem cells transplanted into the testis: potential implication for men with testicular failure. Am. J. Pathol. 2007 Mar; 170 (3): 899-908) или мезенхимными клетками жировой ткани (Камалов А.А., Сухих Г.Т., Зарайский Е.И., Кирпатовский В.И., Охоботов Д.А., Полтавцева Р.А., Каменская К.А., Макаров Е.А. Изменение популяции клеток Лейдига на фоне различный вариантов экспериментальной терапии обогащенными клеточными культурами. Естественные и технические науки. 2010. №4. С. 95-99).

Недостатками этих способов являются сложность выделения стволовых клеток из биологического материала, ограниченное количество выделенной клеточной массы и необходимость длительного культивирования для размножения стволовых клеток в достаточном количестве. Процедура получения стволовых клеток, сохранение их жизнеспособности, культивирование в питательных средах для получения достаточно большого количества клеточной массы являются сложными дорогостоящими процедурами, требующими специального сложного оборудования и высокой квалификации специалистов, занимающихся в области клеточных технологий. Кроме того, количество жизнеспособных клеток и их пролиферативный потенциал после пересадки достаточно быстро снижается, что может быть связано с изменением их микроокружения (так называемой «ниши»), и это может уменьшать эффективность клеточной терапии в отдаленном периоде.

Наиболее близким аналогом к заявляемому способу (прототип) является способ стимуляции сперматогенеза и синтеза тестостерона с помощью инъекции в поврежденное яичко культивированных клеток яичка плодов человека (Камалов А.А., Сухих Г.Т., Кирпатовский В.И., Зарайский Е.И., Полтавцева Р.А., Плотников Е.Ю., Кудрявцев Ю.В., Ефремов Е.А., Охоботов Д.А. Особенности регенерации тестикулярной ткани и восстановление фертильности у крыс на фоне ксенотрансплантации обогащенных стволовых и прогениторных клеточных культур при двухстороннем абдоминальном крипторхизме // Урология. 2008. №6. С. 4-7.). Введение в яичко с нарушенным сперматогенезом (экспериментальная модель абдоминального крипторхизма) культуры клеток яичка плодов или стволовых клеток костного мозга человека приводило к регенерации сперматогенного эпителия и улучшению фертильности самцов. Недостатками этого способа являются сложность получения клеточного материала, его небольшое количество, что требует длительного культивирования для получения клеточной массы, необходимость использования дорогостоящих реактивов и оборудования. Кроме того, необходимый лечебный эффект развивается медленно - в пределах 3 и более месяцев. Существенным недостатком метода также является маловыраженное влияние пересаженных стволовых клеток на восстановление сниженного синтеза тестостерона клетками Лейдига.

Целью данного изобретения является повышение эффективности коррекции нарушения сперматогенеза и андрогенной недостаточности.

Поставленная цель достигается использованием свежеудаленной или криоконсервированной ткани неонатального яичка плода или новорожденного, содержащей большое количество стволовых клеток, и ее пересадкой в поврежденное яичко или под капсулу почки, что позволяет сохранить все положительные эффекты клеточной терапии при минимизации негативных эффектов изоляции стволовых клеток от их микроокружения и материальных затрат, а также ускорить наступление стимулирующего эффекта. Высокий регенераторный потенциал клеток пересаженной ткани способствует ее приживлению и размножению клеток, что приводит к прогрессивному увеличению массы трансплантата, числа семенных канальцев, и новообразованных клеток Лейдига. Этому же способствует сохранение микроокружения («ниши») стволовых клеток. В итоге формируется новая анатомическая структура, гистологически идентичная ткани яичка. При этом выделяемые клетками трансплантата факторы пролиферации способствуют восстановлению популяции сперматогенного эпителия и клеток Лейдига и их способности синтезировать тестостерон, что восстанавливает андрогенный статус и также стимулирует сперматогенез. Терапевтический эффект не только сохраняется длительное время, но и улучшается по мере увеличения массы имплантата. Стойкое приживление обусловлено также чем, что неонатальная ткань пересаживается в иммунологически привилегированные места - под капсулу почки и под белочную оболочку яичка, что значительно снижает вероятность развития отторжения даже при выраженные антигенных различиях трансплантата и организма-хозяина.

Заявляемый способ осуществляется следующим образом.

У плодов в поздних стадиях неонатального развития или новорожденных удаляют яички, измельчают их на фрагменты размером 0,5×0,5 мм и после промывания в физиологическом растворе сразу пересаживают реципиенту или подвергают криоконсервации. При пересадке неконсервированной ткани плодного яичка под капсулу почки выделяют почку из жировой капсулы, делают небольшой надрез соединительнотканной капсулы по наружному краю, с помощью миниатюрного зонда с затупленным концом формируют канал в субкапсулярном пространстве, стараясь не повредить паренхиму почки, и в этот канал помещают фрагмент неонатального яичка. После этого на разрез капсулы накладывают один шов атравматической рассасывающейся нитью.

При пересадке неконсервированной ткани неонатального яичка под белочную оболочку яичка вскрывают мошонку, выводят яичко в рану, делают небольшой надрез белочкой оболочки в бессосудистой зоне, через него с помощью миниатюрного зонда формируют канал, в который имплантируют фрагмент неонатального яичка. На разрез белочной оболочки накладывают один шов атравматической рассасывающейся нитью.

Для криоконсервации фрагментированная ткань неонатального яичка помещается в криозащитный раствор комнатной температуры следующего состава (в ммоль\л): натрий - 9,3, калий - 115, магний - 4,7, хлор - 15, фосфаты - 57,6, сульфаты - 4,7, бикарбонат - 9,3, сахароза - 300. После 5-минутнеой инкубации в раствор добавляется криопротектор диметилсульфоксид (ДМСО) сначала до концентрации 5%, через 10 минут до 10% и еще через 10 минут до 15%. После 10-минутной инкубации фрагменты ткани неонатального яичка помещают в сухую пластиковую пробирку и переносят в морозильную камеру с температурой -90°C, где они хранятся до трансплантации. Перед пересадкой пробирки с тканью извлекают их морозильной камеры, помещают в водяную баню при +37°C и после полного оттаивания (примерно через 1 минуту) переносят в раствор, аналогичный криозашитному, но с концентрацией ДМСО 10%. Через 10 минут инкубации ткань переносят в раствор с концентрацией ДМСО 5%, а еще через 10 минут - в раствор без ДМСО. Спустя еще 10 минут ткань подготовлена к пересадке, которую осуществляют по методике, описанной выше.

Эффективность заявляемого способа подтверждается следующими примерами.

Пример 1. Доказательство приживления пересаженной ткани неонатального яичка во взрослом организме.

Пяти взрослым половозрелым крысам самцам произвели пересадку свежеудаленной ткани неонатального яичка, полученной от новорожденных крысят через 1-2 дня после рождения под капсулу почки по описанной методике. При обследовании оперированных животных через 1, 3, и 6 месяцев во всех случаях обнаружили, что под почечной капсулой выявлялась новообразованная ткань, которая при гистологическом исследовании оказалась идентичной ткани яичка. С увеличением сроков наблюдения масса имплантата возрастала (Фиг. 1А. Б), при этом гистологическое исследование показало, что незрелая тестикулярная ткань, выявляемая через 1 месяц после пересадки трансформируется в нормальную ткань яичка взрослого организма с признаками завершенного сперматогенеза в семенных канальцах. (Фиг. 2А. Б).

Еще 5 крысам произвели аналогичную трансплантацию неонатальной тестикулярной ткани от новорожденных крысят под белочную оболочку яичка взрослых самцов. При наблюдении через 1, 3 и 6 месяцев, как и в предыдущих опытах, выявляли новообразованную тестикулярную ткань, расположенную под белочной оболочкой (Фиг. 3).

Этот пример подтверждает стойкое приживление пересаженной ткани аллогенного неонатального яичка во взрослом организме, как под капсулой почки, так и под белочной оболочкой яичка.

Пример 2. Доказательство способности пересаженной ткани неонатального яичка синтезировать тестостерон при пересадке под капсулу почки.

Произвели пересадку ткани неонатального яичка от новорожденных крысят по вышеописанной методике под капсулу почки 5 ранее кастрированным крысам-самцам, а 5 кастрированных самцов служили контролем (трансплантации не проводили). Динамическое определение концентрации тестостерона в крови кастрированных крыс значительно снижалось с 2,39±0,12 нг/мл до 0,61±0,04нг/мл и сниженные значения сохранялись на этом уровне с небольшими колебаниями весь срок наблюдения (до 6 месяцев). В опытах с трансплантацией ткани неонатальных яичек через 1 месяц уровень тестостерона возрастал до 0,73±0,02нг/мл, через 3 месяца - до 1,08±0,09 нг/мл, а через 6 месяцев до 1,72±0,14 нг/мл.

Таким образом, пересаженная ткань неонатального яичка способна не только приживать во взрослом организме, но и синтезировать тестостерон, что позволяет компенсировать андрогенный дефицит взрослого организма.

Пример 3. Доказательство способности пересаженной ткани неонатального яичка восстанавливать нарушенный сперматогенез и синтез тестостерона при ее пересадке под белочную оболочку поврежденного яичка.

У 12 крыс вызывали нарушение сперматогенеза и синтеза тестостерона путем перемещения на 3 недели яичек в брюшную полость с последующим их низведением обратно в мошонку (модель абдоминальной формы крипторхизма). В контрольной серии (5 крыс) никаких терапевтических воздействий не проводили. В опытной серии (7 крыс) перед низведением крипторхированных яичек в мошонку производили имплантацию ткани неонатальных яичек под их белочную оболочку.

При исследовании состояния сперматогенеза у контрольных крыс выявили его выраженное нарушение с блоком созревания половых клеток на уровне сперматогоний и сперматоцитов 1-го порядка. В отдельных канальцах выявлялись только клетки Сертолли (Фиг. 4А). При наблюдении до 6 месяцев отмечалось незначительное улучшение состояния сперматогенного эпителия. В опытной серии уже через 1 месяц отмечалась существенная стимуляция сперматогенеза вплоть до появления канальцев с полностью завершенным сперматогенезом (до стадии сперматозоидов) (Фиг. 4Б). С увеличением сроков наблюдения доля таких канальцев возрастала.

Концентрация тестостерона в крови контрольных крыс оставалась резко сниженной весь срок наблюдения, тогда как в опытной серии уже через 1 месяц выявлялась тенденция к его росту, а через 3 и 6 месяцев его концентрация даже превышала нормальные значения (Фиг. 5).

Данный пример иллюстрирует эффективность трансплантации аллогенной ткани неонатальных яичек под белочную оболочку поврежденного яичка для восстановления нарушенного сперматогенеза и нормализации андрогенного статуса.

Пример 4. Доказательство эффективности пересадки криоконсервированной ткани аллогенного неонатального яичка для компенсации андрогенного дефицита при трансплантации под капсулу почки.

Пяти кастрированным самцам произвели пересадку криоконсервированной ткани аллогенного неонатального яичка под капсулу почки по описанному ранее способу. Пять других кастрированных самцов служили контролем (им пересадку не производили). Определение уровня тестостерона крови выявило стойкое его снижение у контрольных крыс (с 2,39±0,12 нг/мл до 0,61±0,04 нг/мл), тогда как в группе крыс с трансплантацией он через 1 месяц возрос до 0,77±0,02 нг/мл, а через 3 месяца - до 1,51±0,05 нг/мл. Нужно отметить, что эти значения сопоставимы с данными, полученными при пересадке неконсервированной тестикулярной ткани (см. пример №2).

Таким образом, криоконсервированная ткань аллогенных неонатальных яичек также способна приживать во взрослом организме и сохраняет свои функциональные свойства, в частности, способность синтезировать тестостерон, повышая его концентрацию в крови до субнормального уровня, что должно является важным фактором восстановления нарушенного сперматогенеза.

Пример 5. Сравнение эффективности заявляемого способа и способа-прототипа.

У 15 крыс моделировали абдоминальную форму крипторхизма, перемещая на 3 недели оба яичка в брюшную полость. По истечению этого срока яички низводили в мошонку. При этом у 5 крыс никаких манипуляций не производили (1-я группа, контроль), 5 крысам в яичко пункционно вводили взвесь культивированных клеток яичек плодов человека 16-18 недель гестации (1 млн клеток в 0,1 мл физ. раствора в каждое яичко) (2-я группа, способ-прототип), а еще 5 крысам под белочную оболочку через небольшой разрез помещали ткань яичка, забранного у новорожденных крысят (1-2 дня после рождения) (3-я группа, заявляемый способ). Через 1 месяц определяли массу яичка, концентрацию тестостерона в крови, а также проводили гистологическое исследование яичек, оценивая состояние сперматогенного эпителия и количество Лейдиговских клеток.

Результаты исследования показали, что в контрольной группе (1-я группа, без лечения) в подавляющем большинства канальцев происходило выраженное нарушение сперматогенеза с блокированием созревания половых клеток на уровне сперматогониев и сперматоцитов 1-го порядка и наличием многих канальцев, полностью лишенных сперматогенного эпителия. Лишь в единичных канальцах сохранялся сперматогенез (Фиг. 6А). В 2-й группе (способ-прототип) через 1 месяц отмечалось частичное восстановление сперматогенеза, но лишь до стадии сперматоцитов 2-го порядка (Фиг. 6Б). Во 3-й группе (заявляемый способ) восстановление сперматогенеза было более полным. В многих канальцах наблюдали завершенный сперматогенез с выявлением сперматозоидов в их просвете (Фиг. 6В).

При этом во 3-й группе более значительно восстанавливалась масса яичка. Если без терапии масса яичек после 3-недельного пребывания в брюшной полости и 1 месяца после низведения в мошонку уменьшалась примерно в 2,5 раза, то в опытах с культурой клеток неонатального яичка (2-я группа, прототип) их масса превышала значения, полученные в контрольной серии на 28%, а в опытах с неонатальной тканью яичка (3-я группа, заявляемый способ) - на 78% (таблица). Это свидетельствовала о более выраженной регенерации яичка при использовании заявляемого способа.

Также в 3-й группе в большей степени уменьшалась доля канальцев, лишенных эпителия. Если во 2-й группе она снизилась примерно в 2,5 раза, но все же составляла значительный процент, то при использовании заявляемого способа такие канальцы выявлялись крайне редко, составив лишь 1,5-4,5% от общего количества канальцев в гистологическом препарате (таблица).

Важным преимуществом заявляемого способа является более полноценное восстановление гормон-продуцирующей функции крипторхированных яичек. В контрольных опытах концентрация тестостерона в крови снижалась практически в 2 раза. Во 2-й группе (прототип) уровень гормона возрастал на 69%, тогда как в 3-й группе (заявляемый способ) он возрастал на 115% и полностью нормализовался. Более значительная стимуляция синтеза тестостерона в 3-й группе коррелировала со степенью восстановления популяции клеток Лейдига, продуцирующих тестостерон. В контрольной группе количество клеток Лейдига на 1 семенной каналец снижалась более чем в 10 раз. Во 2-й группе (прототип) популяция этих клеток возросла в 6 раз, а в 3-й группе (заявляемый способ) - в 9 раз, приближаясь к нормальным значениям (таблица).

Таким образом, заявляемый способ обеспечивает более полноценную регенерацию поврежденного яичка, чем традиционная терапия стволовыми клетками, с выраженной стимуляцией сперматогенеза, вплоть до стадии сперматозоидов, и нормализацией уровня тестостерона крови за счет регенерации клеток Лейдига.

Представленные примеры иллюстрируют высокую эффективность заявляемого способа. Трансплантация неонатальной ткани яичка способствует образованию новой тестикулярной ткани, с высокой способностью синтезировать тестостерон и стимулировать нарушенный сперматогенез в поврежденном яичке. Если имеется необходимость только скорректировать андрогенный дефицит, то возможно пересаживать неонатальную ткань под капсулу почки. Иммунопривилегированность этой зоны обеспечивает приживление даже аллогенной ткани без дополнительной иммунодепрессивной терапии, что чрезвычайно важно для ткани яичка, высокочувствительной к возможному токсическому действию фармпрепаратов. Ее приживление обеспечивает восстановление пула клеток Лейдига и синтеза ими тестостерона, что позволяет ликвидировать андрогенный дефицит.

Если имеется необходимость не только стимулировать синтез тестостерона, но и активировать нарушенный сперматогенез, то неонатальную тестикулярную ткань можно пересаживать под белочную оболочку поврежденного яичка. Эта зона также является иммунопривилегированной в связи с наличием гемато-тестикулярного барьера, что обеспечивает приживляемость аллогенной ткани. Пролиферация стволовых клеток в сохраненном микроокружении («нише») ведет к образованию новых семенных канальцев с нормальным сперматогенезом. При этом происходит регенерация сперматогенного эпителия в окружающей ткани поврежденного яичка, а также клеток Лейдига в интерстиции. Все это способствует нормализации сперматогенеза и гормонального фона.

Помимо биологического эффекта, заявляемы способ ведет к выраженному экономическому эффекту, поскольку исключает необходимость выделения и культивирования стволовых клеток, что требует дорогостоящего импортного оборудования и расходных материалов.

Изобретение относится к медицине, а именно к урологии и андрологии, и может быть использовано для стимуляции нарушенного сперматогенеза и усиления синтеза тестостерона при наличии андрогенной недостаточности. Способ заключается в трансплантации ткани неонатального яичка животного. Для этого используют ткань яичек плодов на поздних стадиях развития или новорожденных крысят. После удаления ткани ее измельчают на фрагменты размером 0,5×0,5 мм и промывают в физиологическом растворе. И сразу после этого или после криоконсервирования производят пересадку ткани половозрелым крысам-самцам под капсулу почки под белочную оболочку яичка. Способ обеспечивает стойкое приживление трансплантатов и рост пересаженной ткани, что ведет к повышению концентрации тестостерона в крови и стимуляции сперматогенеза в поврежденном яичке при существенном экономическом эффекте за счет исключения необходимости использования стволовых клеток для этих целей. 2 з.п. ф-лы, 6 ил. 1 табл., 5 пр.

1. Способ стимуляции сперматогенеза и синтеза тестостерона, заключающийся в трансплантации ткани неонатального яичка животного, отличающийся тем, что используют ткань яичек плодов в поздних стадиях развития или новорожденных крысят, измельченную после удаления на фрагменты размером 0,5×0,5 мм и промытую в физиологическом растворе, и производят пересадку половозрелым крысам-самцам сразу после этого или после криоконсервирования.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что трансплантацию производят неонатальной тестикулярной ткани под капсулу почки.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что трансплантацию неонатальной тестикулярной ткани производят под белочную оболочку яичка.