Способ получения сыворотки крови телят для культивирования клеток и вирусов Советский патент 1992 года по МПК C12N5/00 A61K35/16 

Изобретение относится к ветеринарной клеточной биотехнологии, в частности к спо собу культивирования клеток животных и человека ин витро.

В биотехнологии клеток и тканей животных имеют широкое применение сыворотки крови, которые служат одним из компонентов питательных сред тканевых культур. Требования к сывороткам возросли в связи с широким использованием в ветеринарии, медицине, гибридомной биотехнологии, а также проведением исследований по генетической трансформации клеток.

Цель изобретения - повышение пролиферации клеток и увеличение накопления вирусов.

Поставленная цель достигается посредством того, что кровь берут у новорожденного теленка, имеющего массу тела не менее

25 - 27 кг до первой выпойки ему молозива и осуществившего рефлекс стояния на ногах в течение 0,3 - 1,0 ч после рождения, в объеме 15 - 17 мл на 1 кг живой массы.

После обработки пуповины теленка взвешивают, переводят в помещение для взятия крови и фиксируют в правостороннем горизонтальном положении на специальном столе, Кровь берут из яремной вены с помощью стерильной системы в стерильные флаконы емкостью 250 - 1000 мл. Флаконы с кровью оставляют на 3 - 4 ч при 20 - 35°С для формирования сгустка, после чего помещают в холодильную камеру (температура 6±2°С) на 12 - 24 ч, где происходит ретракция сгустка и отстаивание сыворотки. При наличии центрифуги через 1 - 2 ч отстоя флаконы с кровью помещают в центрифужные стаканы и центрифугируют 30 2

43

10

ю

00

45 мин при 1,5 тыс. об/мин (известная методика).

Сыворотка крови новорожденных телят до первой выпойки молозива контролируется по следующим показателям: общий белок 35±15 г/л, содержание у-глобулинов не более 2% от общего количества белка, содержание свободного гемоглобина не более 0,5 г/л.

П р и м е р 1. Родившийся теленок осуществил рефлекс стояния на ногах в течение 45 мин, имея массу 27 мг. От него получают 405 мл крови,.выход сыворотки 50%, т.е. 200 мл сыворотки. Содержание у-глобулинов 1,2%. Сыворотку используют для культивирования:

суспензионного штамма перевиваемой почки свиньи (ППС). при этом эффективность клонирования 50 - 60%, плотность популяции 7 - 8-Ю5 кл/мл среды, время удвоения популяции 27 - 30 ч; контроль - телячья сыворотка, 20 - 35%, 4-5-10 кл/мл, 30 - 35 ч соответственно; при культивировании перевиваемой линии клеток FLK-BLV (почка эмбриона овцы), хронически инфицированной вирусом лейкоза крупного рогатого скота (ВЛ КРС) - индекс пролиферации 5,1 -5,2, время формирования монослоя 34дня, титр выделенного антигена ВЛ КРС 1:20; контроль - телячья сыворотка, 4,5, 4 5дней, 1:2 - 1:10 соответственно; контроль - эмбриональная сыворотка, 5,2, 3-4 дня, 1:20 соответственно; при культивировании стромальных клеток костного мозга в монослое - эффективность клонирования в присутствии предлагаемой сыворотки не отличается от величины эффективности клонирования при использовании эмбриональной сыворотки; культивирование перевиваемой культуры клеток J-96 - сравнительный анализ данных по морфологии, цитохимии и чувствительности к вирусу показал, что культивирование клеток с добавлением предлагаемой сыворотки не изменяет их морфологию, активность щелочной фосфатазы и чувствительность к вирусу Коксаки ВЗ, клетки образуют хороший сплошной монослой и выдерживают без смены среды 7 сут культивирования, как и в контроле (эмбриональная сыворотка). П р и м е р 2. От теленка весом 30 кг

получают 450 мл крови, выход сыворотки 50%, т.е. 225 мл с содержанием у-глобулинов 1.1%.

На этой сыворотке культивируют культуры клеток легкого эмбриона коровы и перевиваемой линии клеток, при заражении которых короновирусом титр вируса составляет на 1,5 - 2,2 Ig выше, чем при заражении аналогичных культур, выращенных на телячьей сыворотке.

Сыворотка крови новорожденных телят до выпойки молозива для культивирования клеток и вирусов по своим биологическим и физико-химическим свойствам аналогична эмбриональной сыворотке, по рост-стимулирующим свойствам превосходит сыворотку крови телят.

Предлагаемый способ получения сыворотки позволяет сохранить жизнь теленка с последующим нормальным развитием.

Сыворотка крови новорожденных телят,

полученная по предлагаемому способу, может быть применена в биотехнологии культивируемых клеток животных и человека, для удовлетворения потребностей ветеринарной, медицинской и биологической науки, а также биопроизводства вирус-вакцин, диагностикумов, других биологических препаратов.

Формула изобретения

Способ получения сыворотки крови телят для культивирования клеток и вирусов, включающий взятие крови, отделение сыворотки, контроль содержания у-глобулинов, отличающийся тем, что, с целью

повышения пролиферации клеток и увеличения накопления вирусов, кровь берут у новорожденного теленка, имеющего массу тела не менее 25 - 27 кг до первой выпойки ему молозива и осуществившего рефлекс

стояния на ногах в течение 0,3 - 1,0 ч после рождения, в объеме 15 - 17 мл на 1 кг живой массы.

Использование: биотехнология и ветеринария. Сущность изобретения: новорожденного теленка взвешивают и фиксируют в правостороннем горизонтальном положении. Кровь берут из яремной вены с помощью стерильной системы до первой выпойки теленку молозива. Масса тела новорожденного, осуществившего рефлекс стояния на ногах в течение 0,3 - 1,0 ч после рождения, составляет не менее 25 - 27 кг. Объем извлекаемой крови не должен превышать 15 - 17 мл на 1 кг живой массы теленка. После формирования сгустка сыворотку отделяют центрифугированием. Содержание -глобулина в сыворотке не превышает 2%. Ё