ВАКЦИНА ПРОТИВ КОРОНАВИРУСНОГО ЭНТЕРИТА ТЕЛЯТ Советский патент 1995 года по МПК A61K39/00 A61K39/215 C12N7/00 

Изобретение относится к биотехнологии, касается вакцины для профилактики коронавирусного энтерита телят.

Коронавирусные энтериты новорожденных телят занимают ведущее место среди вирусных кишечных инфекций молодняка крупного рогатого скота по летальности заболевших животных, достигающей при неосложненной форме 30% а в случаях осложнения бактериальной микрофлорой 90-100%
До настоящего времени не разработаны достаточно эффективные средства профилактики этого заболевания, что во многом связано с трудностью подбора системы культивирования вируса-возбудителя.

Известна вакцина против коронавирусного энтерита (неонатальной диареи), изготовленная на коронавируса телят, аттенуированного в культуре клеток ПЭК. Препарат, включающий вирусную культуральную суспензию, вводят новорожденным телятам перорально в объеме 1-5 см² с содержанием 10²-10^4,3 ТЦД_50/мл.

Однако иммуногенная активность известной вакцины недостаточно высока. Кроме того, получение вирусного материала требует использования дорогостоящих питательных сред сложного состава, а также фетальной сыворотки.

Цель изобретения повышение иммуногенной активности вакцины и упрощение способа ее изготовления.

Вакцина против коронавирусного энтерита телят содержит вирусную культуральную суспензию аттенуированного штамма Coronavirus bovinus ВГНКИ N 8 с биологической активностью 4,5-6,0 lg ТЦД_50/мл и стабилизатор, включающий пептон и лактозу в буферном растворе, рН 7,2-7,4, при следующем соотношении компонентов, (масса/объем):
Суспензия штамма
Coronavirus bovinus
ВГНКИ N 8 с биологи-
ческой активностью
вируса 4,5-6,0 lg ТЦД_50/мл 60,0-70,00 Пептон 6,0-8,0 Лактоза 6,0-8,0
Буферный раствор (рН 7,2-7,4) Остальное
В вакцину добавляют антибиотики: пенициллин 100-200 ед/мл и стрептомицин 100-200 мкл/мл.

Используемый в качестве вакцинного аттенуированный штамм Coronavirus bovirus ВГНКИ N 8 (КП-83) хранится в коллекции вирусов ВГНКИ ветпрепаратов.

П р и м е р 1. Получение вакцины против коронавирусного энтерита телят осуществляют следующим образом. В 7 матрасов объемом 1,5 л со сформировавшимся 5-суточным монослоем субкультуры клеток почки эмбриона коровы (ПЭК) вносят 25 см³ суспензии матровой расплодки штамма Coronavirus bovinus ВГНКИ N 8 (КП-83) с титром вируса 4,5 lg ТЦД_50/мл в разведении 1:5 питательной средой 0,5%-ный гидролизат лактальбумина на растворе Хенкса (ГЛАХ).

После 2-часового контакта вируса с клетками монослоя в матрас до 200 см³ добавляют среду поддержания (ГЛАХ и 1,5% сыворотки крови северных оленей). Культивирование продолжают 5 сут до получения цитопатических изменений более 75% клеток монослоя, а затем культуральную суспензию подвергают замораживанию- оттаиванию. Полученный вируссодержащий материал используют в качестве компонента вакцины. Из семи матрасов получено 1350 мл вируссодержащей суспензии с титром вируса до 4,5 lg ТЦД_50/мл.

Для изготовления 1 л вакцины в 700 см³ вируссодержащей суспензии добавляют 300 см³ подогретой до 28-30^оС защитной среды-стабилизатора, включающего 20%-ные растворы пептона и лактозы в фосфорном буфере, рН 7,2.

Полученная вакцина против корона-вирусного энтерита телят имеет следующий компонентный состав, (масса/объем):
Суспензия штамма
Coronavirus bovinus
ВГНКИ N 8 с биологи-
ческой активностью
вируса 4,5 lg ТЦД_50/мл 70,0 Пептон 6,0 Лактоза 6,0 Буферный раствор Остальное
Смесь компонентов тщательно перемешивают, не допуская вспенивания, расфасовывают во флаконы по 3 см³ и лиофилизируют.

П р и м е р 2. Для приготовления вакцины против коронавирусного энтерита телят четырехсуточную субкультуру почки поросенка (ПП), полученную в 6 роллерных флаконах с использованием в качестве питательной среды 0,5% ГЛАХ с 10% сыворотки крови крупного рогатого скота, трижды промывают раствором Хенкса и однократно 0,25%-ным раствором трипсина, после чего в каждый флакон добавляют по 20 мл культуральной суспензии штамма коронавируса ВГНКИ N 8 с титром вируса 5,5 lg ТЦД_50/мл, разведенной в отношении 1:3 средой поддержания.

Контакт вирус-клетки 2 ч при вращающемся роторе и температуре 36,5^оС. Затем в роллерные флаконы вносят по 120-150 см³ поддерживающей среды и проводят культивирование при вращении флаконов.

Через 96 ч после внесения вируса при наличии 75-80% поражения клеток монослоя флаконы помещают в заморозку при минуc 40^оС на 12 ч и затем после оттаивания объединяют вирусные суспензии из 6 флаконов (800 мл). Титр вируса 6,0 lg ТЦД_50/мл.

Для изготовления 1 л вакцины к 600 см³ вируссодержащей культуральной жидкости добавляют 400 см³ подогретой защитной среды, состоящей из пептона и лактозы в фосфатно-буферном растворе (рН 7,4). После тщательного перемешивания суспензию расфасовывали во флаконы по 6,0 мл и лиофилизировали.

Полученная вакцина имеет следующий компонентный состав,
Суспензия штамма
Coronavirus bovinus
ВГНКИ N 8 с биологи- ческой 6,0 lg ТЦД_50/мл 60,0 Пептон 8,0 Лактоза 8,0
Фосфатно-буферный
раствор (рН 7,4) Остальное
П р и м е р 3. Вакцину против коронавирусного энтерита телят из штамм ВГНКИ N 8 применяют для профилактической иммунизации новорожденных животных в хозяйствах, неблагополучных по коронави- русному энтериту.

Перед употреблением сухую вакцину разводят в 30-50 см³ стерильного физиологического раствора или воды комнатной температуры и применяют путем выпаивания за 30-40 мин до первой выпойки молозива однократно.

Все серии предложенной вакцины против коронавирусного энтерита телят безвредны. При подкожном инокулировании 1,0 см³ вакцины предложенного состава в разведении 1:1 6 морским свинкам 1-1,5-месячного возраста массой 250-300 г все животные остались клинически здоровыми в течение 10 дней после введения вакцины, а место инъекции без видимых патологических изменений.

П р и м е р 4. Опытная серия предложенной вакцины против коронавирусного энтерита телят, включающая,
Вируссодержащую
суспензию штамма
Coronavirus bovinus
КП-83 с биологической
активностью вируса 5,5 lg ТЦД_50/мл 65,0 Пептон 7,0 Лактоза 7,0
Буферный раствор (рН 7,2) Остальное применена в неблагополучном по коронавирусному энтериту хозяйстве, в родильном отделении молочного комплекса которого наблюдались массовые тяжелые формы энтеритов новорожденных телят, приводившие к гибели или вынужденному убою животных. Исследования показали прямую связь между заболеванием новорожденных телят энтеритом и коронавирусным антигеном, обнаруженным в фекалиях больных. Сухую вакцину растворяют в 50 см³ физиологического раствора комнатной температуры и выпаивают теленку, не допуская попадания раствора в бронхи.

Из 63 обработанных вакциной заболело и вынуждено убито 10 телят (15,8%). В контрольной группе из 35 новорожденных телят, не обработанных вакциной, заболело тяжелой формой диареи, пало или вынуждено убито 12 телят (34,3%). Таким образом, сохранность в группе вакцинированных телят составила 84,2% а в группе невакцинированных 65,7%
П р и м е р 5. Проведены испытания вакцины против коронавирусного энтерита телят из штамма ВГНКИ N 8, приготовленной по примеру 1. В неблагополучном по коронавирусному энтериту хозяйстве вакцину в дозе 3 ˙ 10^5,6 ТЦД_50/мл вводят перорально в 50 см³ физиологического раствора за 30-60 мин до выпойки молозива. Обработано 122 теленка. Из них заболело с респираторными синдромами и вынуждено убито 8 телят (6,5%). В этот же период времени из 50 невакцинированных телят энтеритом (с выделением коронавируса с фецес) заболело 42 животных, пало и вынуждено убито 12 (28,5%). Сохранность в опытной группе составила 93,5% в контрольной 71,5%
П р и м е р 6. Вакцину против коронавирусного энтерита телят, приготовленную по примеру 2, используют для иммунизации 50 стельных коров с целью создания колострального иммунитета у будущих телят. Препарат в дозе 3 ˙ 10^5,0 ТЦД_50/мл вводят коровам внутримышечно в область бедра за 40 и 5 дней до отела. В сыворотке крови вакцинированных животных произошло накопление в высоких титрах антикоронавирусных антител, достигших по тесту иммуноферментного анализа 1:1024. В группе телят, родившихся от вакцинированных коров, заболеваемость энтеритом резко снизилась, падежа и выбраковки не было. Среди телят, родившихся от группы невакцинированных коров, заболеваемость составила 88% и три из них погибли.

Предложенная вакцина против коронавирусного энтерита телят обладает высокой иммуногенной активностью. Применение препарата перорально путем выпаивания новорожденным телятам, а также внутримышечно стельным коровам, обеспечивает сохранность 84-94% молодняка. Для изготовления вакцины используются недорогие и доступные питательные среды и культуры клеток.

Изобретение относится к биотехнологии. Целью изобретения является повышение иммуногенности вакцины. Полученная вакцина против коронавирусного энтерита телят содержит, мас.%: Суспензия штамма Coronavirus bovinus ВГНКИ N 8 с биологической активностью вируса 4,5 - 6,0 1g ТЦД_50/мл 60,0 - 70,0; пептон 6,0 - 8,0; лактозы 6,0 - 8,0; буферный раствор, (pH 7,2 - 7,4) остальное. Препарат хранят в лиофильно высушенном состоянии. Перед употреблением разводят и используют в хозяйствах, неблагополучных по коронавирусному энтериту.

ВАКЦИНА ПРОТИВ КОРОНАВИРУСНОГО ЭНТЕРИТА ТЕЛЯТ, содержащая вирусную культуральную суспензию аттенуированного штамма коронавируса крупного рогатого скота, отличающаяся тем, что, с целью повышения иммуногенной активности в качестве аттенуированного штамма коронавируса крупного рогатого скота, вакцина содержит штамм Coronavirus bovinus ВГНКИ N 8 с биологической активностью вируса 4,5 6,0 lg ТЦД _50/мл а также пептон и лактозу в буферном растворе (pH 7,2 7,4) при следующем соотношении компонентов, мас.

Вирусная культуральная суспензия штамма Coronavirus bovinus ВГНКИ N 8 с биологической активностью вируса 4,5 6,0 lg ТЦД _50/мл 60,0-70,0
Пептон 6,0-8,0
Лактоза 6,0-8,0
Буферный раствор (pH 7,2-7,4) Остальное