Изобретение относится к биотехнологии, а именно к гибридомной технологии получения моноклональных антител (МКА), которые могут быть использованы для серологической идентификации холерного энтеротоксина (XT) биотипа эльтор.
Известны способы получения МКА к холерному токсину классического биотипа.
Штаммы гибридных клеток, продуцирующих МКА к XT биотипа эльтор, в литературе не описаны.
Целью изобретения является получение гибридного штамма культивируемых клеток Mus musculus, продуцирующего МКА к холерному энтеротоксину биотипа эльтор.
Штамм получают следующим образом.
Мышей линии Balb/c (массой 16 - 18 г) иммунизируют гомогенным препаратом XT. Для получения XT используют штамм - продуцент XT In vitro Vibrio eltor 1310 серовара Oraea. Лиофилизированный препарат XT растворяют в фосфатно-солевом буфере (рН 7,2). Схема включает б инъекций. Первые 2 инъекции проводят внутрибрюшинно (в/б) с интервалом в 1 мес в дозе 5 мкг по белку. Перед первой иммунизацией раствор XT эмульгируют с полным адъювантом Фрейн- да (ПАВ), последующую иммунизацию проводят нэтивным раствором XT 1310. Затем через 2 недели 2 дня подряд внутривенно (в/в) вводят раствор XT в дозе 5 мкг по белку. Заключительные инъекции раствором XT проводят через неделю два дня подряд в/б по 20 мкг по белку. Иммунизацию завершают за 3 дня до слияния.
Иммунные спленоциты мышей сливают с клетками плазмоцитомы мышей РЗ-Х 63/Ад8.653 в соотношении 2:1. Слияние клеток миеломы с клетками селезенки мышей проводят с помощью 50%-ного раствора полиэтиленгликоля с мол.массой 4000д. В стерильных условиях извлекают селезенку, измельчают ее с помощью гомогенизатора Даунса. Взвесь фильтруют через капроновое ситечко и обрабатывают 0,83%- ным раствором NhUCI, забуференным трис- буфером, для лизирования эритроцитов. Лимфоциты дважды отмывают средой Игла- МЕМ и смешивают с дважды отмытыми клетками миеломы. Смесь клеток отмывают один раз в 50-миллилитровой центрифужной пробирке, супернатант декантируют и к осадку добавляют 1 мл 50%-ного раствора полиэтиленгликоля в течение 1 мин по каплям при 42°С(на водяной бане). После этого в центрифужную пробирку медленно вносится бессывороточная среда RPM1-1640 в объеме до 10 мл, Взвесь клеток инкубируют при 37°С 10 мин, после чего один раз центрифугируют при 800 об/мин 7 мин. Супернатант декантируют и смесь клеток осторожно ресуспендируют в 40 мл ростовой среды (среда RPM1-1640 иди ДМ ЕМ с добавлением 20%-ной сыворотки эмбрионов коров, 5 мМ/мл L-глютамина, 4 г/л глюкозы, 0,1 М пирувата натрия), содержащей компоненты ГАТ (0,0131 мг/мл гипоксантина, 0,000191 мг/мл аминоптерина, 0,00385 мг/ мл тимидина). Суспензию клеток в ГАТ-сре- де разливают по 0,1 мл в 96-луночные плоскодонные планшеты, в лунки которых за сутки внесены в качестве фидерного слоя - перитонеальные макрофаги белых мышей в дозе кл на лунку. Видимые клоны гибридных клеток появляются на 7 - 10-е сутки. Гибридому культивируют 14 дней на
среде ГАТ, затем 7-10 дней на среде ГТ, после переводят на ростовую среду без селективных компонентов. Гибридому дважды клонируют методом предельных
разведений на фидере из мышиных перито- неальных макрофагов. В результате клонирования получают продуктивный штамм гибридных культивируемых клеток мыши, стабильно продуцирующих МКА заданной
0 специфичности.
Штамм обозначают ВСКК (П) 433 Д, он хранится в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР и ха5 рактэризуется следующими признаками. Морфологические признаки, Гибридные клетки ВСКК (П) 433 Д представляют собой крупные округлые клетки с узким ободком базофильной цитоплазмы.
0 Ядра гиперхромные, неправильноовальной формы, крупные, с грубой структурой ядерного хроматина.
Культуральные признаки. Культуральные свойства типичны для
5 перевиваемых клеток мышиных плазмоци- том. Клетки ВСКК(П)433 Д культивируются в виде стационарной суспензии при 37°С в пластиковой или стеклянной посуде при посевной дозе 1,0- 1,5x10 кл./мл в течение 3 0 4 дней до плотности насыщения 8 - 9x105 кл./мл. Клетки пассируют один раз в 3-4 дня той же дозой. Коэффициент рассева 1:4 - 1:5. Культивирование ведут на питательной среде RPM1-1640 или ДМЕМ, содер5 жащей 10 - 15% эмбриональной сыворотки коров, 2 мМЬтлютамина, 8-10 мМ буфера HEPES.
Культивирование штамма в организме экспериментальных животных.
0 Индукцию асцитных опухолей у интакт- ных беспородных белых мышей и инбред- ных мышей линии Balb/c, внутрибрюшинно праймированных за 2 - 3 недели до введения гибридомы ПАФ в объеме 0,5 мл/мышь,
5 осуществляют путем инокулирования 5x10 - 107 гибридных клеток на одно животное в 2 мл среды, Иммунную асцитическую жидкость собирают по мере формирования асцитных опухолей через 10-14 дней в
0 объеме2-бмл,
Кариологиче ские признаки. Модальное число хромосом 87, С-мар- керы родительской миеломной линии РЗ- Х63Ад8.653.
5 Характеристика моноклональных антител.
МКА относится к lgG2. Они выявляют энтеротоксин биотипа эльтор, не вступая во взаимодействие с энтеротоксинами классического биотипа и 026; ЛПС, выделенными из холерных вибрионов классическог и эльтор биотипов, убитыми бактериальными клетками холерных вибрионов Антитела тестируют в твердофазном иммунофермен- тном анализе (ИФА) и реакции преципитации (РП) по Оухтерлонии с XT 1310, по нейтрализации специфического действия XT 1310 в тесте кожной проницаемости по Крейгу и нейтрализации цитотоксического действия XT на овариальные клетки китайского хомячка (СНО). Класс иммуноглобулинов определяют в РП по Оухтерлони или в ИФА с Hibvidoma subisotyping kit, mouse, Calbiochem (США).
Титр МКА в культуральной жидкости 1/265- 1/512 (ИФА); в асцитической жидкости 1/51200 (ИФА), 1/16-1/32 (РП); нейтрализации XT 1310 в пробе по Крейгу 1/2000; нейтрализации XT 1310 на клетках СНО 1/320- 1/640.
Стабильность продукции антител сохраняется на протяжении пассажей в культуре и пассажей на животных в течение 18 мес (срок наблюдения).
Контаминация.
Бактерии и грибы в культуре клеток не обнаруживаются. Заражение микоплазма- ми и вирусами не исследовали
Криоконсервирование.
Клетки штамма ресуспендируют в среде RPM1-1640, содержащей 50% эмбриональной сыворотки коров и 10% глицерина или диметилсульфоксида, Замораживание проводят ступенчато: после запаивания ампул - эквилибрация в течение 2 ч при 4°С, затем 24 ч в парах азота, затем клетки помещают в жидкий азот. Размораживание проводят быстро на водяной бане при 37°С. Жизнеспособность клеток по включению 0,25%- ного трипанового синего составляет 80 - 90%.
Иссследование специфичности МКА. . В качестве антигенных препаратов в тестах in vitro и in vivo используют убитые нагреванием бактериальные юлетки холерных вибрионов, ЛПС и энтеротоксины, выделенные из холерных вибрионов классического и эльтор биотипов и Е coli.
При постановке ИФА в качестве твердой фазы используют плоскодонные 96-лу- ночные ИФА-пластины, позволяющие проводить фотометрический учет реакции. Для определения специфичности МКА ИФА проводят на планшетах, сенсибилизированных гомогенным препаратом XT 1310, XT 569B или энтеротоксином Е.соИ 0,26 (10 - 20 мкг/мл по белку), либо суспензией убитых нагреванием бактерий (V.cholerae 569В. V.eltor 1310 1х108 кл/мл), либо ЛПС (5-10 мкг/мл по массе) в объеме 100 мкл в
0,05 М карбонатно-бикарбонатном буфере (КББ) рН 9,6 Сенсибилизацию проводят в течение 18 ч при 4°С В качестве вторых антител используют кроличьи антитела про- 5 тив иммуноглобулина мыши, меченные пе- роксидазой хрена. Субстратом служит ортофенилендиамин в цитратно-фосфатном буфере (рН 4,7) В качестве позитивного контроля используют иммунную поликло0 нальную антитоксическую мышиную сыворотку, в качестве негативного контроля - миеломный супернатант или асцитическую жидкость, индуцированную клетками мие- ломы.
5РП по Оухтерлони проводят в микромодификации с использованием 0,8 - 1 %-ного агара (Difco) или сахарозы (Serva), приготовленных на фосфатном буферном растворе (рН 7,4). В слое геля вырезают лунки
0 на расстоянии 5 мм друг от друга, в центральную лунку вносят МКА, а в периферические - гомо- и гетероантигены в объеме 0.03 мл (нагрузка энтеротоксинов составляет 25 - 30 мкг по белку на 1 лунку; цельных
5 убитых клеток 2 - 3x10 м.к. на 1 лунку). Контролями служат: позитивным - антитоксическая холерная сыворотка; негативными - миеломная асцитическая жидкость, разводящая жидкость.
0Биологическую активность и специфичность МКА исследуют также в тесте проницаемости сосудов по Крейгу и на культуре клеток СНО.
В предварительных опытах определяют
5 сосудистую проницаемость XT путем внут- рикожного (в/к) введения кроликам последовательных разведений XT в объеме 0,1мл. Для смеси XT - МКА используют наименьшую дозу XT, дающую четкую зону посине0 ния диаметром 7-8 мм. Для нейтрализации
используют МКА из асцитической жидкости
и лиофилизированные МКА. 0,1 мл XT в по- роговой дозе объединяют с 0,1 мл МКА в
последовательных разведениях (в фосфат5 но-солевом буфере, рН 7,2), инкубируют 1 ч при 37°С, после чего 0,1 мл полученного , материала вводят в/к кроликам. Через 24 ч в/в вводят синьку Эванса и через 1 ч измеряют диаметр окрасившейся зоны. Реакцию
0 нейтрализации считают положительной, если зона посинения будет диаметром не более 4 мм. Каждый опыт сопровождают положительным (нейтрализация XT гомологичной экспериментальной кроличьей
5 антитоксической сывороткой (АТС) и отрицательным (сосудистая проницаемость пороговой дозы XT) контролями.
Для определения специфической антитоксической активности МКА в цитотоксиче- ском тесте на клетках СНО используют
препараты XT в минимальной дозе, оказывающей четкое цитотоксическое действие, 0,1 мл XT соединяют с 0,1 мл МКА в последовательных разведениях (в среде Игла с 1% инактивированной эмбриональной сыворотки коров), инкубируют 2 ч при 37°С, затем по 0,1 мл смеси вносят в плоскодонные лунки 96-луночной панели для культуры клеток. В каждую лунку добавляют по 0,1 мл суспензии клеток СНО в дозе 3x10 кл. Для контроля специфического действия XT используют экспериментальную кроличью АТС. В качестве отрицательного контроля используют контроль культуры клеток СНО. Пластины помещают в эксикатор во влажную атмосферу с 5% СОз, выдерживают 18 ч при 37°С. Учет проводят по 4-крестной Системе.
В РП по Оухтерлонии МКА ВСКК (П) 433 Д на 7 с формируют в агаре одну четкую линию преципитации с XT биотипа Эльтор и не взаимодействует с другимугиспользованны- ми антигенами и микроорганизмами.
В ИФА МКА ВСКК(П) 433 Д взаимодействуют только с гомологичным энтеротокси- ном. Показатели экстинкции реакции с XT 569В, XT 569 (Calblochem), ЛПС, а также С цельными клетками штаммов: V.cholerae 569В, V.eltor 1310, имеют значение фонового сигнала.
П р и м е р 1.96-луночные ИФА-планше- ты сенсибилизируют гомогенным препаратом XT биотипа эльтор (10 - 20 мкг/мл по белку) в КББ (рН 9,6), полученным по известному методу. Для получения XT используют штамм - продуцент XT In vitro. Планшеты выдерживают 1 ч при 37°С или 18ч при 4°С. Промывают пластины фосфатно-солевым буфером (ФСБ) рН 7,4, содержащим 0,05% Твина-20 и раститровывают по 0,1 мл асци- тическую жидкость, содержащую МКА, в ФСБ с 1%-ным бычьим сывороточным альбумином (БСА) и 0,05% Твина-20. Инкубируют 2 ч при 37°С. Связавшиеся комплексы
антигена с антителом выявляют антимышиными глобулинами, меченными пероксида- зой хрена. Оптическую плотность измеряют на многоканальном спектрофотометре
Multiskan MK 11 (Flow, UK) при длине волны 492 нм или визуально. Ярко-желтое или оранжевое окрашивание лунок пластины при бесцветных отрицательных контролях расценивают как специфическое. При наличии специфического окрашивания позитивного контроля, основанного на использовании антитоксической холерной сыворотки к XT биотипа эльтор, делают заключение о том, что асцитическая жидкость
содержит М КА к энтеротоксину биотипа эльтор.
П р и м е р 2. Цельные супернатанты культур холерных вибрионов, выращенных по известному методу, вносят в объеме 0,1
мл в лунки 96-луночных планшет, сенсибилизированных МКА и XT биотипа эльтор (10-20 мкг мл) в КББ (рН 9,6). Инкубируют 1 ч при 37°С. Пластины трижды промывают ФСБ, содержащим 0,05% Трина-20. В лунки
добавляют конъюгированные с пероксида- зой хрена МКА к XT биотипа эльтор в рабочем разведении и оставляют для контакта на 1 ч при 37°С. Приготовленный ex tempore субстрат по 0,1 мл добавляют в лунки и помещают пластины в темный шкаф на 15 - 20 мин при комнатной температуре для цветового проявления реакции. Положительным контролем является реакция между МКА и очищенным препаратом XT к биотипу
эльтор. Для отрицательного контроля используют гетерологичные энтеротоксины и разводящую жидкость.
Результаты учитывают аналогично примеру 1.
Формула изобретения
Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L ВСКК(П)433 Д-продуцент моноклональных антител к холерному энтеротоксину биотипа эльтор.
Использование: биотехнология, иммунология. Сущность изобретения: штамм получают гибридизацией сплено цитов белых мышей, иммунизированных очищенным препаратом холерного энтеротоксина с миеломой Р3-Х63/Ад8.653. Штамм под номером ВСКК(П) 433Д хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР и характеризуется следующими признаками: среда культивирования RPM1-1640 или ДМЕМ, содержащая 10 - 15% телячьей эмбриональной сыворотки. Посевная доза клеток 105 - 1,5105 кл/мл, коэффициент рассева 1:4 - 1:5. Модальное число хромосом 87. Титр моноклональных антител (МКА) в культуральной -жидкости 1:256 - 1:512 (ИФА), в асцитической жидкости 1:25600-1:51200 (ИФА), 1:16-1:32 (РП). Нейтрализация холерного энтеротоксина в пробе по Крейгу 1:2000, нейтрализация холерного энтеротоксина на клетках СНО 1:320 - 1:640. МКА относятся к классу Ig С2в. Они выявляют энтеротоксин в супернатан- тах штаммов холерных вибрионов биотипа эльтор, не дают перекрестных реакций с энтеротоксинами классического биотипа и E.coli, ЛПС, выделенными из холерных эн- теротоксинов классического и эльтор биотипов, убитыми бактериальными клетками холерных вибрионов. МКА используют в диагностических целях для серологической идентификации холерных энтеротоксинов биотипа эльтор. С/1 С 2 чэ со hO ел
| Сидорович И.Г., Николаева И.А., Игнатьева ГА Моноклональные антитела к холерному токсину (получение и характеристика), - В сб | |||
| Моноклональные антитела в микробиологии и вирусологии - М., 1985 | |||
| Переносная печь для варки пищи и отопления в окопах, походных помещениях и т.п. | 1921 |
|
SU3A1 |
| Gen.mlcrobiol., 1989, v.135, №5, p.1195- 1200. | |||
