Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для серологической идентификации возбудителя холеры серовара Огава.
Цель изобретения - получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus. musculus, продуцирующего моноклон.игьные антитела (монАТ) к термостабильному 0-антигену холерного вибриона серовара Огава.
Штамм получают следующим образом.
Белых мышей иммунизируют внутри- брюшинно трехкратно с интервалом
10 дней бактериальной взвесью холерных вибрионов серовара Огава, прогретой лри температуре 100°С в дозе |10 м0кл.
Бустерную инъекцию антигена проводят за 4 дня до гибридизации. Слияние клеток мышиной миеломы P3-X63/Ag 8.653 с клетками селезенки мышей проводят с помощью 50% полиэтилен- гликоля с молекулярной массой 1500 Д. В стерильных условиях извлекают селезенку и измельчают ее с помощью гомогенизатора. Взвесь клеток фильтел
4 Ю
сл
4
ругот через 2 слоя марли, а эритроциты разрушают 0,83%-ным раствором , забуференным трис-буфером. Лимфоциты дважды отмывают средой Кгла-МЕМ и смешивают с дважды отмытыми клетками миеломы в соотношении 5:1 (клетки селезенки:миеломные клетки). Смесь клеток отмывают один раз в 50-миллилитровой центрифужной пробирке, супернатант декантируют и к сухому осадку добавляют 1 мл 50%-но- го раствора полиэтиленгликоля в течение 1 мин по каплям при температуре 42°С (на водяной бане). После этого в центрифужную пробирку вносят медленно бессывороточную среду Игла- МЕМ. Взвесь клеток инкубируют при температуре 37СС 10 мин, после этого супернатант декантируют и смесь клеток осторожно ресуспендируют в 40 мл ростовой среды (среда RPMI 1640 или ДМЕМ с добавлением 20% телячьей эмбриональной сыворотки, 4мМ/мл глютамина, 4 г/л глюкозы, . 0,1 М пирувата натрия), содержащей компоненты ГАТ (0,0131 мг/мл гипо- ксантина, 0,000191 мг/мл аминопте- рина, 0,00385 мг/мл тимидина). Суспензию клеток в ГАТ-среде разливают по О,1 мл Б четыре 96-луночных плоскодонных культуральных плато на фидерный слой предварительно высеянных (за сутки) перитонеальных макрофагов белых мышей в дозе 10000 на лунку. Видимые колонии мышей гибридных клеток появляются на 7-10 день Гибридому культивируют 14 дней на среде ГАТ, затем 7-10 дней на среде ГТ, после чего переводят на ростковую среду без селективных компонентов. Гибридому дважды клонируют методом предельных разведений на фидере из перитонеальных макрофагов белых мышей. В результате клонирования получают продуктивный штамм гибридных культивируемых клеток мыши, стабильно продуцирующих МА заданной специфичности.
Штамм обозначают ГХ-В7/Ог, он хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером ВСКК(П) № 237 и характеризуется следующими признаками.
Морфологические признаки. Гибридные клетки ГХ-В7/ОГ представляют собой крупные округлые клетки с узким
ободком базофильной цитоплазмы Ядра гиперхромные, неправильно-овальной формы, крупные, с грубой структу. рой ядерного хроматина В значительной части клеток цитоплазма имеет выросты,
Культуральные признаки типичны для перевиваемых клеток мышиных
плазмоцитом. Клетки ГХ-В7/Ог культивируют в виде стационарной суспензии при 37 С в пластиковой или стеклянной посуде при посевной дозе 100- 1500 тыс./мл в течение 3-4 дней до %
плотности насыщения800-900 тыс.кл./мл. Клетки пассируют один раз в 3-4 дня, t той же дозой. Коэффициент рассева 1:4-1:50 Культивирование ведут на питательной среде RPMI 1640 или ДМЕМ,
0 содержащей J 0% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ глютамина, 8-10 мМ буфера HEPES, 50 мкг/мл гентамицина Культивирование штамма в организме экспериментальных животных Кндук5 Дню асцитных опухолей у инбредных мышей линии Ва1Ъ/с, внутрибрюшинно праймированных 14 дней до введения гибридомы пристаном в дозе 0,5 мл/мышь, осуществляют путем инокулирования
0
0
0
1010 гибридных клеток на одно животное. Иммунную асцитическую жидкость собирают по мере формирования асцитных опухолей через 12-14 дней в объеме 2-6 мл Культуру клеток поддерживают в течение двух пассажей асцитной опухоли на мышах (срок наблюдения ).
Кариологические признаки,, Модальное число хромосом 87, С-маркеры родительской миеломной линии P3-X63/Ag 8.653 о
Характеристика моноклональных антител
МонАТ относится к классу IgG. Они г выявляют 0-антиген холерных вибрионов только серовара Огава, не давая перекрестной реактивности с вибрионами серовара Инаба и вибрионами не 01 группы и представителями близкородственных семейств. Антитела тестируют в реакциях непрямой иммунофлюорес- ценцйи, иммуноферментном методе, развернутой агглютинации, Ко-агглютина- ции и преципитации с использованием в качестве антигенного препарата тер- 5 нестабильного 0-антигена холерных вибрионов сероваров Огава и Инаба. Класс иммуноглобулинов определяют в реакции преципитации по Оухтерлони..
Титр монАТ в культуральной жидкости составляет 1:2000 (ИФА), 1:60 (НИФ), в асцитической - 1:80000 (ИФА), 1:6000 (НИФ).
Контаминация. Бактерии и грибы в культуре клеток не обнаруживаются. Заражение микоплазмой не выявлено.
Криоконсервирование0 Клетки штамма ресуспендируют в среде RPMI 1640, содержащей 50% эмбриональной телячье сыворотки и 10% глицерина или 10% диметилсульфоксида Замораживание проводят в программном замораживате- ле со снижением температуры на 1°С (до -4С°С), далее на 1 0°С (до -1 00°С). Затем клетки помещают в жидкий азот. Размораживание проводят быстро на водяной бане при 37°С. Жизнеспособность клеток по включению трипаново- го синего составляет 78-92%.
Исследование специфичности монАТ.,
Для определения специфичности монАТ продуцируемых гибридомой ГХ-Вг/Ог используют набор клонированных штаммов холерных вибрионов сероваров Огава и Инаба и представителей семейств Vibrionaceae, Pseu- domonadaceae, Enterobacteriac eae.
В качестве антигенных препаратов в исследуемых серологических реакциях используют живые и убитые кипячением бактериальные клетки холерных вибрионов сероваров Огава и Инаба и близкородственных микроорганизмов.
При исследовании специфичности монАТ в реакции непрямой иммунофлу- оресценции и иммуноферментном анализе установленовактивное взаимодействие иммуноглобулинов с детерминантами 0-антигена только штаммов серовара Огава.
В реакции преципитации антитела гибридомы ГХ-В7/Ог образуют в afape одну четкую линию преципитации с клетками холерных вибрионов серовара Огава и не взаимодействуют с клетQ ками серовара Инаба и близкородственными микроорганизмами.
При постановке реакции развернутой агглютинации монАТ, продуцируемые гибридомой ГХ-В7/Ог, обладают
5 способностью агглютинировать клетки холерных вибрионов серовара Огава в титрах до 1:8000.
П р и м е р„ Из исследуемой культуры, выделенной из объектов окружа0 ющей среды или от человека, готовят 1 млрд. взвесь. Каплю взвеси клеток наносят пипеткой на стекло и смешивают с каплей препарата монАТ, осторожно покачивая стекло„ Образование
5 крупных агглютинатов в течение 30 с - 5 мин свидетельствует о наличии в исследуемом образце холерных вибрионов серовара Огава.
Использование монАТ, продуцируе0 мых гибридомой, позволяет осуществлять раннюю и экспрессную диагностику возбудителя холеры.
Формула изобретения
Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus ВСКК(П) № 237Д, используемый для получения моноклокальных антител к термостабильному 0-антигену холерного вибриона серовара Огава.
Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для серологической идентификации возбудителя холеры серовара Огава. Цель изобретения - получение штамма гибридных культивируемых клеток животных MUS MUSCULUS, продуцирующего моноклональные антитела (монАТ) к термостабильному О-антигену холерного вибриона серовара Огава. Штамм получают гибридизацией клеток мышиной миеломы Р3-Х63/Ад8.653 с клетками селезенки мышей, иммунизированных бактериальной взвесью VIBRIO CHOLERAE штамм 3119 серовара Огава. Клетки культивируют на среде RPMI 1640 с 10% эмб. тел. сыв. пассируют 1 раз в 3 - 4 дня, коэффициент рассева 1:4-1:5. МонАТ относятся к классу Iдд, их титр в культуральной жидкости 1:2000 (ИФА), 1:60 (НИФ), в асцетической - 1:80000 (ИФА), 1:6000 (НИФ). МонАТ специфичны к термостабильному О-антигену штаммов серовара Огава и могут быть использованы в диагностических целях. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) N 237 Д.
