Способ отбора веществ, обладающих гепатотропным действием Советский патент 1992 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к экспериментальной медицине, в частности к токсикологии, и может быть использовано для ускоренного гигиенического нормирования веществ в средах.

Известны морфологические способы определения результатов действия неблагоприятных факторов окружающей среды на клетки печени животных

Однако известные способы не обладают высокой чувствительностью, а следовательно, точностью, поскольку позволяют выявлять результаты либо длительного действия гепатотропных веществ, либо краткосрочного действия веществ в концентрациях, намного превышающих пороговые, т.е таких, которые вызывают значительные структурные изменения ядра и цитоплазмы клеток, что ограничивает их использование при гигиеническом нормировании веществ в средах

Наиболее близким к предлагаемому является способ определения влияния гепатотропных веществ на контактные взаимодействия гепатоцитов, заключающийся в следующем. После воздействия веществ проводят перфузию органа под давлением, деформирующим поверхность, клеток. Затем берут образцы печени, обрабатывают их для заливки в эпон и изготавливают ультратонкие срезы которые исследуют на просвечивающем электронном микроскопе На срезах выявляют нарушения в клетках путем морфометрии структур, сформированных поверхностью гепатоцитов, - межклекточных контактов Получают параметры элементов ультраструктуры контактов и в случае их изменеVJ

сл

СК

ч о

ния определяют влияние гепатотропных веществ.

Известный способ обладает высокой чувствительностью, а следовательно, точностью, поскольку позволяет выявлять результаты краткосрочного действия гепатотропных веществ в концентрациях, близких iTfi&polPoBbiM, т.е. таких, которые вызывают минимальные изменения в клетках, в данном случае нарушения поверхности гепатоцитов, без повреждения ядра и цитоплазмы. Однако выявление ультраструктуры контактов гепатоцитов предусматривает использование сложной техники приготовления ультратонких срезов, для исследования которых необходимо применение дорогостоящей и не всегда доступной просвечивающей электронной микроскопии, в результате чего известный способ не может широко использоваться в практике гигиенического нормирования.

Целью изобретения является упрощение способа путем выявления нарушений на светооптическом уровне.

Цель достигается тем, что в способе определения влияния гепатотропных веществ, включающем выявление нарушений в клетках по результату морфометрии структур, сформированных поверхностью гепатоцитов, на препаратах, приготовленных из образцов печени, взятых после перфузии органа под давлением, деформирующим поверхность клеток, и обработанных для заливки в эпон, в качестве структур на полутонких срезах берут впячивания поверхности внутрь клеток, устанавливают отношение площади сечения впячиваний к их количеству и в случае его изменения определяют гепатотропное действие веществ.

Способ осуществляют следующим образом.

Экспериментальным материалом служили 24 белые беспородные крысы-самцы массой 180-200 г каждая. 12 опытных животных подвергали однократной ингаляционной затравке в герметичных камерах в течение 4 ч стиролом (СТ) в концентрации 1100 мг/м3 (6 крыс) и трихлорэтиленом (ТЭ) в концентрации 2500 мг/м3 (6 крыс). В проведенных ранее исследованиях по определению влияния этих веществ на контактные взаимодействия гепатоцитов было установлено, что СТ и ТЭ в вышеназванных концентрациях изменяют параметры ультраструктуры контактов гепатоцитов, но не вызывают повреждения ядра и цитоплазмы, характерные для деструктивных клеточных форм. 12 контрольных животных были помещены в такие же камеры, в которые поступал атмосферный воздух. Через

18ч noc.je экспозиции всех коыс поочередно наркотировали 10%-ным тиопенталом натрия, который вводили внутрибрюшинно по 0,5 мл каждому животному. Затем животным вскрывали брюшную полость, через портальную вену в кровеносное русло печени нагнетали раствор Хенкса при Т +37°С под давлением 45 мм рт.ст., вызывающим деформацию поверхности, но не разрушаю0 щим клетки. Отток жидкости блокировали наложением лигатур на нижнюю полую вену (выше и ниже печеночной вены). Через 1-1,5 мин после начала перфузии меняли раствор Хенкса на глютаровый альдегид и фиксиро5 вали ткани печени в течение 2-3 мин. Затем вычленяли одну долю печени и вырезали кусочки размером 1 см3, которые обрабатывали по общепринятой методике для заливки в эпон. После заливки на микротоме

0 изготавливали полутонкие срезы (толщиной 1 мкм). Срезы наклеивали на предметные стекла и окрашивали метиленовым синим - аЗур-П-фуксином. Покрашенные срезы высушивали и исследовали на световом

5 микроскопе. Проводили морфометрию впячиваний поверхности внутрь клеток наложением планиметрической сетки, имеющей 100 точек, при увеличении х 10 х 90 на 20 полях зрения у каждого животного. Опреде0 ляли площадь сечения впячиваний (число

тест-точек, приходящихся на впячивания) и

. количество впячиваний на площади среза,

ограниченной 100 точками сетки). Затем

брали отношение площади сечения впячи5 ваний к их количеству.

Результаты морфометрии препаратов печени у отдельно взятых животных (примеры конкретного выполнения способа) сведены в табл. 1.

0

Результаты морфометрии препаратов печени rto группам животных, обработанные методом вариационнцй статистики. сведены в табл. 2,

5 Из представленных в табл. 1 и 2 результатов видно, что стирол и трихлорэтилен обладают гепатотропным эффектом и в концентрациях соответственно 1100 и 2500 мг/м вызывают в первом случае увеличе0 ние, а во втором - уменьшение отношения площади сечения впячиваний деформированной поверхности гепатоцитов внутрь клеток к количеству впячиваний в единице площади полутонкого среза

5

Таким образом, по предлагаемому показателю можно определить действие вещества на клетки печени в концентрациях, не вызывающих повреждения ядра и цитоплазмы, но изменяющих параметры структур,

сформированных поверхностью гепатоци- тов.

Использование изобретения упрощает способ отбора веществ, обладающих гепа- тотропным действием (появляется воэмож- ность его реализации на светооптическом уровне). Кроме того, сокращается время исследования препаратов печени, на основании которого определяют гепатотропное действие веществ, за счет приготовления полутонких, а не ультратонких срезов ткани, а также за счет применения значительно меньшей по объему морфометрии, что важно для реализации способа при ускоренном гигиеническом нормировании Предлагав- мый способ позволяет излучать механизм действия гепатотропных веществ на клеточную поверхность и устанавливать границу между регрессивными изменениями и компенсаторно-приспособительной перестрой- кой клеток печени

Формула изобретения Способ отбора веществ, обладающих гепатотропным действием, путем введения их в организм, проведения перфузии печени под давлением, деформирующим поверхность клеток, забора образцов и обработки их для заливки в эпон, подготовки срезов их микроскопии с последующим проведением морфометрического исследования структур, сформированных поверхностью гепатоцитов, отличающийся тем, что с целью упрощения способа путем выявления нарушений на светооптическом уровне, готовят полутонкие срезы, затем проводят их световую микроскопию и морфометрию впячиваний поверхности внутрь клетки, исследуют площадь их сечения, рассчитывают ее отношение к общему количеству впячиваний и при его изменении относительно контроля определяют наличие гепатотропного действия веществ

Использование: для отбора веществ, обладающих гепатотропным действием. Сущность изобретения после введения вещества животным под наркозом осуществляют перфузию печени под давлением, деформирующим поверхность, затем берут образцы печени, обрабатывают их для заливки в эпон, делают полутонкие срезы окрашивают их и проводят морфометрию структур, сформированных поверхностью гепатоцитов под давлением, при этом в качестве структур выявляют впячивания поверхности внутрь клеток, устанавливают отношение площади сечения впячиваний к их количеству и в случае его изменения относительно контроля определяют наличие гепатотроп- ного действия у вещества Способ прост в исполнении

Таблица

Показатели морфометрии у отдельно взятых животных после экспозиции

нтроль

679

1 2

3

k

5

6

7

S

9

10

11

12

13

Т

15

16

17 18 19 20

В среднем на препарат

После воздействия СТ в концентрации 1100 мг/м3

659

ат

32 3 19 2( 33 25 16 21 30 19 31 22 5

II 26 О (5 ЦЦ k6

22 16 20 20 25 10 16 27 21

0,75 0,62 Ь32 1,00 0,61 0,88 0,81 0,71 0, 0,7й 0,39 0,86 0,29 0,62 0,52

0,73 0,53 0,62 0,55 0,37

0,67

1,59 2,1 1,35 1,25 0,96 1,60 1, й 1,30 1,33

Продолжение табл. 1

Результаты морфометрии по группам животных после действия гепатотропных веществ

Редактор А.Долинич

Техред М.Моргентал

З.аказ 2688ТиражПодписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат Патент, г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Таблица 2

Корректор Н.Филь