ЛАБИЛЬНЫЕ ЛИНКЕРЫ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ БИОМАРКЕРА Российский патент 2020 года по МПК G01N27/26 C12Q1/68 B82Y15/00 

Ссылка на родственные заявки

Согласно настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с предварительной заявкой на выдачу патента США с серийным №62/111073, поданной 2 февраля 2016 года, раскрытие которой включено в настоящий документ посредством ссылки.

Уровень техники

Ферментативная активность, присутствующая в образце, может указывать на присутствие токсинов, нарушение или другое состояние организма. Например, протеазы являются чрезвычайно важными обнаруживаемыми у людей молекулами, которые регулируют широкий ряд нормальных физиологических процессов у человека, в том числе заживление ран, клеточная сигнализация и апоптоз. Из-за своей важной роли в организме человека патологическая протеазная активность была ассоциирована с рядом болезненных состояний, в том числе без ограничения с ревматоидным артритом, болезнью Альцгеймера, сердечно-сосудистым заболеванием и широким диапазоном злокачественных новообразований. Специфический антиген предстательной железы (PSA) является одним из примеров ценной диагностической протеазы, которая является золотым стандартом в диагностике и мониторинге злокачественной опухоли предстательной железы у особей мужского пола. Протеазы обнаруживаются почти во всех жидкостях и тканях человека, и уровни их активности могут сигнализировать о наличии состояния.

Хотя существует множество стратегий для определения присутствия фермента в образце, зачастую, активность представляющего интерес фермента является более важной, чем присутствие или отсутствие самого фермента. Существуют стратегии для оценки уровня ферментативной активности, присутствующей в образце, но эти методы часто являются дорогостоящими, требуют значительного инвестирования времени и инфраструктуры устройств и/или сложны в применении или не являются портативными. Поэтому необходим способ определения ферментативной активности в растворе, который является быстрым, отличает активные ферменты от тех, которые просто присутствуют и неактивны, не содержит меток и/или может быть осуществлен с очищенным или неочищенным образцом.

Сущность изобретения

Различные аспекты, раскрываемые в настоящем документе, могут отвечать одной или нескольким из вышеупомянутых потребностей. Описываемые в настоящем документе системы и способы имеют несколько аспектов, ни один из которых не отвечает исключительно за их желаемые свойства. Без ограничения объема настоящего раскрытия, определяемого следующей формулой изобретения, далее будут кратко обсуждаться более существенные признаки. После рассмотрения данного обсуждения и особенно после прочтения раздела, озаглавленного «Подробное раскрытие настоящего изобретения», будет понятно, как описываемые в настоящем документе типичные признаки обеспечивают улучшенные системы и способы.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящий документ относится к способам выявления присутствия или отсутствия целевых молекулы или фактора в образце с помощью выявления расщепления лабильного линкера (например, расщепляемого линкера) целевыми молекулой или фактором с использованием нанопористого устройства для идентификации продуктов расщепления. Согласно некоторым вариантам осуществления целевой молекулой является фермент, а способами, описываемыми в настоящем документе, выявляют присутствие или отсутствие активных целевых ферментов в образце.

Согласно определенным предпочтительным вариантам осуществления полимерным каркасом является dsDNA. Согласно определенным предпочтительным вариантам осуществления слияние связывается непосредственно и ковалентно с dsDNA, а нагрузка связывается непосредственно и нековалентно со слиянием.

Согласно некоторым вариантам осуществления перед расщеплением расщепляемого линкера ферментом комплекс каркас : слияние : нагрузка обеспечивает уникальный и выявляемый ток при транслокации через нанопору. Согласно некоторым вариантам осуществления после расщепления расщепляемого линкера ферментом каркас (или каркас плюс оставшиеся компоненты слияния) и нагрузка (или нагрузка плюс оставшиеся компоненты слияния) уже не являются связанными, и каждый из них обеспечивает уникальный и выявляемый ток при транслокации через нанопору, что отличается от комплекса каркас : слияние : нагрузка.

Согласно определенным вариантам осуществления молекула слияния содержит РНК, связанную с каркасом ДНК, и расщепляемый линкер привязан ковалентно к РНК соединителем.

Согласно определенным вариантам осуществления нагрузкой является PEG, который связывается с расщепляемым линкером. Согласно определенным вариантам осуществления размер, форма и/или заряд нагрузки могут быть модифицированы для усиления разрешения на основании токового импеданса в поре определенной формы или размера, для обеспечения улучшенного различения комплекса каркас : слияние : нагрузка, каркаса и нагрузки.

Согласно определенным вариантам осуществления полимерным каркасом является dsDNA с одним или несколькими сайтами последовательности, содержащими расщепляемый домен, который расщепляется одной или несколькими целевыми эндонуклеазами. Согласно определенным вариантам осуществления полимерным каркасом является линейная dsDNA до расщепления. Согласно определенным вариантам осуществления полимерным каркасом является кольцевая dsDNA до расщепления.

Также настоящий документ относится к способам анализа данных из нанопористого устройства для количественного определения присутствия целевых молекулы или фактора, как предполагается, присутствующих в образце. Согласно определенным предпочтительным вариантам осуществления задают числовой уровень достоверности для выявления. Согласно определенным предпочтительным вариантам осуществления оценивают концентрацию цели путем применения математических инструментов для повторных экспериментов, в которых варьируют концентрации одного или нескольких из слияния, каркаса, нагрузки и/или целевых молекул.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящий документ относится к способу выявления присутствия или отсутствия целевой молекулы, как предполагается, присутствующей в образце, предусматривающему введение образца в контакт с молекулой слияния, содержащей расщепляемый линкер, при этом расщепляемый линкер специфически расщепляется в присутствии целевой молекулы; загрузку образца в устройство, содержащее нанопору, при этом нанопора разделяет внутреннее пространство устройства на два объема; создание конфигурации устройства с возможностью прохождения полимерного каркаса через нанопору, при этом первая часть молекулы слияния связывается с полимерным каркасом, при этом вторая часть молекулы слияния связывается с молекулярным грузом, и при этом устройство содержит датчик, выполненный с возможностью идентификации объектов, проходящих через нанопору; и определение с помощью датчика, был ли расщепляемый линкер расщеплен, с выявлением тем самым присутствия или отсутствия целевой молекулы в образце.

Согласно некоторым вариантам осуществления введение образца в контакт с молекулой слияния выполняют перед загрузкой образца в устройство. Согласно некоторым вариантам осуществления загрузку образца в устройство выполняют перед введением образца в контакт с молекулой слияния.

Согласно некоторым вариантам осуществления молекула слияния содержит домен связывания с полимерным каркасом. Согласно некоторым вариантам осуществления способ выявления присутствия или отсутствия целевой молекулы дополнительно предусматривает введение образца в контакт с полимерным каркасом. Согласно некоторым вариантам осуществления способ выявления присутствия или отсутствия целевой молекулы дополнительно предусматривает связывание полимерного каркаса с доменом связывания с полимерным каркасом. Согласно некоторым вариантам осуществления полимерный каркас связывается с доменом связывания с полимерным каркасом посредством ковалентной связи, водородной связи, ионной связи, силы Ван-дер-Ваальса, гидрофобного взаимодействия, катион-пи-взаимодействия, плоскостного стэкинг-взаимодействия или металлической связи. Согласно некоторым вариантам осуществления домен связывания с полимерным каркасом содержит азидную группу. Согласно некоторым вариантам осуществления домен связывания с полимерным каркасом содержит молекулу, выбранную из группы, состоящей из ДНК, РНК, PNA, полипептида, гибрида холестерин/ДНК и гибрида ДНК/РНК. Согласно некоторым вариантам осуществления домен связывания с полимерным каркасом содержит молекулу, выбранную из группы, состоящей из запертой нуклеиновой кислоты (LNA), мостиковой нуклеиновой кислоты (BNA), эффекторной нуклеазы, подобной активаторам транскрипции (TALEN), кластерного короткого палиндромного повтора, разделенного регулярными промежутками (CRISPR), аптамера, связывающего ДНК белка и фрагмента антитела. Согласно некоторым вариантам осуществления связывающий ДНК белок включает в себя белок типа «цинковый палец». Согласно некоторым вариантам осуществления фрагмент антитела включает в себя связывающий антиген (Fab) фрагмент. Согласно некоторым вариантам осуществления домен связывания с полимерным каркасом содержит химическую модификацию.

Согласно некоторым вариантам осуществления молекула слияния содержит домен связывания с молекулярным грузом. Согласно некоторым вариантам осуществления способ выявления присутствия или отсутствия целевой молекулы дополнительно предусматривает введение образца в контакт с молекулярным грузом.

Согласно некоторым вариантам осуществления способ выявления присутствия или отсутствия целевой молекулы дополнительно предусматривает связывание молекулярного груза с доменом связывания с молекулярным грузом. Согласно некоторым вариантам осуществления молекулярный груз связывается с доменом связывания с молекулярным грузом посредством ковалентной связи, водородной связи, ионной связи, силы Ван-дер-Ваальса, гидрофобного взаимодействия, катион-пи-взаимодействия, плоскостного стэкинг-взаимодействия или металлической связи. Согласно некоторым вариантам осуществления домен связывания с молекулярным грузом содержит DBCO.

Согласно некоторым вариантам осуществления молекула слияния содержит домен связывания с полимерным каркасом и домен связывания с молекулярным грузом. Согласно некоторым вариантам осуществления первая часть молекулы слияния связывается непосредственно или опосредованно с полимерным каркасом посредством ковалентной связи, водородной связи, ионной связи, силы Ван-дер-Ваальса, гидрофобного взаимодействия, катион-пи-взаимодействия, плоскостного стэкинг-взаимодействия или металлической связи. Согласно некоторым вариантам осуществления вторая часть молекулы слияния связывается непосредственно или опосредованно с молекулярным грузом посредством ковалентной связи, водородной связи, ионной связи, силы Ван-дер-Ваальса, гидрофобного взаимодействия, катион-пи-взаимодействия, плоскостного стэкинг-взаимодействия или металлической связи.

Согласно некоторым вариантам осуществления молекулярный груз или полимерный каркас связывается с молекулой слияния посредством прямого ковалентного связывания. Согласно некоторым вариантам осуществления молекула слияния содержит соединитель для прямого ковалентного связывания полимерного каркаса или молекулы слияния с расщепляемым линкером. Согласно некоторым вариантам осуществления полимерный каркас содержит молекулу слияния. Согласно некоторым вариантам осуществления выявление присутствия или отсутствия целевой молекулы в образце предусматривает определение с помощью датчика, связывается ли полимерный каркас с молекулярным грузом через молекулу слияния. Согласно некоторым вариантам осуществления датчик выявляет электрический сигнал в нанопоре. Согласно некоторым вариантам осуществления электрическим сигналом является электрический ток.

Согласно некоторым вариантам осуществления целевой молекулой является гидролаза или лиаза. Согласно некоторым вариантам осуществления расщепляемый линкер содержит молекулу, выбранную из группы, состоящей из дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), рибонуклеиновой кислоты (РНК) и полипептида. Согласно некоторым вариантам осуществления расщепляемый линкер выбран из группы, состоящей из азосоединения, дисульфидного мостика, сульфона, этиленгликольдисукцината, гидразона, ацеталя, имина, винилового эфира, вицинального диола и сложного пиколинатного эфира. Согласно некоторым вариантам осуществления целевая молекула специфически расщепляет связь в расщепляемом линкере, выбранную из группы, состоящей из связи углерод-кислород, связи углерод-сера, связи углерод-азот и связи углерод-углерод.

Согласно некоторым вариантам осуществления полимерный каркас содержит молекулу, выбранную из группы, состоящей из дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), дендримера, пептидной нуклеиновой кислоты (PNA), рибонуклеиновой кислоты (РНК), полипептида, наностержня, нанотрубки, гибрида холестерин/ДНК и гибрида ДНК/РНК. Согласно некоторым вариантам осуществления молекулярный груз содержит молекулу, выбранную из группы, состоящей из дендримера, двухнитевой ДНК, однонитевой ДНК, аптамера ДНК, флуорофора, белка, полипептида, наногранулы, наностержня, нанотрубки, фуллерена, молекулы PEG, липосомы и гибрида холестерин/ДНК. Согласно некоторым вариантам осуществления молекула слияния содержит два или более расщепляемых линкера.

Согласно некоторым вариантам осуществления датчик содержит электродную пару, при этом электродная пара создает дифференциал напряжения между двумя объемами и выявляет протекание тока через нанопору. Согласно некоторым вариантам осуществления устройство содержит по меньшей мере две нанопоры, соединенных последовательно, при этом полимерный каркас одновременно захватывается и выявляется по меньшей мере в двух нанопорах. Согласно некоторым вариантам осуществления транслокацию полимерного каркаса контролируют путем применения единого напряжения по каждой из нанопор.

Также настоящий документ относится к способу выявления присутствия или отсутствия целевых молекулы или фактора, как предполагается, присутствующих в образце, при этом способ предусматривает введение образца в контакт с молекулой слияния, содержащей расщепляемый линкер, при этом расщепляемый линкер специфически расщепляется в присутствии целевых молекулы или фактора; загрузку образца в устройство, содержащее нанопору, при этом нанопора разделяет внутреннее пространство устройства на два объема; создание конфигурации устройства с возможностью пропускания полимерного каркаса через нанопору, при этом первая часть молекулы слияния связывается с полимерным каркасом, при этом вторая часть молекулы слияния связывается с молекулярным грузом, и при этом устройство содержит датчик, выполненный с возможностью идентификации объектов, проходящих через нанопору; и определение с помощью датчика, был ли расщепляемый линкер расщеплен, с выявлением тем самым присутствия или отсутствия целевых молекулы или фактора в образце.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящий документ относится к способу выявления присутствия или отсутствия целевых молекулы или фактора, как предполагается, присутствующих в образце, при этом способ предусматривает введение образца в контакт с молекулой слияния, полимерным каркасом и молекулярным грузом, при этом молекула слияния содержит расщепляемый линкер, при этом целевая молекула специфически расщепляет расщепляемый линкер, домен связывания с полимерным каркасом и домен связывания с молекулярным грузом; загрузку молекулы слияния, полимерного каркаса, молекулярного груза и образца в устройство, содержащее нанопору, при этом нанопора разделяет внутреннее пространство устройства на два объема; создание конфигурации устройства с возможностью прохождения полимерного каркаса через нанопору, при этом устройство содержит датчик, выполненный с возможностью идентификации объектов, проходящих через нанопору; и определение с помощью датчика, связывается ли расщепляемый линкер с молекулярным грузом, с выявлением тем самым присутствия или отсутствия целевых молекулы или фактора.

Согласно некоторым вариантам осуществления целевая молекула включает в себя гидролазу или лиазу. Согласно некоторым вариантам осуществления целевые молекула или фактор фотолитически расщепляют расщепляемый линкер путем воздействия на расщепляемый линкер света с длиной волны от 10 нм до 550 нм. Согласно некоторым вариантам осуществления расщепляемый линкер, чувствительный к фотолитическому расщеплению, выбран из группы, состоящей из производного орто-нитробензила и производного сложного фенацилового эфира. Согласно некоторым вариантам осуществления целевые молекула или фактор химически расщепляет расщепляемый линкер путем воздействия на расщепляемый линкер реагента, выбранного из группы, состоящей из нуклеофильного реагента, основного реагента, электрофильного реагента, кислотного реагента, восстановителя, окислителя и металлорганического соединения.

Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере один из двух объемов в устройстве содержит факторы, позволяющие связывание молекулы слияния с полимерным каркасом и связывание молекулы слияния с молекулярным грузом. Согласно некоторым вариантам осуществления молекула слияния связывается с полимерным каркасом и молекулярным грузом перед введением образца в контакт с молекулой слияния. Согласно некоторым вариантам осуществления молекула слияния связывается с полимерным каркасом и молекулярным грузом перед загрузкой молекулы слияния в устройство.

Согласно некоторым вариантам осуществления один или несколько объемов в устройстве предусматривают условия, позволяющие целевым молекуле или фактору, как предполагается, присутствующим в образце, расщеплять расщепляемый линкер. Согласно некоторым вариантам осуществления введение образца в контакт с молекулой слияния выполняют перед загрузкой образца в устройство. Согласно некоторым вариантам осуществления загрузку образца в устройство выполняют перед введением образца в контакт с молекулой слияния.

Согласно некоторым вариантам осуществления полимерный каркас содержит молекулу, выбранную из группы, состоящей из дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), дендримера, пептидной нуклеиновой кислоты (PNA), рибонуклеиновой кислоты (РНК), полипептида, наностержня, нанотрубки, гибрида холестерин/ДНК и гибрида ДНК/РНК.

Согласно некоторым вариантам осуществления расщепляемый линкер содержит молекулу, выбранную из группы, состоящей из дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), рибонуклеиновой кислоты (РНК) и полипептида. Согласно некоторым вариантам осуществления расщепляемый линкер выбран из группы, состоящей из азосоединения, дисульфидного мостика, сульфона, этиленгликольдисукцината, гидразона, ацеталя, имина, винилового эфира, вицинального диола и сложного пиколинатного эфира.

Согласно некоторым вариантам осуществления целевые молекула или фактор специфически расщепляет связь в расщепляемом линкере, выбранную из группы, состоящей из связи углерод-кислород, связи углерод-сера, связи углерод-азот и связи углерод-углерод.

Согласно некоторым вариантам осуществления молекулярный груз содержит молекулу, выбранную из группы, состоящей из дендримера, двухнитевой ДНК, однонитевой ДНК, аптамера ДНК, флуорофора, белка, полипептида, наногранулы, наностержня, нанотрубки, фуллерена, молекулы PEG, липосомы и гибрида холестерин/ДНК.

Согласно некоторым вариантам осуществления полимерный каркас и молекула слияния связываются посредством ковалентной связи, водородной связи, ионной связи, силы Ван-дер-Ваальса, гидрофобного взаимодействия, катион-пи-взаимодействия, плоскостного стэкинг-взаимодействия или металлической связи. Согласно некоторым вариантам осуществления каркас и молекула слияния связываются посредством прямого ковалентного связывания. Согласно некоторым вариантам осуществления молекула слияния содержит соединитель для прямого ковалентного связывания с полимерным каркасом, при этом соединитель связывается с расщепляемым линкером. Согласно некоторым вариантам осуществления соединитель содержит полиэтиленгликоль. Согласно некоторым вариантам осуществления молекула слияния содержит домен связывания с полимерным каркасом, содержащий молекулу, выбранную из группы, состоящей из ДНК, РНК, PNA, полипептида, гибрида холестерин/ДНК и гибрида ДНК/РНК.

Согласно некоторым вариантам осуществления молекула слияния содержит молекулу, выбранную из группы, состоящей из запертой нуклеиновой кислоты (LNA), мостиковой нуклеиновой кислоты (BNA), эффекторной нуклеазы, подобной активаторам транскрипции (TALEN), кластерного короткого палиндромного повтора, разделенного регулярными промежутками (CRISPR), аптамера, связывающего ДНК белка и фрагмента антитела. Согласно некоторым вариантам осуществления связывающий ДНК белок включает в себя белок типа «цинковый палец». Согласно некоторым вариантам осуществления фрагмент антитела включает в себя связывающий антиген (Fab) фрагмент. Согласно некоторым вариантам осуществления молекула слияния содержит химическую модификацию.

Согласно некоторым вариантам осуществления расщепляемый линкер и молекулярный груз связываются непосредственно или опосредованно с помощью ковалентной связи, водородной связи, ионной связи, силы Ван-дер-Ваальса, гидрофобного взаимодействия, катион-пи-взаимодействия, плоскостного стэкинг-взаимодействия или металлической связи. Согласно некоторым вариантам осуществления молекула слияния содержит два или более расщепляемых линкера.

Согласно некоторым вариантам осуществления датчик содержит электродную пару, при этом электродная пара создает дифференциал напряжения между двумя объемами и выявляет протекание тока через нанопору.

Также настоящий документ относится к способу выявления целевых молекулы или фактора, как предполагается, присутствующих в образце, при этом способ предусматривает введение образца в контакт с полимерным каркасом, при этом каркас содержит расщепляемый домен, при этом расщепляемый домен специфически расщепляется в присутствии целевой молекулы; загрузку полимерного каркаса и образца в устройство, содержащее нанопору, при этом нанопора разделяет внутреннее пространство устройства на два объема; создание конфигурации устройства с возможностью прохождения полимерного каркаса через нанопору, при этом устройство содержит датчик, выполненный с возможностью идентификации объектов, проходящих через нанопору; и определение с помощью датчика, был ли расщепляемый линкер расщеплен, с выявлением тем самым присутствия или отсутствия целевых молекулы или фактора в образце.

Согласно некоторым вариантам осуществления полимерный каркас содержит молекулу, выбранную из группы, состоящей из дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), дендримера, пептидной нуклеиновой кислоты (PNA), рибонуклеиновой кислоты (РНК), полипептида, наностержня, нанотрубки, гибрида холестерин/ДНК и гибрида ДНК/РНК.

Согласно некоторым вариантам осуществления расщепляемый домен содержит молекулу, выбранную из группы, состоящей из дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), рибонуклеиновой кислоты (РНК) и полипептида. Согласно некоторым вариантам осуществления целевые молекула или фактор специфически расщепляют связь расщепляемого домена, выбранную из группы, состоящей из связи углерод-кислород, связи углерод-сера, связи углерод-азот и связи углерод-углерод.

Согласно некоторым вариантам осуществления расщепляемый домен фотолитически расщепляется в присутствии целевых молекулы или фактора, и при этом расщепляемый домен содержит молекулу, выбранную из группы, состоящей из производного орто-нитробензила и производного сложного фенацилового эфира. Согласно некоторым вариантам осуществления расщепляемый домен химически расщепляется в присутствии целевых молекулы или фактора, и при этом расщепляемый домен содержит молекулу, выбранную из группы, состоящей из азосоединения, дисульфидного мостика, сульфона, этиленгликольдисукцината, гидразона, ацеталя, имина, винилового эфира, вицинального диола или сложного пиколинатного эфира.

Согласно некоторым вариантам осуществления устройство содержит по меньшей мере две нанопоры, соединенных последовательно, и при этом полимерный каркас находится одновременно по меньшей мере в двух нанопорах в ходе транслокации.

Согласно некоторым вариантам осуществления настоящий документ относится к способу количественного определения целевых молекулы или фактора, как предполагается, присутствующих в образце, при этом способ предусматривает введение образца в контакт с молекулой слияния, полимерным каркасом и молекулярным грузом, при этом молекула слияния содержит расщепляемый линкер, при этом расщепляемый линкер специфически расщепляется в присутствии целевых молекулы или фактора, домен связывания с полимерным каркасом и домен связывания с молекулярным грузом; загрузку молекулы слияния, полимерного каркаса, молекулярного груза и образца в устройство, содержащее нанопору, при этом нанопора разделяет внутреннее пространство устройства на два объема; создание конфигурации устройства с возможностью прохождения полимерного каркаса через нанопору, при этом устройство содержит датчик, выполненный с возможностью идентификации объектов, проходящих через нанопору; определение с помощью датчика, связывается ли полимерный каркас с молекулярным грузом, с выявлением тем самым присутствия или отсутствия целевой молекулы; и оценивание концентрации или активности целевых молекулы или фактора, как предполагается, присутствующих в образце, с использованием значений измерения датчика.

Согласно некоторым вариантам осуществления определение концентрации или активности предусматривает задание числового уровня достоверности для выявления целевых молекулы или фактора, как предполагается, присутствующих в образце. Согласно некоторым вариантам осуществления стадии введения образца в контакт с молекулой слияния, загрузки молекулы слияния, полимерного каркаса, молекулярного груза и образца в устройство, создания конфигурации устройства и определения, связывается ли полимерный каркас с молекулярным грузом, повторяют с варьированием концентраций или активности одного или нескольких из полимерного каркаса, молекулы слияния, молекулярного груза или целевых молекулы или фактора в образце.

Также настоящий документ относится к способу количественного определения целевой молекулы, как предполагается, присутствующей в образце, при этом способ предусматривает введение образца в контакт с молекулой слияния, содержащей расщепляемый линкер, при этом расщепляемый линкер специфически расщепляется в присутствии целевой молекулы; загрузку образца в устройство, содержащее нанопору, при этом нанопора разделяет внутреннее пространство устройства на два объема; создание конфигурации устройства с возможностью пропускания полимерного каркаса через нанопору, при этом первая часть молекулы слияния связывается с полимерным каркасом, при этом вторая часть молекулы слияния связывается с молекулярным грузом, и при этом устройство содержит датчик, выполненный с возможностью идентификации объектов, проходящих через нанопору; определение с помощью датчика, был ли расщепляемый линкер расщеплен, с выявлением тем самым присутствия или отсутствия целевой молекулы в образце; и оценивание концентрации целевых молекулы или фактора, как предполагается, присутствующих в образце, с использованием значений измерения датчика.

Согласно некоторым вариантам осуществления определение концентрации предусматривает задание числового уровня достоверности для выявления целевых молекулы или фактора, как предполагается, присутствующих в образце. Согласно некоторым вариантам осуществления стадии введения образца в контакт с молекулой слияния, загрузку образца в устройство, создания конфигурации устройства и определения, был ли расщепляемый линкер расщеплен, повторяют с варьированием концентраций или активности одного или нескольких из полимерного каркаса, молекулы слияния, молекулярного груза или целевых молекулы или фактора в образце.

Также настоящий документ относится к набору, содержащему устройство, содержащее нанопору, при этом нанопора разделяет внутреннее пространство устройства на два объема, а конфигурация устройства выполнена с возможностью прохождения нуклеиновой кислоты через одну или несколько пор, при этом устройство содержит датчик для каждой поры, который выполнен с возможностью идентификации объектов, проходящих через нанопору; молекулу слияния, содержащую расщепляемый линкер, при этом расщепляемый линкер специфически расщепляется в присутствии целевой молекулы; молекулярного груза; полимерный каркас и инструкции по применению для выявления присутствия или отсутствия целевой молекулы в образце.

Согласно некоторым вариантам осуществления молекула слияния связывается с молекулярным грузом. Согласно некоторым вариантам осуществления молекула слияния связывается с полимерным каркасом.

Краткое описание чертежей

Вышеупомянутые и другие объекты, признаки и преимущества станут очевидны из следующего описания конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения, иллюстрированных в прилагаемых графических материалах, на которых одинаковые ссылочные позиции относятся к одним и тем же частям на разных видах. Графические материалы не всегда масштабируются, вместо этого делается упор на иллюстрации принципов различных вариантов осуществления настоящего изобретения. Кроме того, в качестве вариантов осуществления настоящего раскрытия в графических материалах представлены данные, которые исключительно иллюстрируют признаки, а не ограничивают.

На фиг. 1 изображен вариант осуществления молекулы слияния с расщепляемым линкером, слияние, связанное с нагрузкой, и слияние, связанное с каркасом, захваченным в нанопоре.

На фиг. 2 изображен один способ использования комплекса каркас : слияние : молекулярный груз для выявления ферментативной активности с использованием системы нанопор.

На фиг. 3 изображен способ использования линейной каркасной молекулы для выявления эндонуклеазной активности с помощью нанопоры.

На фиг. 4 изображен способ использования кольцевой каркасной молекулы для выявления эндонуклеазной активности с помощью нанопоры.

На фиг. 5 изображен способ выявления мультиплексного выявления эндонуклеазной активности с помощью нанопоры с использованием целевой молекулы с несколькими целевыми сайтами.

На фиг. 6А, 6В и 6С изображен конкретный пример расщепляемого линкера, восприимчивого к протеолитическому разложению матричной металлопротеиназой-9 (ММР9), который включен в молекулу слияния. Линкерный компонент молекулы слияния присоединяется к нагрузке PEG-биотин (фиг. 6А) или к нагрузке PEG-биотин-монострептавидин, которая больше по размеру (фиг. 6В). Молекула слияния содержит азидную химическую группу (N₃), способную химически соединяться с каркасной молекулой ДНК посредством клик-химии (фиг. 6С).

На фиг. 7 показан пример протеолитического разложения линкера, расщепляемого с помощью ММР9. При инкубации с образцом, содержащим ММР9, чувствительная к протеазе конструкция расщепляется на два отдельных фрагмента.

На фиг. 8 изображены схематические профили тока трех молекул из примеров при прохождении через нанопору, значения импеданса которых указывают на то, был ли расщепляемый линкер протеолитически разложен или нет. Более глубокий и более длительный профиль токового импеданса интактного комплекса каркас ДНК : слияние : нагрузка, показанный на панели А, указывает на то, что расщепляемый линкер не был разложен с помощью ММР9. Более короткие и/или неглубокие профили токового импеданса показаны на панелях В и С для двух фрагментов после расщепления расщепляемого линкера с помощью ММР9, при этом фрагменты меньше полного комплекса каркас : слияние : нагрузка, и, поэтому, препятствуют снижению тока при прохождении каждого через нанопору.

На фиг. 9А изображен конкретный пример двухнитевой ДНК, которая содержит каркасную молекулу и часть молекулы слияния, которая содержит специфическую последовательность ДНК, восприимчивую к расщеплению представляющей интерес эндонуклеазой. Молекула слияния также содержит дибензоциклооктиновую (DBCO) химическую «ручку» для конъюгации в 5'-3' направлении с молекулярным грузом посредством не содержащей медь клик-химии. На фиг. 9В показано, что DBCO «ручка» конъюгирована с нагрузкой PEG-биотин.

На фиг. 10 изображен конкретный пример разложения последовательности расщепляемого домена, включенной в линкерный участок ДНК, эндонуклеазой Eco81I. При инкубации полной конструкции каркас : молекула слияния : нагрузка с образцом, содержащим Eco81I, специфическая последовательность, распознаваемая эндонуклеазой в расщепляемом домене, расщепляется, что дает в результате два отдельных фрагмента.

На фиг. 11 изображены схематические профили тока трех молекул из примеров, значения импеданса которых указывают на то, была ли последовательность (т.е. расщепляемый домен), кодированная в компоненте слияния ДНК, разложена эндонуклеазой или нет. На панели А изображен схематический профиль тока интактного комплекса каркас : слияние : нагрузка при прохождении через нанопору, при этом большой импеданс полной молекулярной конструкции указывает на то, что эндонуклеаза не расщепила последовательность расщепляемого домена. На панели В изображен схематический профиль тока остальной части каркаса ДНК после инкубации и расщепления с помощью Eco81I, что обеспечивает более мелкий и/или более быстрый профиль события при прохождении через нанопору. На панели С изображен схематический профиль тока, соответствующий остальному фрагменту, который проходит через нанопору и который не связывается с каркасом.

На фиг. 12А изображен пример конструкции, в которой одно слияние содержит два разных расщепляемых ферментом линкера для выявления активности фермента: расщепляемый линкер, восприимчивый к протеолитическому разложению с помощью ММР9, и специфическая последовательность, распознаваемая и расщепляемая эндонуклеазой Eco81I. На фиг. 12В представлена способ расщепления линкера последовательности ДНК путем присутствия активной эндонуклеазы Eco81I, при этом расщепляемый линкер остается интактным при отсутствии активной ММР9. При инкубации полной конструкции каркас : слияние : нагрузка с образцом, содержащим Eco81I, но без ММР9 специфическая последовательность, распознаваемая эндонуклеазой, расщепляется, что дает в результате два отдельных фрагмента. На фиг. 12С изображены схематические сигнатуры событий в нанопоре, предусматривающие (i) полную молекулярную конструкцию с (ii, iii) фрагментами после расщепления с помощью Есо8 II расщепляемого линкера.

На фиг. 13 представлена конъюгация чувствительной к протеазе молекулярной конструкции с помощью анализа изменения электрофоретической подвижности (EMSA). Двухнитевая каркасная ДНК 500 bp (дорожка 1) привязывается к слиянию, содержащему чувствительный к ММР9 расщепляемый линкер, который также привязывается к молекулярному грузу (дорожка 2, верхняя полоса). Для дополнительной массы нагрузки белок монострептавидин связывается с частью нагрузки комплекса (дорожка 3, верхняя полоса).

На фиг. 14 показан гель со сравнением электрофоретической подвижности чувствительной к протеазе конструкции до и после инкубации с протеазой ММР9. Каркасная ДНК 500 bp конъюгируется со слиянием, содержащим расщепляемый с помощью ММР9 линкер, который привязывается к нагрузке (дорожки 1 и 3). После инкубации с ММР9 конструкция демонстрирует увеличение электрофоретической подвижности, показанное сдвигом в полосе ДНК, что указывает на полное разложение расщепляемого линкера (дорожка 2).

На фиг. 15 показаны полученные в результате фрагменты чувствительной к эндонуклеазе конструкции до и после разложения с помощью Eco81I изошизомера SauI. Разложение с помощью Eco81I сайта в каркасной ДНК 500 bp, ковалентно связанной с нагрузкой, приводит к полному гидролизу по кодированной последовательности CC/T(N)AGG (включенной в часть слияния в ДНК 500 bp). Гидролиз дает два фрагмента, каркас 306 bp и комплекс слияние : нагрузка, содержащий ДНК 194 bp, привязанную к нагрузке (дорожка 3).

На фиг. 16 показано расщепление чувствительной к ММР9 конструкции при титровании мочи человека. Каркас 300 bp, привязанный к слиянию, сравниваемый с чувствительной к ММР9 конструкцией, связанной с нагрузкой (дорожка 5), инкубировали с ММР9 в присутствии повышающихся концентраций мочи, варьирующих от 0 до 30%. Эффективное расщепление происходит максимум в 5% моче (дорожка 2), тогда как полное ингибирование фермента проявляется в растворе с >15% мочи (дорожки 3 и 4), как показано отсутствием изменения в верхней полосе, что указывает на интактный комплекс каркас ДНК : слияние : нагрузка.

На фиг. 17 показано обнаружение отдельных молекул с помощью нанопористого устройства, (а) Типичное событие сдвига тока, вызванное прохождением dsDNA 3,2 kb через нанопору диаметром 27 нм при напряжении V=100 мВ (1 М LiCl). События количественно определяют по глубине сдвига проводимости (δG=δI/V) и длительности. (b) График рассеяния δG против длительности для 744 событий, зарегистрированных за 10 минут.

На фиг. 18 сравниваются характеристики событий в нанопоре для ДНК отдельно (500 bp), комплекс ДНК : нагрузка и комплекс ДНК : нагрузка-монострептавидин (ДНК : нагрузка-MS). ДНК : нагрузка обеспечивает повышение числа событий с δG>1 нСм по сравнению с ДНК отдельно. Добавление MS к ДНК : нагрузка дополнительно увеличивает глубину и длительность сигнатур событий, как видно по (а) графику рассеяния δG против длительности и по (b) процентному отношению событий с δG>1 нСм.

На фиг. 19 сравнивается событие в нанопоре для каркасной ДНК отдельно (300 bp), комплекс ДНК : слияние : нагрузка и комплекс ДНК : слияние : нагрузка после активности протеазы ММР9 с расщепляемым с помощью ММР9 линкером, включенным в молекулу слияния. Процентное отношение событий, длящихся дольше 0,1 мс, обеспечивает сигнатуру, с которой можно выявить активность фермента ММР9 с доверительностью 99%.

На фиг. 20 сравнивается событие в нанопоре для ДНК отдельно (500 bp), комплекс каркас : слияние : нагрузка и комплекс каркас : слияние : нагрузка после инкубации с эндонуклеазой Eco81I с расщепляемым линкером ДНК для Eco81I, включенной в часть слияния в ДНК. Процентное отношение событий, длящихся дольше 0,06 мс, обеспечивает сигнатуру, с которой можно выявить активность фермента Eco81I с доверительностью 99%.

Подробное описание изобретения

Текст настоящей заявки относится к различным вариантам осуществления устройств, композиций, систем и способов в соответствии с настоящим изобретением. Различные описанные варианты осуществления предназначены для обеспечения множества иллюстративных примеров и не должны рассматриваться как описания альтернативных объектов. Скорее, следует отметить, что описания различных вариантов осуществления, представленных в настоящем документе, могут относиться к перекрывающимся объектам. Варианты осуществления, обсуждаемые в настоящем документе, являются исключительно иллюстративными и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.

Также во всем настоящем раскрытии различные публикации, патенты и опубликованные описания патентов упоминаются путем идентифицирующего цитирования. Раскрытия этих публикаций, патентов и опубликованных описаний патентных документов тем самым включены посредством ссылки в настоящее раскрытие во всей своей полноте.

Используемый в настоящем документе термин «содержащий» означает, что системы, устройства и способы предусматривают перечисленные компоненты или стадии, но не исключают иные. Термин «состоящий в основном из» при использовании для определения систем, устройств и способов означает исключение других компонентов или стадий какой-либо существенной значимости для комбинации. Термин «состоящий из» означает исключение иных компонентов или стадий. Варианты осуществления, определяемые каждым из этих переходных терминов, охватываются объемом настоящего изобретения.

Все числовые обозначения, например, расстояние, размер, температура, время, напряжение и концентрация, в том числе диапазоны, являются аппроксимациями, которые варьируют (+) или (-) с шагом 0,1. Следует учитывать, хотя это не всегда четко указано, что всем числовым обозначениям предшествует термин «приблизительно». Также следует учитывать, хотя это не всегда четко указано, что компоненты, описываемые в настоящем документе, являются исключительно иллюстративными, и что их эквиваленты известны в уровне техники.

Используемая в настоящем документе фраза «устройство, содержащее нанопору, которая отделяет внутреннее пространство» относится к устройству, имеющему пору, которая содержит отверстие в структуре, структуру, разделяющую внутреннее пространство на два объема или камеры. Устройство также может иметь более чем одну нанопору с одной общей камерой между каждой парой пор.

Используемый в настоящем документе термин «молекула слияния» относится к молекулам или соединениям, которые содержат расщепляемый линкер, чувствительный к ферментативному, фотолитическому или химическому расщеплению целевой молекулой или целевым фактором, как предполагается, присутствующими в образце. Слияние также связывается с полимерным каркасом и молекулярным грузом. При транслокации через нанопору сигнатура тока определяет, связан ли молекулярный груз с полимерным каркасом или нет. Таким образом, расщепление расщепляемого линкера в молекуле слияния может быть определено и/или выражено количественно.

Используемый в настоящем документе термин «расщепление» относится к способу или фактору, который разрушает химическую связь с разделением молекулы или соединения на более простые структуры. Молекула (например, фермент) или ряд факторов, (например, фотолиз) при контакте с расщепляемым линкером, как описывается в настоящем документе, может приводить к расщеплению линкера с образованием расщепленного линкера. Как используется в настоящем документе, специфическое расщепление относится к известной взаимосвязи между линкером и целевым ферментом или фактором, при этом известно, что целевые молекула или фактор расщепляют расщепляемый линкер. Таким образом, молекула или цель специфически расщепляет линкер, если расщепление линкера может быть использовано для заключения о присутствии целевых молекулы или фактора.

Используемый в настоящем документе термин «расщепляемый линкер» или «лабильный линкер» относится к субстратному линкеру, чувствительному к ферментативному, фотолитическому или химическому расщеплению целевой молекулой или фактором. Согласно некоторым вариантам осуществления расщепляемым линкером может быть дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК), полипептид, связь углерод-кислород, связь углерод-сера, связь углерод-азот или связь углерод-углерод. Согласно некоторым вариантам осуществления расщепляемым линкером, чувствительным к фотолитическому расщеплению, может быть производное орто-нитробензила или производное сложного фенацилового эфира. Согласно некоторым вариантам осуществления расщепляемым линкером, чувствительным к химическому расщеплению, могут быть азосоединения, дисульфидный мостик, сульфон, этиленгликольдисукцинат, гидразон, ацеталь, имин, виниловый эфир, вицинальный диол или сложный пиколинатный эфир.

Согласно некоторым вариантам осуществления используемый в настоящем документе термин «расщепляемый домен» относится к домену молекулы, которая чувствительна к ферментативному, фотолитическому или химическому расщеплению целевой молекулой или фактором. Термин «расщепляемый домен» может быть использован взаимозаменяемо с термином «расщепляемый линкер», если расщепляемый домен является компонентом молекулы того же типа, что и полимерный каркас или молекулярный груз. Например, согласно вариантам осуществления, в которых расщепляемый домен находится в полимерном каркасе, также можно представить полимерный каркас как содержащий полимерный каркас и молекулу слияния, содержащую расщепляемый линкер (т.е. расщепляемый домен), при этом молекула слияния связывается с полимерным каркасом, даже если молекула слияния и полимерный каркас являются молекулами одного и того же типа (например, dsDNA).

Используемый в настоящем документе термин «целевая молекула» означает представляющую интерес молекулу, подлежащую определению в образце, и относится к молекуле (например, гидролазе или лиазе) способной расщеплять (например, путем ферментативного расщепления) расщепляемый линкерный участок или домен. Целевая молекула может быть выявлена способом, описываемым в настоящем документе, через расщепление ею расщепляемого линкера в молекуле слияния, связанной с полимерным каркасом, который транслоцируется через нанопору, обеспечивая определяемый токовый импеданс или сигнатуру тока.

Используемый в настоящем документе термин «целевой фактор» относится к фактору, способному фотолитически модифицировать расщепляемый линкер путем воздействия света в диапазоне длины волны от 10 нм до 550 нм. В качестве альтернативы, целевой фактор может быть способен химически модифицировать расщепляемый линкер путем воздействия нуклеофильных или основных реагентов, электрофильных или кислотных реагентов, восстановителей окислителей или металлорганического соединения.

Используемый в настоящем документе термин «каркас» или «полимерный каркас» относится к отрицательно или положительно заряженному полимеру, который транслоцируется через нанопору при приложении напряжения. Согласно некоторым вариантам осуществления полимерный каркас содержит расщепляемый домен или расщепляемый линкер. Согласно некоторым вариантам осуществления полимерный каркас способен связываться или связан с молекулой слияния, содержащей расщепляемый линкер, и способен транслоцироваться через пору при приложении напряжения. Согласно некоторым аспектам полимерный каркас содержит дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК), рибонуклеиновую кислоту (РНК), пептидную нуклеиновую кислоту (PNA), гибрид ДНК/РНК или полипептид. Каркас также может быть химически синтезированным полимером и не встречающейся в природе или биологической молекулой. Согласно предпочтительному варианту осуществления полимерным каркасом является dsDNA, что обеспечивает более предсказуемые сигналы при транслокации через нанопору и уменьшает вторичную структуру, имеющуюся у ssDNA или РНК. Согласно некоторым вариантам осуществления полимерный каркас содержит сайт связывания с молекулой слияния, который может располагаться на конце каркаса или на обоих концах каркаса. Каркас и молекула слияния могут быть соединены посредством ковалентной связи, водородной связи, ионной связи, силы Ван-дер-Ваальса, гидрофобного взаимодействия, катион-пи-взаимодействия, плоскостного стэкинг-взаимодействия или металлической связи. В качестве альтернативы, прямое ковалентное связывание компонента расщепляемого линкера с каркасом может соединять каркас и молекулу слияния. В качестве альтернативы, соединительный компонент слияния может присоединять расщепляемый линкер к каркасу посредством прямого ковалентного связывания. Согласно предпочтительному варианту осуществления молекула слияния содержит домен связывания с каркасом, которым может быть ДНК, РНК, PNA, полипептид, гибрид холестерин/ДНК или гибрид ДНК/РНК.

Используемый в настоящем документе термин «нагрузка» относится к молекулам или соединениям, которые связываются с молекулой слияния для усиления селективности и/или чувствительности выявления в нанопоре. Согласно некоторым вариантам осуществления молекулярный груз может быть дендример, двухнитевая ДНК, однонитевая ДНК, аптамер ДНК, флуорофор, белок, полипептид, наностержень, нанотрубка, фуллерен, молекула PEG, липосома или гибрид холестерин/ДНК. Согласно предпочтительным вариантам осуществления расщепляемый линкер и нагрузка соединяются непосредственно или опосредованно с помощью ковалентной связи, водородной связи, ионной связи, силы Ван-дер-Ваальса, гидрофобного взаимодействия, катион-пи-взаимодействия, плоскостного стэкинг-взаимодействия или металлической связи. Нагрузка увеличивает размер конструкции каркас : молекула слияния и облегчает выявление расщепления расщепляемого линкера, при этом комплекс каркас : слияние : нагрузка характеризуется заметно отличающуейся сигнатурой тока при прохождении через нанопору, чем остальные компоненты каркас : слияние и слияние : нагрузка, после расщепления расщепляемого линкера (например, расщепления расщепляемого линкера гидролизирующим ферментом).

Используемый в настоящем документе термин «домен связывания» относится к домену молекулы, которая специфически связывается с другой молекулой при присутствии этой молекулы. Согласно некоторым вариантам осуществления настоящий документ относится к домену связывания с полимерным каркасом, который специфически связывается с полимерным каркасом, и к домену связывания с молекулярным грузом, который специфически связывается с молекулярным грузом.

Используемый в настоящем документе термин «соединитель» относится к молекуле, которая действует в качестве мостика между двумя молекулами, пространственно отделенными друг от друга, что обеспечивает их связывание через соединитель. Согласно некоторым вариантам осуществления полиэтиленгликоль (PEG) может действовать в качестве соединителя, например, между молекулой слияния и полимерным каркасом или молекулой нагрузки.

Используемый в настоящем документе термин «нанопора» относится к отверстию (щели или каналу) достаточного размера, чтобы обеспечить прохождение полимеров определенных размеров. С усилителя напряжение подается для продвижения отрицательно заряженных полимеров через нанопору, и ток через пору выявляет, проходят ли через нее молекулы.

пособ по п.39, при котором загрузку указ «датчик» относится к устройству, которое собирает сигнал от нанопористого устройства. Согласно многим вариантам осуществления датчик включает в себя пару электродов, помещенных по двум сторонам поры для измерения ионного тока через пору, если молекула или другая частица, в частности, полимерный каркас, движется через пору. Кроме электродов может быть предусмотрен дополнительный датчик, например, оптический датчик, для выявления оптического сигнала в нанопористом устройстве. Другие датчики могут быть использованы для выявления таких свойств, как блокада тока, электронный туннельный ток, индуцированный зарядом эффект поля, время транзита через нанопору, оптический сигнал, рассеяние света и плазмонный резонанс.

Используемый в настоящем документе термин «измерение тока» относится к сериям измерений протекания тока при приложении напряжения на нанопору за время. Ток выражают как измерение для количественного определения событий, и ток, нормализованный по напряжению (проводимости), также используют для количественного определения событий.

Используемый в настоящем документе термин «открытый канал» относится к исходному уровню тока через канал нанопоры в шумовом диапазоне, при этом ток не отклоняется от порога значения, определяемого программным обеспечением анализа.

Используемый в настоящем документе термин «событие» относится к ряду измерений токового импеданса, который начинается, когда измерение тока отклоняется от значения открытого канала на определенный порог, и заканчивается, когда ток возвращается к порогу значения открытого канала.

Используемый в настоящем документе термин «сигнатура токового импеданса» относится к сбору измерений тока и/или паттернов, идентифицированных в обнаруженном событии. Событие также может предусматривать множество сигнатур для усиления различения типов молекул.

Выявление ферментативной активности

Настоящий документ относится к способам и композициям для выявления ферментативной активности с использованием модифицированного расщепляемого линкера. Как показано на фиг. 1, молекула сконструирована для выявления присутствия ферментативной активности каркаса, нагрузки и слияния, содержащего линкер, восприимчивый к разложению. Такая молекула каркас : слияние (линкер) : нагрузка может быть использована в системе нанопор для выявления присутствия ферментативной активности в образце. В частности, на фиг. 2 представлен схематический пример, демонстрирующий способ использования молекулы (фиг. 1) с нанопорой для выявления присутствия ферментативной активности. На фиг. 2 расщепляемым линкером является полипептидная последовательность, которая служит субстратом для протеазы. Если протеаза отсутствует в образце, то молекула каркас : слияние (линкер) : нагрузка будет оставаться интактной и генерировать более длинный и более глубокий сигнал при транслокации через нанопору при приложенном напряжении. Однако, если представляющая интерес протеаза присутствует в образце и является активной, то она будет разлагать полипептидную последовательность расщепляемого линкера с образованием отдельных молекул нагрузки и каркаса, каждая из которых будет генерировать индивидуальную сигнатуру блокады тока при прохождении этих молекул через нанопору при приложенном напряжении. Блокады тока и разрешение могут быть отрегулированы путем варьирования прилагаемого напряжения и других факторов (концентрация соли, рН, температура, геометрия нанопоры, материал нанопоры и т.д.). Разрешение ферментативной активности также может быть отрегулировано путем регулирования концентрации целевой молекулы в растворе в контакте с нанопорой.

Расщепляемые линкеры могут иметь разнообразные формы. Это выражается в специфичности целевого фермента по отношению к своему субстрату, что обеспечивает специфичность анализов активности с помощью нанопор в соответствии с настоящим изобретением. То есть фоновые молекулы из образца вряд ли смогут существенно модифицировать или разрезать расщепляемый линкер, тогда как целевые молекула или фактор обладают высокой аффинностью в отношении разрезания и/или модификации субстрата в той мере, в которой измерения нанопор могут различать и выявлять разрезание и/или модификацию.

Молекулярным грузом, описываемым в настоящем документе, может быть любая молекула, которая способствует выявлению модификации (например, расщепления) молекулы расщепляемого линкера в нанопоре. Она может включать в себя, например, дендример, аптамер ДНК, флуорофор, белок или полиэтиленгликолевый (PEG) полимер.

Расщепляемый линкер в компоненте слияния конструкции каркас : слияние : нагрузка может включать в себя любой субстрат, то есть субстрат активности представляющего интерес целевого фермента. Он может включать в себя, например, полипептидную последовательность, нуклеотидную последовательность или любой другой субстрат фермента. Этот линкер также может быть восприимчивым к расщеплению факторами окружающей среды (например, рН, UV и/или свет).

Согласно другому варианту осуществления конструкция каркас : слияние : нагрузка может быть уменьшена только до каркасной конструкции, в частности, если расщепляемый линкер содержит полинуклеотидную последовательность. Согласно таким вариантам осуществления каркас содержит двухнитевую ДНК. Это важно, например, для выявления бактериального загрязнения путем выявления эндонуклеазной активности, как показано на фиг. 3 и 4. Мишень эндонуклеазы, содержащая последовательность ДНК в каркасе ДНК, обеспечена в растворе в контакте с нанопорой. При отсутствии эндонуклеазы наблюдается более длинная сигнатура тока в ходе транслокации каждой целевой молекулы. При добавлении образца, содержащего представляющую интерес эндонуклеазу, целевая молекула разлагается, что дает в результате более короткие сигнатуры тока при транслокации разложенных фрагментов ДНК через нанопору при приложенном напряжении и снижает длительность сигнатуры тока от целевой последовательности полной длины. Для выявления эндонуклеазной активности могут быть использованы линейные (фиг. 3) или кольцевые (фиг. 4) каркасные молекулы.

Согласно другому варианту осуществления каркасная конструкция может быть использована для осуществления мультиплексного выявления бактериального загрязнения с помощью эндонуклеазной активности. Один пример такого способа показан на фиг. 5. В данном примере содержащий расщепляемый домен каркас содержит несколько уникальных расщепляемых доменов для разложения одной или несколькими представляющими интерес целевыми эндонуклеазами. Затем полученные в результате фрагменты выявляют в растворе с помощью системы нанопор. Транслокация разложенных фрагментов при приложенном напряжении обеспечивает индивидуальные сигнатуры тока через пору соответствующего размера, что обеспечивает выявление того, какие сайты были разложены, и, следовательно, какие эндонуклеазы присутствуют в представляющем интерес образце.

Согласно другим вариантам осуществления конструкция каркас : слияние : нагрузка, показанная на фиг. 1-2, также может быть использован для выявления активности эндонуклеазы. В этом случае молекула слияния содержит целевую последовательность ДНК и присоединяется к нагрузке, что облегчает выявление нанопорой разложения.

Мультиплексирование может быть достигнуто различными путями, например, путем присоединения более чем одной конструкции слияние : нагрузка к каждой молекуле каркаса. С такой конструкцией однопористое устройство может быть способно выявлять активность нескольких целевых молекул (например, ферментов) или целевых факторов для соответствующим образом сконструированных каркаса и конструкции(ий) слияние : нагрузка. В качестве альтернативы, может быть использована загрузка каркаса в двухпористое устройство (публикация РСТ № WO 2013/012881, включенная в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте) для анализа активности нескольких целевых молекул (например, ферментов) или целевых факторов.

«Статус активности» целевой молекулы или целевого фактора, как используется в настоящем документе, относится к тому, является ли расщепляемый линкер в молекуле слияния интактным (в результате чего комплекс каркас : слияние : нагрузка является полным) или нет (в результате чего каркасные молекулы не связаны с молекулярными грузами). По сути, статус активности может быть одним из этих двух потенциальных статусов.

Выявление статуса активности целевой молекулы или целевого фактора может быть осуществлено различными способами. Согласно одному аспекту в силу разных размеров молекул при каждом статусе при прохождении комплекса каркас : слияние : нагрузка через пору сигнатура тока будет достаточно отличаться от того, когда каркас отдельно или нагрузка отдельно проходит через пору. Согласно одному аспекту приложением положительного напряжения и концентрациями KCl, превышающими 0,4 М, или концентрациями LiCl, превышающими 0,2 М, в экспериментальном буфере измеряемые сигналы тока (фиг. 2) уменьшаются и, таким образом, ослабляются. Три сигнала на фиг. 2 могут быть дифференцированы друг от друга по величине сдвига тока (глубине) и/или по длительности сдвига тока (ширине) или по какому-либо другому признаку в сигнале, по которому дифференцируются три типа событий.

Согласно другому аспекту при прилагаемом положительном напряжении и концентрациях KCl менее 0,4 М в экспериментальном буфере измеряемые сигналы тока могут характеризоваться усилениями тока в отношении каркаса или любого компонента комплекса, содержащего ДНК. Это было продемонстрировано для ДНК отдельно в опубликованном исследовании Smeets, Ralph MM, et al. "Salt dependence of ion transport and DNA translocation through solid-state nanopores." Nano Letters 6.1 (2006): 89-95. В этом случае три типа сигналов могут быть дифференцированы по направлению амплитуды (полярности) события относительно исходного уровня тока (408) открытого канала в дополнение к трем сигналам, обычно имеющим разные величины сдвига тока (высоту) и/или длительность сдвига тока (ширину), или по какому-либо другому признаку в сигнале, по которому дифференцируются три типа событий.

Согласно аспектам изображенных на фиг. 2 вариантов осуществления датчик содержит электроды, которые соединяются с источниками питания и могут выявлять ток. Либо один, либо оба электрода, следовательно, служат датчиком. Согласно данному варианту осуществления фиксацию напряжения или фиксацию потенциала используют для одновременной подачи напряжения на пору и измерения тока через пору.

Согласно некоторым аспектам нагрузку добавляют к комплексу с целью выявления. Согласно одному аспекту нагрузка предусматривает заряд, либо отрицательный, либо положительный, для облегчения выявления. Согласно другому аспекту нагрузка добавляет размер для облегчения выявления. Согласно другому аспекту нагрузка включает в себя выявляемую метку, такую как флуорофор, которая может быть выявлена, например, с помощью оптического датчика, сфокусированного на участке транслокации через нанопору.

Полимерный каркас

Полимерным каркасом, подходящим для применения в технологии в соответствии с настоящим изобретением, является каркас, который может быть загружен в нанопористое устройство и может проходить через пору от одного конца к другому.

Неограничивающие примеры полимерных каркасов включают в себя нуклеиновые кислоты, такие как дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК), рибонуклеиновая кислота (РНК) или пептидная нуклеиновая кислота (PNA), дендримеры и линеаризованные белки или пептиды. Согласно некоторым аспектам ДНК или РНК может быть однонитевой или двухнитевой или может быть гибридной молекулой ДНК/РНК.

Согласно предпочтительному варианту осуществления двухнитевую ДНК используют в качестве полимерного каркаса. dsDNA имеет несколько преимуществ над ssDNA в качестве полимерного каркаса. В целом, ssDNA более присущи неспецифические взаимодействия и образование непредсказуемой вторичной структуры, что делает dsDNA более подходящей для генерирования воспроизводимых сигнатур тока в нанопористом устройство. Кроме того, упругая реакция ssDNA является более сложной, чем у dsDNA, и свойства ssDNA менее изучены, чем свойства dsDNA. Следовательно, многие варианты осуществления настоящего изобретения предусматривают dsDNA в качестве полимерного каркаса, включающего в себя одну или несколько молекул нагрузки и/или слияния, используемых в настоящем документе.

Согласно одному аспекту полимерный каркас является синтетическим или химически модифицированным. Химическая модификация может помочь в стабилизации полимерного каркаса, добавить заряды полимерному каркасу для повышения подвижности, сохранить линейность либо добавить или модифицировать специфичность связывания, либо добавить химически реактивные сайты, к которым могут быть привязаны слияние и/или нагрузка. Согласно некоторым аспектам химическая модификация представляет собой ацетилирование, метилирование, сумоилирование, окисление, фосфорилирование, гликозилирование, тиолирование, добавление азидов или алкинов, или активированных алкинов (DBCO-алкина) или добавление биотина.

Согласно некоторым аспектам полимерный каркас является электрически заряженным. ДНК, РНК, PNA и белки, как правило, являются заряженными при физиологических условиях. Такие полимерные каркасы могут быть дополнительно модифицированы с увеличением или уменьшением носимого заряда. Другие полимерные каркасы могут быть модифицированы с введением зарядов. Заряды полимерного каркаса могут быть полезны для управления полимерным каркасом при прохождении через пору нанопористого устройства. Например, заряженный полимерный каркас может двигаться через пору благодаря приложению напряжения на поры.

Согласно некоторым аспектам при введении зарядов в полимерный каркас заряды могут быть добавлены на концы полимерного каркаса. Согласно некоторым аспектам заряды распределяются равномерно по полимерному каркасу.

Конструирование комплекса каркас : слияние : нагрузка

Согласно предпочтительному варианту осуществления молекула слияния содержит: 1) расщепляемый линкер, 2) сайт присоединения к каркасу и 3) сайт присоединения к нагрузке.

Согласно предпочтительному варианту осуществления типичный пример комплекса слияние : нагрузка показан на фиг. 6. В частности, на фиг. 6А показано слияние со следующими компонентами, слева направо: азидная химическая «ручка» для присоединения к каркасу, соединитель PEG₄, гибкий мотив Gly-Ser, чувствительная к ММР9 пептидная последовательность SGKGPRQITA и гибкий мотив Gly-Ser для присоединения к нагрузке. На фиг. 6А показана нагрузка со следующими компонентами, слева направо: Cys-5-кДа PEG и биотин. Добавления массы нагрузке для облегчения выявления активности становится возможным путем связывания монострептавидина с сайтом биотина (фиг. 6В). Добавленная масса может обеспечивать более четкую разницу сигнатур между комплексом каркас : слияние : нагрузка до ферментативной активности и каркасом отдельно, и нагрузкой отдельно после ферментативной активности.

Согласно данному варианту осуществления пептидной последовательностью расщепляемого линкера в этом примере является SGKGPRQITA. Этот пептид ранее был идентифицирован как высокочувствительный к активности ММР9 (Kridel, Steven J., et al. "Substrate hydrolysis by matrix metalloproteinase-9. Journal of Biological Chemistry 276.23 (2001): 20572-20578).

Согласно данному варианту осуществления присоединение к каркасу ДНК может быть достигнуто различными путями. В этом примере (фиг. 6) ДНК может быть создана с использованием модифицированного дибензоциклооктином (DBCO) праймера, эффективно метящего все молекулы каркаса ДНК химической группой DBCO, подлежащий использованию для целей конъюгации с помощью не содержащей медь клик-химии с меченной азидом молекулой слияния, что дает полный комплекс каркас : слияние : нагрузка (фиг. 6С).

Что касается типичного примера (фиг. 6), активность ММР9 может быть проанализирована путем объединения образца, содержащего ММР9, с реагентом каркас : слияние : нагрузка и после периода, достаточного для осуществления активности, и в условиях, которые обеспечивают активность (фиг. 7), при этом объединенные реагенты могут быть измерены с помощью нанопоры (фиг. 8). Активность анализируют с помощью измерений одной молекулы, обеспечиваемых нанопорой, при этом полный комплекс дает более глубокую и более длинную сигнатуру события, тогда как продукты дают более быстрые и/или более мелкие сигнатуры события, как показано на фиг. 8.

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления типичный пример конструкции каркас : слияние : нагрузка показан на фиг. 9. В частности, на фиг. 9А показана конструкция каркас : слияние со следующими компонентами, слева направо: (1) каркас, содержащий ДНК; слияние, содержащее (3) последовательность ДНК, которая восприимчива к гидролитическому разложению эндонуклеазой, и (2) дибензоциклооктиновая (DBCO) «ручка», которая может быть использована для конъюгации с несущей азид молекулой в качестве нагрузки (не показано). Последовательность ДНК, которая является восприимчивой к гидролитическому разложению, представляет собой распознаваемую SauI последовательность. На фиг. 9В показана нагрузка, связанная с молекулой из фиг. 9А, содержащей Cys-5 кДа PEG и биотин.

Что касается типичного примера (фиг. 9), активность ММР9 может быть проанализирована путем объединения образца, содержащего Eco81I, с реагентом каркас : слияние : нагрузка, после периода, достаточного для осуществления активности, и в условиях, которые обеспечивают активность (фиг. 10), при этом объединенные реагенты могут быть измерены с помощью нанопоры (фиг. 11). При воздействии Eco81I изошизомера SauI молекулярная конструкция гидролизуется по последовательности ДНК CCT(N)AGG с расщеплением тем самым конструкции надвое. Активность анализируют с помощью измерений одной молекулы, обеспечиваемых нанопорой, при этом полный комплекс дает более глубокую и более длинную сигнатуру события, тогда как продукты дают более быстрые и/или более мелкие сигнатуры события, как показано на фиг. 11.

Согласно другому варианту осуществления молекула слияния конструкции каркас : слияние : нагрузка содержит два или более расщепляемых линкера для выявления и количественного определения ферментативной активности. В типичном примере (фиг. 12) слияние содержит: i) последовательность ДНК CCT(N)AGG, которая восприимчива к гидролитическому разложению эндонуклеазой Eco81I и которая прилегает к каркасу ДНК, и ii) чувствительную к ММР9 пептидную последовательность SGKGPRQITA. Таким образом, может быть использован один реагент для выявления присутствия либо ММР-9, либо Eco81I.

Согласно другому варианту осуществления сайтом присоединения к каркасу молекулы слияния может быть нуклеиновая кислота или полипептид, которые сами по себе могут служить доменом связывания с каркасом. Согласно некоторым вариантам осуществления доменом связывания с каркасом в слиянии является пептидная последовательность, образующая функциональную часть белка, хотя домен связывания не обязательно должен быть белком. В отношении нуклеиновых кислот, например, существуют белки, которые специфически распознают и связывают последовательности (мотивы), такие как промоторы, энхансеры, димеры тимин-тимин и некоторые вторичные структуры, такие как изогнутый нуклеотид, и последовательности с разрывом одной нити.

Согласно некоторым аспектам каркас-домен в слиянии включает в себя химическую модификацию, которая вызывает или облегчает распознавание и связывание. Например, метилированные последовательности ДНК могут быть распознаны факторами транскрипции, ДНК-метилтрансферазами или репаративными ферментами метилирования. Согласно другим вариантам осуществления биотин может быть включен в представителей семейства авидина или может распознаваться ими. Согласно таким вариантам осуществления биотин образует домен связывания со слиянием, и авидин или представитель семейства авидина является доменом связывания с полимерным каркасом в слиянии. Благодаря их комплементарности связывания домены связывания со слиянием и домены полимерного каркаса могут быть перевернуты так, что домен связывания со слиянием становится доменом связывания с полимерным каркасом и наоборот.

Молекулы, в частности, белки, которые способны специфически распознавать мотивы связывания с нуклеотидом, известны в уровне техники. Например, домены белков, такие как «спираль-поворот-спираль», «цинковый палец», «лейциновая застежка», «крылатая спираль», «крылатая спираль-поворот-спираль», «спираль-петля-спираль» и HMG-бокс, как известно, способны связываться с нуклеотидными последовательностями.

Согласно некоторым аспектам доменами связывания со слиянием могут быть запертые нуклеиновые кислоты (LNA), мостиковые нуклеиновые кислоты (BNA), белковые нуклеиновые кислоты всех типов (например, bisPNA, гамма-PNA), эффекторные нуклеазы, подобные активаторам транскрипции (TALEN), кластерные короткие палиндромные повторы, разделенные регулярными промежутками (CRISPR), или аптамеры (например, ДНК, РНК, белок или их комбинации).

Согласно некоторым аспектам доменами связывания со слиянием являются один или несколько из связывающих ДНК белков (например, белков типа «цинковый палец»), фрагментов антител (Fab), химически синтезированных связующих (например, PNA, LNA, TALENS или CRISPR) или химической модификации (т.е. реактивных фрагментов) в синтетическом полимерном каркасе (например, тиолат, биотин, амины, карбоксилаты).

Согласно некоторым вариантам осуществления полимерный каркас включает в себя последовательности доменов связывания со слиянием, которые используются для мультиплексирования ферментативной активности, при этом каждый домен имеет уникальную конструкцию слияние : нагрузка, содержащую уникальный расщепляемый линкер для представляющего интерес целевого фермента.

Целевые молекулы и факторы

Ферментативная активность, присутствующая в образце, может указывать на присутствие токсинов, нарушение или другой фактор в организм. Например, протеазы являются чрезвычайно важными обнаруженными у людей молекулами, которые регулируют широкий ряд нормальных физиологических процессов у человека, в том числе заживление ран, клеточная сигнализация и апоптоз. Из-за ее важной роли в организме человека патологическая протеазная активность была ассоциирована с рядом болезненных состояний, в том числе без ограничения с ревматоидным артритом, болезнью Альцгеймера, сердечно-сосудистым заболеванием и широким диапазоном злокачественных новообразований. Протеазы встречаются почти во всех жидкостях и тканях человека, и уровни их активности могут сигнализировать о наличии состояния.

Ценность анализа в соответствии с настоящим изобретением заключается в том, что он обеспечивает одномолекулярный способ выявления присутствия любого активного фермента (в том числе протеаз), который расщепляет ассоциированный с ним специфически расщепляемый линкер путем разрушения химической связи, например, с помощью гидролиза или некоторых других средств.

Целевой молекулой, способной ферментативно модифицировать участок расщепляемого ею линкера, может быть гидролаза. Согласно некоторым вариантам осуществления гидролаза может принадлежать подклассу протеаз, эндонуклеаз, гликозилаз, эстераз, нуклеаз, фосфодиэстераз, липазы, фосфатаз или какому-либо другому подклассу гидролаз.

Согласно другим вариантам осуществления целевой молекулой, способной ферментативно модифицировать участок расщепляемого ею линкера, может быть лиаза. Согласно некоторым вариантам осуществления лиазы могут принадлежать любому из семи подклассов: лиазы, которые расщепляют связи углерод-углерод, такие как декарбоксилазы (Enzyme Commission (ЕС) 4.1.1), альдегидлиазы (ЕС 4.1.2), лиазы оксокислот (ЕС 4.1.3) и другие (ЕС 4.1.99); лиазы, которые расщепляют связи углерод-кислород, такие как дегидратазы (ЕС 4.2); лиазы, которые расщепляют связи углерод-азот (ЕС 4.3); лиазы, которые расщепляют связи углерод-сера (ЕС 4.4); лиазы, которые расщепляют связи углерод-галид (ЕС 4.5); лиазы, которые расщепляют связи фосфор-кислород, такие как аденилатциклаза и гуанилатциклаза (ЕС 4.6); и другие лиазы, такие как феррохелатазы (ЕС 4.99).

Согласно другим вариантам осуществления участок расщепляемого линкера молекулы слияния в конструкции каркас : слияние : нагрузка подвергают воздействию целевого фактора, подлежащего определению. Согласно одному варианту осуществления целевой фактор способен фотолитически модифицировать расщепляемый линкер путем воздействия света в диапазоне длины волны от 10 нм до 550 нм.

Факторы светового воздействия, которые обеспечивают разрушение связей в расщепляемом линкере, могут выявлять условия окружающей среды, которые могут быть связаны с рядом различных опасностей для здоровья, факторов или вызывающих заболевание, или обеспечивающих заболевание состояний.

Ультрафиолетовое излучение (UV), исходящее из солнца, как известно, сильно коррелирует с различными состояниями человека, и истощение озона в стратосфере с течением времени, как полагают, приводит к повышению уровней ультрафиолетовой радиации, которая достигает поверхности Земли.

UV радиация накапливается в течение жизни и, как было показано, является основным фактором, способствующим меланоме, смертельной форме злокачественной опухоли кожи. Кроме того, UV свет оказывает глубокое воздействие на человеческий глаз и, как было показано, усиливает разрушение сетчатки, а также является важным фактором риска катаракты.

Согласно другим вариантам осуществления целевой фактор способен химически модифицировать расщепляемый линкер путем воздействия нуклеофильных или основных реагентов, электрофильных или кислотных реагентов, восстановителей, окислителей или металлорганического соединения.

Выявление целевого фактора, способного химически модифицировать расщепляемый линкер, находит множество применений, в том числе выявление процессов, которые сигнализируют об изменениях токсикологии, загрязнения грунтовых вод или об обнаружении биологической опасности или биотоксина.

Согласно одному варианту осуществления целевым фактором, способным химически модифицировать расщепляемый линкер, является кислотный рН. Хорошо известно, что локальные кислотные условия коррелируются с различными болезненными состояниями, такими как опухоли, ишемия и воспаление. Более конкретно, в опухолевой ткани кислотный внеклеточный рН является результатом анаэробного гликолиза быстро делящихся опухолевых клеток и является основным признаком опухолевого микроокружения.

Нанопористые устройства

Нанопористое устройство, как предусмотрено, включает в себя по меньшей мере пору, которая образует отверстие в структуре, разделяющей внутреннее пространство устройства на два объема, и по меньшей мере датчик, выполненный с возможностью идентификации объектов (например, путем выявления изменений параметров, указывающих на объекты), проходящих через пору. Нанопористые устройства, используемые для способов, описываемых в настоящем документе, также раскрываются в публикации РСТ № WO 2013/012881, включенной посредством ссылки во всей своей полноте.

Пора(ы) в нанопористом устройстве является наноразмерной или микроразмерной. Согласно одному аспекту каждая пора имеет размер, который позволяет проходить мелким или крупным молекуле или микроорганизму. Согласно одному аспекту каждая пора имеет диаметр по меньшей мере приблизительно 1 нм. В качестве альтернативы, каждая пора имеет диаметр по меньшей мере приблизительно 2 нм, 3 нм, 4 нм, 5 нм, 6 нм, 7 нм, 8 нм, 9 нм, 10 нм, 11 нм, 12 нм, 13 нм, 14 нм, 15 нм, 16 нм, 17 нм, 18 нм, 19 нм, 20 нм, 25 нм, 30 нм, 35 нм, 40 нм, 45 нм, 50 нм, 60 нм, 70 нм, 80 нм, 90 нм или 100 нм.

Согласно одному аспекту диаметр поры составляет не более приблизительно 100 нм. В качестве альтернативы, диаметр поры составляет не более приблизительно 95 нм, 90 нм, 85 нм, 80 нм, 75 нм, 70 нм, 65 нм, 60 нм, 55 нм, 50 нм, 45 нм, 40 нм, 35 нм, 30 нм, 25 нм, 20 нм, 15 нм или 10 нм.

Согласно одному аспекту пора имеет диаметр, который составляет от приблизительно 1 нм до приблизительно 100 нм, или, в качестве альтернативы, от приблизительно 2 нм до приблизительно 80 нм, или от приблизительно 3 нм до приблизительно 70 нм, или от приблизительно 4 нм до приблизительно 60 нм, или от приблизительно 5 нм до приблизительно 50 нм, или от приблизительно 10 нм до приблизительно 40 нм, или от приблизительно 15 нм до приблизительно 30 нм.

Согласно некоторым аспектам нанопористое устройство дополнительно включает в себя средство продвижения полимерного каркаса через пору и/или средство для идентификации объектов, которые проходят через пору. Дополнительные подробности представлены ниже и описаны в контексте двухпористого устройства.

По сравнению с однопористым нанопористым устройством двухпористое устройство может иметь более простую конфигурацию с возможностью обеспечения хорошего контроля скорости и направления движения полимерного каркаса через поры.

Согласно одному варианту осуществления нанопористое устройство включает в себя множество камер, при этом каждая камера сообщается с соседней камерой по меньшей мере через одну пору. Среди этих пор две поры, а именно первая пора и вторая пора, размещены так, что позволяют по меньшей мере части полимерного каркаса перемещаться из первой поры и во вторую пору. Кроме того, устройство включает в себя датчик в каждой поре, способный идентифицировать полимерный каркас во время движения. Согласно одному аспекту идентификация подразумевает идентификацию отдельных компонентов полимерного каркаса. Согласно другому аспекту идентификация подразумевает идентификацию молекул слияние : нагрузка, связанных с полимерным каркасом. При использовании одного датчика этот один датчик может включать в себя два электрода, помещенных на обоих концах поры, для измерения ионного тока через пору. Согласно другому варианту осуществления один датчик содержит компонент, отличный от электродов.

Согласно одному аспекту устройство включает в себя три камеры, соединенные посредством двух пор. Можно без труда сконструировать устройства с более чем тремя камерами с выполнением одной или нескольких дополнительных камер по обеим сторонам трехкамерного устройства или между любыми двумя из трех камер. Подобным образом, в устройстве могут быть предусмотрены более чем две поры для соединения камер.

Согласно одному аспекту могут быть предусмотрены две поры или более между двумя соседними камерами для обеспечения одновременного прохождения нескольких полимерных каркасов из одной камеры в следующую. Такая многопористая конструкция может усиливать производительность анализа ферментативной активности с помощью устройства. Для мультиплексирования одна камера может предусматривать расщепляемый линкер для одного целевого типа, а другая камера может предусматривать другой расщепляемый линкер для другого целевого типа, при этом образец подвергается всем камерам перед обнаружением нанопорой.

Согласно некоторым аспектам устройство дополнительно включает в себя средство для перемещения полимерного каркаса из одной камеры в другую. Согласно одному аспекту перемещение обеспечивает загрузку полимерного каркаса как через первую пору, так и через вторую пору в одно и то же время. Согласно другому аспекту средство, кроме того, обеспечивает перемещение полимерного каркаса через обе поры в одном и том же направлении.

Например, в трехкамерном двухпористом устройстве («двухпористом» устройстве), каждая из камер может содержать электрод для соединения с источником питания так, что может быть приложено отдельное напряжение на каждую из пор между камерами.

Согласно одному варианту осуществления настоящего раскрытия представлено устройство, содержащее верхнюю камеру, среднюю камеру и нижнюю камеру, при этом верхняя камера сообщается со средней камерой через первую пору, а средняя камера сообщается с нижней камерой через вторую пору. Такое устройство может иметь любые размеры или другие характеристики, раскрытые ранее в публикации патентного документа США №2013-0233709 под названием «Двухпористое устройство», которая включена в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте.

Согласно одному аспекту диаметр каждой поры составляет по меньшей мере приблизительно 1 нм. В качестве альтернативы, диаметр каждой поры составляет по меньшей мере приблизительно 2 нм, 3 нм, 4 нм, 5 нм, 6 нм, 7 нм, 8 нм, 9 нм, 10 нм, 11 нм, 12 нм, 13 нм, 14 нм, 15 нм, 16 нм, 17 нм, 18 нм, 19 нм, 20 нм, 25 нм, 30 нм, 35 нм, 40 нм, 45 нм, 50 нм, 60 нм, 70 нм, 80 нм, 90 нм или 100 нм.

Согласно одному аспекту диаметр каждой поры составляет не более чем приблизительно 100 нм. В качестве альтернативы, диаметр поры составляет не более чем приблизительно 95 нм, 90 нм, 85 нм, 80 нм, 75 нм, 70 нм, 65 нм, 60 нм, 55 нм, 50 нм, 45 нм, 40 нм, 35 нм, 30 нм, 25 нм, 20 нм, 15 нм или 10 нм.

Согласно одному аспекту пора имеет диаметр, который составляет от приблизительно 1 нм до приблизительно 100 нм, или, в качестве альтернативы от приблизительно 2 нм до приблизительно 80 нм, или от приблизительно 3 нм до приблизительно 70 нм, или от приблизительно 4 нм до приблизительно 60 нм, или от приблизительно 5 нм до приблизительно 50 нм, или от приблизительно 10 нм до приблизительно 40 нм, или от приблизительно 15 нм до приблизительно 30 нм.

Согласно некоторым аспектам пора имеет практически круглую форму. Используемый в настоящем документе термин «практически круглая» относится к форме, которая по меньшей мере на приблизительно 80 или 90% представляет форму цилиндра. Согласно некоторым вариантам осуществления пора по форме является квадратной, прямоугольной, треугольной, овальной или шестиугольной.

Согласно одному аспекту пора имеет глубину, которая составляет от приблизительно 1 нм до приблизительно 10000 нм, или, в качестве альтернативы, от приблизительно 2 нм до приблизительно 9000 нм, или от приблизительно 3 нм до приблизительно 8000 нм и т.д.

Согласно некоторым аспектам нанопора проходит через мембрану. Например, пора может представлять собой белковый канал, вставленный в липидную бислойную мембрану, или она может быть выполнена путем сверления, травления или формирования иным образом поры через субстрат в твердом состоянии, такой как диоксид кремния, нитрид кремния, графен или слои, образованные из комбинации этих или других материалов. Нанопоры имеют размеры, позволяющие прохождение через пору конструкции каркас:слияние:нагрузка или продукта этой молекулы после ферментативной активности. Согласно другим вариантам осуществления может быть желательная временная блокада поры для различения типов молекул.

Согласно некоторым аспектам длина или глубина нанопоры является достаточно большой для того, чтобы образовывать канал, соединяющий два разных отдельных объема. Согласно некоторым таким аспектам глубина каждой поры составляет более 100 нм, 200 нм, 300 нм, 400 нм, 500 нм, 600 нм, 700 нм, 800 нм или 900 нм. Согласно некоторым аспектам глубина каждой поры составляет не более 2000 нм или 1000 нм.

Согласно одному аспекту поры отделены друг от друга расстоянием от приблизительно 10 нм до приблизительно 1000 нм. Согласно некоторым аспектам расстояние между порами составляет более 1000 нм, 2000 нм, 3000 нм, 4000 нм, 5000 нм, 6000 нм, 7000 нм, 8000 нм или 9000 нм. Согласно некоторым аспектам расстояние между порами составляет не более 30000 нм, 20000 нм или 10000 нм. Согласно одному аспекту расстояние составляет по меньшей мере приблизительно 10 нм, или, в качестве альтернативы, по меньшей мере приблизительно 20 нм, 30 нм, 40 нм, 50 нм, 60 нм, 70 нм, 80 нм, 90 нм, 100 нм, 150 нм, 200 нм, 250 нм или 300 нм. Согласно другому аспекту расстояние составляет не более приблизительно 1000 нм, 900 нм, 800 нм, 700 нм, 600 нм, 500 нм, 400 нм, 300 нм, 250 нм, 200 нм, 150 нм или 100 нм.

Согласно другому аспекту расстояние между порами составляет от приблизительно 20 нм до приблизительно 800 нм, от приблизительно 30 нм до приблизительно 700 нм, от приблизительно 40 нм до приблизительно 500 нм или от приблизительно 50 нм до приблизительно 300 нм.

Две поры могут быть размещены в любом положении, при условии, что они обеспечивают сообщение жидкости между камерами и имеют заданный размер и расстояние между ними. Согласно одному аспекту поры размещаются так, что между ними не возможна прямая блокировка. Согласно еще одному аспекту поры являются по сути коаксиальными.

Согласно одному аспекту устройство содержит электроды в камерах, соединенные с одним или несколькими источниками питания. Согласно некоторым аспектам источник питания включает в себя фиксацию напряжения или фиксацию потенциала, которые могут подавать напряжение на каждую пору и измерять ток через каждую пору независимо. В этом отношении конфигурация источника питания и электрода может предусматривать среднюю камеру на общем заземлении с обоими источниками питания. Согласно одному аспекту источник или источники питания выполнены с возможностью прилагать первое напряжение V₁ между верхней камерой (камерой А) и средней камерой (камерой В), а второе напряжение V₂ между средней камерой и нижней камерой (камерой С).

Согласно некоторым аспектам первое напряжение V₁ и второе напряжение V₂ регулируют независимо. Согласно одному аспекту средняя камера регулируется так, чтобы быть заземлением относительно двух напряжений. Согласно одному аспекту средняя камера содержит среду для обеспечения проводимости между каждой из пор и электродом в средней камере. Согласно одному аспекту средняя камера включает в себя среду для сопротивления между каждой из пор и электродом в средней камере. Поддерживание такого сопротивления достаточно небольшим относительно сопротивлений нанопор применяют для развязки двух напряжений и токов через поры, что полезно для независимой регулировки напряжений.

Регулировка напряжений может быть использована для контроля движения заряженных частиц в камерах. Например, если оба напряжения устанавливают в одной и той же полярности, то соответствующим образом заряженная частица может последовательно двигаться из верхней камеры в среднюю камеру, а затем в нижнюю камеру или наоборот. Согласно некоторым аспектам если два напряжения устанавливают в противоположной полярности, то заряженная частица может двигаться из верхней или нижней камеры в среднюю камеру и удерживаться там.

Регулировка напряжений в устройстве может быть особенно применимой для контролирования передвижения крупной молекулы, такой как заряженный полимерный каркас, которая является достаточно длинной для пересечения обеих пор одновременно. Согласно такому аспекту направление и скорость передвижения молекулы можно контролировать с помощью относительной величины и полярности напряжений, как описывается ниже.

Устройство может содержать материалы, подходящие для удерживания жидких образцов, в частности, биологических образцов, и/или материалы, подходящие для нанопроизводства. Согласно одному аспекту такие материалы включают в себя диэлектрические материалы, такие как без ограничения кремний, нитрид кремния, диоксид кремния, графен, углеродные нанотрубки, TiO₂, HfO₂, Al₂O₃, или другие металлические слои, или любую комбинацию этих материалов. Согласно некоторым аспектам, например, одинарный лист графеновой мембраны толщиной приблизительно 0,3 нм может быть использован в качестве несущей поры мембраны.

Устройства, которые являются микрожидкостными и которые содержат в себе реализации на двухпористых микрожидкостных чипах, могут быть получены рядом средств и способов. Для микрожидкостного чипа, содержащегося в двух параллельных мембранах, обе мембраны могут быть одновременно просверлены одним пучком для образования двух концентрических пор, хотя также возможно использование разных пучков на каждой стороне мембран в сочетании с любой подходящей техникой выравнивания. В общих чертах, корпус обеспечивает герметичное разделение камер А-С.

Согласно одному аспекту устройство включает в себя микрожидкостный чип (обозначенный как «двухпористый чип»), состоящий из двух параллельных мембран, соединенных прокладками. Каждая мембрана содержит пору, просверленную одним пучком сквозь центр мембраны. Кроме того, устройство предпочтительно имеет корпус из Teflon® или поликарбонатный корпус для чипа. Корпус обеспечивает герметичное разделение камер А-С и обеспечивает минимальное сопротивление доступа для электрода с гарантией того, что каждое напряжение прилагается преимущественно через каждую пору.

Более конкретно, несущие поры мембраны могут быть сделаны с сетками для просвечивающей электронной микроскопии (ТЕМ) с окнами из кремния, нитрида кремния или диоксида кремния толщиной 5-100 нм. Могут быть использованы прокладки для разделения мембран, с использованием изоляционного материала, такого как SU-8, фоторезист, оксид PECVD, оксид ALD, ALD оксид алюминия, или материала с металлическим напылением, таким как Ag, Au или Pt, и занимающие небольшой объем в другой водной части камеры В между мембранами. Держатель помещают в водяную баню, которая составляет наибольшую объемную часть камеры В. Камеры А и С открываются каналами большего диаметра (для низкого сопротивления доступа), которые ведут к уплотнениям мембраны.

Сфокусированный электронный или ионный пучок может быть использован для сверления пор в мембранах, что естественно выравнивает их. Порам также можно придавать требуемую форму (стягивать) меньших размеров путем применения правильной фокусировки луча к каждому слою. Также может быть использован любой способ сверления отдельных нанопор для сверления пары пор в двух мембранах с учетом возможной глубины сверления для данного способа и толщины мембран. Также возможно предварительное сверление микропоры до заданной глубины, а затем нанопоры через остальную часть мембран для дополнительного утончения толщины мембраны.

Благодаря напряжениям, присутствующим на порах устройства, заряженные молекулы могут перемещаться через поры между камерами. Скорость и направление передвижения можно контролировать с помощью величины и полярности напряжений. Кроме того, поскольку каждое из двух напряжений можно независимо регулировать, направление и скорость передвижения заряженной молекулы могут быть точно контролированы в каждой камере.

Один пример относится к заряженному полимерному каркасу, такому как ДНК, с длиной, превышающей объединенное расстояние, которое включает в себя глубину обоих пор плюс расстояние между двумя порами. Например, 1000 с dsDNA составляет приблизительно 340 нм в длину, что значительно боыне, чем 40 нм, полученные двумя порами 10-нм глубины, отделенными на 20 нм. На первой стадии полинуклеотид загружают либо в верхнюю, либо в нижнюю камеру. Благодаря своему отрицательному заряду при физиологических условиях с рН приблизительно 7,4 полинуклеотид может передвигаться через пору, к которой приложено напряжение. Следовательно, на второй стадии два напряжения при одной и той же полярности и с одними и теми же или подобными величинами прилагают к порам для последовательного передвижения полинуклеотида через обе поры.

Приблизительно в то время, когда полинуклеотид достигает второй поры, одно или оба напряжения могут быть изменены. Поскольку выбирают расстояние между двумя порами, которое меньше длины полинуклеотида, когда полинуклеотид достигает второй поры, то он также находится и в первой поре. Быстрое изменение полярности напряжения на первой поре, следовательно, будет создавать силу, которая выталкивает полинуклеотид из второй поры.

Предположив, что две поры характеризуются идентичным влиянием напряжения на силу и |V₁|=|V₂|+δV, при этом значение δV>0 (или < 0) может быть отрегулировано для настраивания передвижения в направлении |V₁| (или V₂). На практике, хотя индуцированная напряжением сила в каждой поре не будет идентична с V₁=V₂, с помощью калибровочных экспериментов можно идентифицировать соответствующее напряжение смещения, которое приведет к равным выталкивающим силам для данного двухпористого чипа; и вариации этого напряжения смещения затем могут быть использованы для направленного контроля.

Если в этот момент величина индуцированной напряжением силы в первой поре меньше величины индуцированной напряжением силы во второй поре, то полинуклеотид будет продолжать пересекать обе поры по направлению к второй поре, но с меньшей скоростью. В этом отношении, следует принять во внимание, что скорость и направление передвижения полинуклеотида можно контролировать с помощью полярностей и величин обоих напряжений. Как будет описано ниже, такой точный контроль передвижения находит широкое применение. Для количественного определения активности ферментов польза от реализаций двухпористого устройства заключается в том, что во время контролируемой доставки и обнаружения модификация или расщепление расщепляемого линкера может быть повторно измерена для повышения достоверности результата выявления. Кроме того, более чем одна конструкция слияние:нагрузка может быть добавлена в отдельные сайты вдоль каркаса для выявления активности более чем одного фермента за один раз (мультиплексирование).

Следовательно, согласно одному аспекту представлен способ контролирования передвижения заряженного полимерного каркаса через нанопористое устройство. Способ предусматривает загрузку образца, содержащего заряженный полимерный каркас, в одну из верхней камеры, средней камеры или нижней камеры устройства любого из вышеупомянутых вариантов осуществления, при этом устройство присоединяется к одному или нескольким источникам питания для обеспечения первого напряжения между верхней камерой и средней камерой, и второго напряжения между средней камерой и нижней камерой; настройку начального первого напряжения и начального второго напряжения так, что полимерный каркас перемещается между камерами с расположением тем самым полимерного каркаса как через первую, так и через вторую поры; и регулировку первого напряжения и второго напряжения так, что оба напряжения создают силу для выталкивания заряженного полимерного каркаса из средней камеры (режим конкуренции напряжений), при этом два напряжения отличаются по величине, при контролируемых условиях, так, что заряженный полимерный каркас перемещается через обе поры в любом направлении и контролируемым образом.

Согласно одному аспекту образец, содержащий заряженный полимерный каркас, загружают в верхнюю камеру и настраивают начальное первое напряжение для проталкивания заряженного полимерного каркаса из верхней камеры в среднюю камеру, а начальное второе напряжение настраивают для проталкивания полимерного каркаса из средней камеры в нижнюю камеру. Подобным образом, образец сначала можно загружать в нижнюю камера, а заряженный полимерный каркас можно проталкивать в среднюю и верхнюю камеры.

Согласно другому аспекту образец, содержащий заряженный полимерный каркас, загружают в среднюю камеру; начальное первое напряжение настраивают для проталкивания заряженного полимерного каркаса из средней камеры в верхнюю камеру; и начальное второе напряжение настраивают для проталкивания заряженного полимерного каркаса из средней камеры в нижнюю камеру.

Согласно одному аспекту регулировки в реальном времени или оперативные регулировки первого напряжения и второго напряжения на стадии (с) выполняют с помощью активного контроля или контроля с обратной связью с использованием специализированного оборудования и программного обеспечения при тактовых частотах до сотен мегагерц. Автоматизированный контроль первого или второго, или обоих напряжений основывается на обратной связи первого или второго, или обоих измерениях ионного тока.

Датчики

Как обсуждалось выше, согласно различным аспектам нанопористое устройство дополнительно включает в себя один или несколько датчиков для осуществления выявления статуса активности целевой молекулы (например, фермента).

Датчиками, используемыми в устройстве, может быть любой датчик, подходящий для идентификации расщепления расщепляемого линкера целевой молекулой или целевым фактором. Например, датчик может быть выполнен с возможностью идентификации полимера (например, полимерного каркаса) путем измерения тока, напряжения, значения рН, оптического признака или времени пребывания, ассоциированных с полимером. Согласно другим аспектам датчик может быть выполнен с возможностью идентификации одного или нескольких отдельных компонентов полимера или одного или нескольких компонентов, связанных или соединенных с полимером. Датчик может быть получен из любого компонента, выполненного с возможностью выявления изменения в измеряемом параметре, при этом изменение указывает на полимер, компонент полимера или, предпочтительно, компонент, связанный или соединенный с полимером. Согласно одному аспекту датчик включает в себя пару электродов, расположенных с двух сторон поры, для измерения ионного тока через поры, при перемещении молекулы или другой частицы, в частности, полимерного каркаса, через пору. Согласно некоторым аспектам ионный ток через пору заметно изменяется, если сегмент полимерного каркаса, проходящий через пору, связывается с молекулой слияние:нагрузка. Такие изменения тока могут варьировать предсказуемым, измеримым образом, что соответствует, например, присутствию, отсутствию и/или размеру присутствующей молекулы слияние:нагрузка.

Согласно предпочтительному варианту осуществления датчик содержит электроды, которые прилагают напряжение и используются для измерения тока через нанопору. Транслокации молекул через нанопору обеспечивает электрический импеданс (Z), который влияет на ток через нанопору, согласно закону Ома, V=IZ, где V представляет собой прилагаемое напряжение, I представляет собой ток через нанопору, a Z представляет собой импеданс. И наоборот, проводимость G=1/Z контролируется, чтобы сигнализировать и количественно описывать события в нанопоре. Результат, когда молекула транслоцируется через нанопору в электрическом поле (например, при приложенном напряжении), является сигнатурой тока, которая может быть сопоставлена с молекулой, проходящей через нанопору при дальнейшем анализе сигнала тока.

При использовании измерений времени пребывания из сигнатуры тока размер компонента может быть сопоставлен с конкретным компонентом на основании времени, необходимого для прохождения через чувствительное устройство.

Согласно одному варианту осуществления датчик предусматривается в нанопористом устройстве, которое измеряет оптический признак полимера, компонента (или звена) полимера или компонента, соединенного или связанного с полимером. Один пример такого измерения предусматривает идентификацию полосы поглощения, уникальной для конкретного звена, с помощью инфракрасной (или ультрафиолетовой) спектроскопии.

Согласно некоторым вариантам осуществления датчиком является электрический датчик. Согласно некоторым вариантам осуществления датчик выявляет флуоресцентную сигнатуру. Для выявления этой сигнатуры можно использовать источник излучения на выходе из поры.

Установление отличия от фона

Согласно некоторым аспектам целевая молекула, присутствующая в образце, может быть взята из оригинальных (даже отфильтрованных) жидкостей природного происхождения (кровь, слюна, моча и т.п.), которые содержат большое количество фоновых молекул. Такие фоновые молекулы, если достаточно отрицательно заряжены положительным прилагаемым напряжением, проходят через нанопору. В некоторых случаях такие события в нанопоре могут выглядеть как конструкция каркас:слияние:нагрузка или как продукты (каркас, нагрузка) после расщепления расщепляемого линкера. В силу этого данные фоновые молекулы могут обеспечивать ложноположительные срабатывания, что создает высокую частоту появления ошибок выявления. Добавление достаточно подготовленного образца с удалением более крупных молекул поможет этому, но фоновые молекулы, которые генерируют события ложноположительного срабатывания, по-прежнему будут присутствовать.

Для обеспечения установления отличия фоновых молекул от молекул каркаса (с присоединением конструкции слияние:нагрузка или без такового) может быть использована схема мечения каркаса. Схемы мечения каркаса также раскрываются в предварительной заявке на выдачу патента США №61/993985, включенной посредством ссылки во всей своей полноте.

В частности, метка или последовательность меток связывается с полимерным каркасом для обеспечения индивидуальной сигнатуры тока, которая может быть использована для идентификации присутствия и/или идентичности полимерного каркаса, который транслоцировался через нанопору. В пределах одной и той же сигнатуры события присутствие или отсутствие молекулы слияние:нагрузка сигнализирует о том, был ли расщепляемый линкер модифицирован в этой молекуле.

Согласно другому варианту осуществления длина каркаса отдельно обеспечивает дискриминационную сигнатуру, которая достаточно отличается от фона, с сохранением также дискриминационной способности в отношении конструкции каркас:слияние:нагрузка и каркаса отдельно (после расщепления расщепляемого линкера).

Определение статистической значимости для выявления

Согласно некоторым вариантам осуществления сбор серий измерений датчиков, регистрируемых в течение некоторого времени, и применение математических инструментов осуществляют для определения числового уровня достоверности для выявления целевых молекулы или фактора, как предполагается, присутствующих в образце, как подробно описано в предыдущем разделе.

Недавно был разработан количественный способ установления отличия типа молекулы от фона (т.е. от других типов молекул), основанный на различиях характеристик группы событий в нанопоре (Morin, Т.J., et al., "Nanopore-based target sequence detection," submitted to PloS One, Dec. 31, 2015). Этот способ установления отличия предусматривает, что определенный тип молекулы может быть выявлен среди присутствующих различных типов других фоновых молекул, и что может быть определена статистическая значимость выявления (например, выявление реагента X с 99% достоверностью). Для применения способа к примерам, представленным ниже, авторы настоящего изобретения сначала кратко описывают способ в данном разделе.

В общих чертах, имеется две категории молекул в камере над порой: 1 тип - все фоновые молекулы, 2 тип - представляющие интерес молекулы. В нижеприведенном примере 3, например, конструкции ДНК:нагрузка можно считать молекулами 2 типа, при этом ДНК отдельно считают фоном (1 тип). На основании данных экспериментов авторы настоящего изобретения идентифицируют критерий сигнатуры событий, который присутствует в значительной части событий 2 типа, а также присутствует в относительно меньшей части событий 1 типа. Событие «устанавливают» как принадлежащее 2 типу, если критерий сигнатуры отвечает этому событию. Сигнатура может зависеть от 5G, длительности, количества и уровней в каждом событии и/или от любого другого числового значения или комбинации значений, вычисленных из сигнала события. Авторы настоящего изобретения определяют р как вероятность того, что событие захвата принадлежит 2 типу. В контрольных экспериментах без молекул 2 типа р=0, а в экспериментах с молекулами 2 типа р>0, но его значение не известно. Авторы настоящего изобретения определяют вероятность ложноположительного срабатывания как q1=Pr (установленное | событие 1 типа). В контрольном эксперименте или в серии экспериментов без молекул 2 типа q1 определяют с высокой точностью по большому числу событий захвата. В эксперименте выявления при определении того, присутствуют ли молекулы 2 типа в объеме раствора, вероятность того, что событие захвата установлено, является функцией р и может быть аппроксимирована следующим образом:

Q(p)=(число установленных событий)/N.

В формуле N представляет собой общее число событий. 99% доверительный интервал Q(p)±Q_sd(p) может быть вычислен с помощью Q_sd(p)=2,57*sqrt{Q(p)*(1-Q(p))/N}, при этом sqrt{ } представляет собой квадратичную функцию. В ходе эксперимента значение Q(p) уменьшается, и неопределенные связи уменьшаются по мере увеличения числа событий N. График Q(p)±Q_sd(p) как функция времени регистрации демонстрирует, как оно изменяется для каждого типа реагента (фиг. 19b, пример 3). В контрольном эксперименте без молекул 2 типа наблюдается, что Q(0)=q1. В контрольном эксперименте с молекулами 2 типа, которые, как известно, присутствуют с некоторой вероятностью р*>0, вычисленное значение Q(p*) может быть использовано в эксперименте выявления для определения того, отсутствуют ли молекулы 2 типа, как определяется ниже.

В эксперименте выявления молекулы 2 типа присутствуют с 99% достоверностью, если следующий критерий является истинным:

Если вышеупомянутый критерий является истинным, то заключают, что р>0; если он является ложным, то не заключают, что р>0. В эксперименте выявления молекулы 2 типа отсутствуют с 99% достоверностью, если следующий критерий является истинным:

Если вышеупомянутый критерий является истинным, то заключают, что р=0; в противном случае это заключение не делается. Основу используют в примерах, представленных ниже.

Оценивание концентрации целевой молекулы

Согласно некоторым вариантам осуществления сбор серий измерений датчиков, регистрируемых в течение некоторого времени, и применение математических инструментов осуществляют для определения концентрации целевых молекулы или фактора, как предполагается, присутствующих в образце.

Согласно некоторым вариантам осуществления процесс (инкубации образца с реагентом каркас:слияние:нагрузка и выполнения экспериментов с нанопорой) можно повторять с варьированием концентрации одного или нескольких из каркаса, слияния, нагрузки и/или целевых молекулы или фактора, как предполагается, присутствующих в образце. Затем серии данных можно объединять для сбора большей информации. Согласно одному варианту осуществления суммарная концентрация активного фермента должна быть оценена путем применения математических инструментов к совокупным сериям данных.

В следующих известных из литературы способах (Wang, Hongyun, et al, "Measuring and Modeling the Kinetics of Individual DNA-DNA Polymerase Complexes on a Nanopore." ACS Nano 7, no. 5 (May 28, 2013): 3876-86. doi:10.1021/nn401180j; Benner, Seico, et al, "Sequence-Specific Detection of Individual DNA Polymerase Complexes in Real Time Using a Nanopore." Nature Nanotechnology 2, no. 11 (October 28, 2007): 718-24 (doi:10.1038/nnano.2007.344)) можно применять биофизические модели к данным по нанопоре для количественного определения связывания, разрыва связи и последующей кинетики диссоциации между целевым ферментом и его субстратом (например, расщепляемым линкером или расщепляемым доменом).

В анализах в соответствии с настоящим изобретением нанопору исследуют и измеряют отдельные молекулы из объемной фазы. В присутствии целевой молекулы расщепляемый линкер в конструкции каркас:слияние:нагрузка будет модифицирован (например, расщеплен) с некоторой скоростью, которая пропорциональна концентрации мишени. При высоких концентрациях мишеней по сравнению с концентрацией конструкции каркас:слияние:нагрузка расщепление будет протекать быстро, и все расщепляемые линкеры будут расщеплены, что приведет к выявлению молекул только каркаса и нагрузки, а также любых других фоновых молекул. При более низких концентрациях по сравнению с концентрацией конструкции каркас:слияние:нагрузка расщепление будет протекать медленнее, в течение 10-минутного периода регистрации большинство событий, касающихся каркаса, будут сигнализировать о том, что конструкция каркас:слияние:нагрузка интактной проходит через пору. При промежуточных концентрациях по сравнению с концентрацией конструкции каркас:слияние:нагрузка отличное от нуля процентное отношение событий, касающихся каркаса, будет отмечено как относящееся к интактной конструкции каркас:слияние:нагрузка, и это процентное отношение со временем будет уменьшаться по мере завершения реакции.

Для оценивания суммарной концентрации активного фермента может быть проведен повторный эксперимент с нанопорой и с использованием другой концентрации реагента каркас:слияние:нагрузка в каждый момент времени от низкой (1 пМ) до высокой (100 нМ), при этом концентрация целевой молекулы является неизменной по мере использования части общего образца. При измерении временной эволюции процентного отношения событий, касающихся каркаса, установленных как являющаяся интактной конструкция каркас:слияние:нагрузка, основа моделирования, подобная таковой в упомянутой работе, может быть использована для количественного определения суммарной концентрации фермента. В частности, зависимые от времени измерения использовали в Wang, Hongyun, et al., "Measuring and Modeling the Kinetics of Individual DNA-DNA Polymerase Complexes on a Nanopore." ACS Nano 7, no. 5 (May 28, 2013): 3876-86. doi:10.1021/nn401180j, при этом модель позволяет точно оценить суммарную концентрацию фермента.

Для оценки суммарной концентрации активного фермента может быть реализована матрица с несколькими нанопорами. Каждая нанопора будет измерять разную концентрацию реагентов каркас:слияние:нагрузка от низкой (1 пМ) до высокой (100 нМ). При измерении временной эволюции процентного отношения событий, касающихся каркаса, установленных как являющаяся интактной конструкция каркас:слияние:нагрузка, в каждой нанопоре в параллели, основа моделирования, подобная таковой в упомянутой работе, может быть использована для количественного определения суммарной концентрации фермента.

Примеры

Технология в соответствии с настоящим изобретением дополнительно определяется ссылкой на следующие примеры и эксперименты. Специалистам в данной области будет понятно, что многие модификации могут быть осуществлены на практике без отступления от объема настоящего изобретения.

Пример 1. Выявление с помощью нанопоры каркаса ДНК

Нанопора в твердом состоянии представляет собой наноразмерное отверстие, образованное в тонкой мембране в твердом состоянии, которая разделяет два водных объема. Усилитель фиксации напряжения прилагает напряжение V через мембрану при измерении ионного тока через открытую пору. В отличие от любого другого одномолекулярного датчика нанопористое устройство может иметь портативный формфактор с очень низкой стоимостью. Если отдельная заряженная молекула, такая как двухнитевая ДНК (dsDNA) захватывается и передвигается через пору посредством электрофореза, то измеряемые сдвиги тока, глубину сдвига проводимости (δG=δI/V) и длительность используют для характеристики события (фиг. 17а).

После регистрации множества событий на протяжении эксперимента распределения событий анализировали для характеристики соответствующей молекулы. На фиг. 17b показаны характеристики событий для 3,2-kb dsDNA, проходящей через нанопору диаметром 27 нм при напряжении V=100 мВ (1 М LiCl). Два обведенных кружочками типичных события демонстрируют более широкое и более мелкое событие, соответствующее ДНК, проходящей через пору развернутой, и более быстрое, но более глубокое событие, соответствующее ДНК, проходящей через пору свернутой. Что касается dsDNA, которая составляет ~1 kb и меньше, ДНК проходит через пору только в развернутом состоянии.

Пример 2. Конструкция каркас:слияние:нагрузка, содержащая расщепляемый линкер для протеазы и расщепляемый линкер для эндонуклеазы

С целью экспериментальной демонстрации анализа в соответствии с настоящим изобретением сконструировали и построили отдельную конструкцию, которая содержит два различных расщепляемых линкера в одной молекуле слияния, как показано на фиг. 12. С помощью этой отдельной конструкции авторы настоящего изобретения пытались продемонстрировать выявление активности эндонуклеазы и отдельно продемонстрировать выявление активности протеазы.

Каркас ДНК создавали с использованием модифицированного дибензоциклооктином (DBCO) праймера с эффективным мечением молекулы химической группой DBCO, подлежащей использованию для конъюгации с помощью не содержащей медь клик-химии (фиг. 6). ПЦР-матрица включала в себя чувствительную к эндонуклеазе последовательность CC/T(N)AGG (/ представляет собой сайт расщепления, N представляет собой любое нуклеотидное основание ДНК С, G, Т или А). В анализе активности эндонуклеазы часть молекулы слияния тогда содержала последовательность целевой ДНК (фиг. 12А). Затем обеспечивали инкубацию этого модифицированного каркаса ДНК на протяжении ночи при 37°С с 1000-кратным избытком меченной азидом молекулы, содержащей пептидную последовательность SGKGPRQITA (0,01 М натрия фосфата + 300 мМ NaCl, рН 7,4). Данный пептид ранее был выделен из библиотеки фагового дисплея и идентифицирован как высокочувствительный к активности ММР9 (Kridel, Steven J., et al. "Substrate hydrolysis by matrix metalloproteinase-9. Journal of Biological Chemistry 276.23 (2001): 20572-20578). В анализе активности протеазы ММР9 часть молекулы слияния тогда содержала последовательность целевого пептида (фиг. 12А). Молекула каркас:слияние:нагрузка состояла из (от N-конца до С-конца) каркаса ДНК, слияния ДНК (содержащего последовательность расщепляемого эндонуклеазой линкера в конце ДНК), азидной химической «ручки», PEG₄, гибкого мотива Gly-Ser, чувствительной к ММР9 пептидной последовательности SGKGPRQITA, гибкого мотива Gly-Ser, Cys-5-кДа PEG и биотина (фиг. 12А, синтезированного Bio-Synthesis, Inc., Lewisville, ТХ).

Успешное связывание молекулярного груза, как показано на фиг. 12А, проверяли с помощью EMSA в геле, окрашенном ДНК-специфическим красителем Sybr Green (фиг. 13, дорожка 2, верхняя полоса). Конъюгация каркаса ДНК с молекулой слияние:нагрузка, включающей в себя чувствительный расщепляемый линкер, давала в результате ~50% желаемого продукта (фиг. 13, дорожка 2, верхняя полоса). Для очистки чистой конъюгированной конструкции от неконъюгированной ДНК отдельно продукт подвергали гель-экстракции из полиакриламидного геля и повторно суспендировали в буфере для определения ферментативной активности согласно инструкциям изготовителя (результат данного способа - чистая молекула ДНК:нагрузка - показан на фиг. 14, дорожки 1 и 3).

Пример 3. Выявление с помощью нанопоры и установление отличия между ДНК, ДНК:нагрузка и ДНК:нагрузка-монострептавидин

Измеряли 500-Ьр каркас ДНК отдельно с помощью 15-нм нанопоры (0,2 нМ, 100 мВ, 1 М LiCl, 10 мМ Tris, 1 мМ EDTA, рН 8,0) с получением 97 событий за 30 минут (фиг. 18а). Несколько событий (8,3%) достигали глубины по меньшей мере 1 нСм (фиг. 18b). После удаления ДНК из камеры, прилегающей к нанопоре, добавляли 0,2 нМ реагента ДНК:нагрузка, где ДНК:нагрузка в настоящем документе относится к комплексу, упоминаемому в примере 2 и на фиг. 12. Реагент ДНК:нагрузка продуцировал 190 событий за 30 минут с увеличением до 21,1% событий, достигающих глубины по меньшей мере 1 нСм (фиг. 18b). После удаления реагента ДНК:нагрузка добавляли 0,2 нМ реагента ДНК:нагрузка, который инкубировали с монострептавидином (фиг. 13, дорожка 3, верхняя полоса), в камеру для измерения с помощью нанопоры, при этом монострептавидин связывался со свободным биотином на конце нагрузки (как показано на фиг. 6В). При добавлении монострептавидина увеличенный размер каждой молекулы ДНК:нагрузка-монострептавидин приводил в результате к увеличению глубины и длительности события для большинства из 414 событий, зарегистрированных за 18 минут (фиг. 18а). Группа увеличивалась до 43,5% событий, достигающих глубины по меньшей мере 1 нСм (фиг. 18b).

Визуальный сдвиг в группах событий (фиг. 18а) согласуется с увеличением размера молекулы, от ДНК до ДНК:нагрузка, а затем до ДНК:нагрузка-монострептавидин. Количественный способ в соответствии с настоящим документом для выявления определенного типа молекул среди присутствия различных типов других фоновых молекул может быть применен к этим данным так, что может быть задана статистическая значимость выявления.

Если ДНК считали принадлежащей 1 типу, а молекулу ДНК:нагрузка считали принадлежащей 2 типу, то критерием примера являлось установление события как принадлежащего 2 типу, если δG>1 нСм. Группа ДНК отдельно может быть использована для вычисления q1=0,082 (8,2%). Эксперимент с молекулой ДНК:нагрузка может быть использован в качестве модельного эксперимента выявления и для определения наличия молекул 2 типа путем применения уравнения (1) математической основы. Результат равнялся 0,211-0,076=0,134>0,082, что позволяло утверждать, что молекулы 2 типа (ДНК:нагрузка) присутствуют с 99% достоверностью.

Далее ДНК и молекулу ДНК:нагрузка считали принадлежащими 1 типу, а молекулу ДНК:нагрузка-монострептавидин считали принадлежащей 2 типу, и можно было использовать тот же критерий (δG >1 нСм) для установления события как принадлежащего 2 типу. Группы ДНК отдельно и ДНК:нагрузка могли быть использованы для установления q1=0,211 (с использованием большего из двух значений 0,082 и 0,211, в качестве возможной вероятности ложноположительного срабатывания). Как и перед этим, группа ДНК:нагрузка-монострептавидин могла быть использована в качестве модельного эксперимента выявления, и тестировали, принадлежат ли молекулы 2 типу, путем применения уравнения (1). Результат равнялся 0,435-0,063=0,372>0,211, что позволяло утверждать, что молекулы 2 типа (ДНК:нагрузка-монострептавидин) присутствуют с 99% достоверностью.

Придерживаясь того, что молекула ДНК:нагрузка-монострептавидин принадлежит 2 типу представляющей интерес молекулы, также можно было провести модельный дополнительный тест, в котором применяли уравнение (2) математической основы. В частности, можно было рассматривать данные молекулы ДНК:нагрузка как «неизвестный» реагент, с помощью которых нужно узнать, отсутствует ли более объемная молекула ДНКгнагрузка-монострептавидин. Снова использовали критерий (δG >1 нСм) для установления события как принадлежащего 2 типу. Из контрольного эксперимента с молекулой ДНК:нагрузка-монострептавидин получали Q(p*)=0,435. С «неизвестными» данными (ДНК:нагрузка) и с применением уравнения (2) результат равнялся 0,211+0,076=0,287<0,435, что позволяло утверждать с 99% достоверностью, что молекулы 2 типа (ДНК:нагрузка-монострептавидин) не присутствуют в модельном «неизвестном» реагенте (ДНК:нагрузка, без монострептавидина).

Пример 4. Разложение чувствительной к ММР9 молекулярной конструкции с последующим выявлением с помощью нанопоры

Матричная металлопротеиназа 9 (ММР9) представляет собой 92-кДа внеклеточный разрушающий внеклеточный матрикс (ЕСМ) фермент, который, как было обнаружено, вовлекается в обширный ряд нормальных физиологических процессов у человека. Своевременное разложение ЕСМ является важным признаком репарации, морфогенеза и развития ткани. По причине ее важной роли в нормальной физиологии человека аномальная экспрессия и/или активность ММР9 была ассоциирована с рядом серьезных медицинских состояний, в том числе без ограничения с сердечно-сосудистым заболеванием, ревматоидным артритом и рядом злокачественных новообразований (Nagase, Hideaki, Robert Visse, and Gillian Murphy. "Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs." Cardiovascular research 69.3 (2006): 562-573). Учитывая это, экспрессия MMP9 и протеолитическая активность рассматривались как ценный клинический диагностический биомаркер в медицинском сообществе.

Способность ММР9 расщеплять свой целевой субстрат SGKGPRQITA в 300-bp или 500-bp конструкции каркас ДНК:молекула слияния:нагрузка сначала проверяли с помощью EMSA в геле. Обеспечивали инкубацию активной каталитической субъединицы ММР9 (39 кДа, Enzo Life Sciences) с каркасом ДНК, конъюгированным с молекулярным грузом в буфере для изучения активности ММР9 (50 мМ Tris, 10 мМ CaCl₂, 150 мМ NaCl, 0,05% Brij 35, рН 7,5) при отношении 1:10 протеазы к субстрату на протяжении ночи при 37°С для гарантии полного ферментативного разложения (фиг. 14, дорожка 2). Эта инкубация с ММР9 показывала молекулу, которая была более подвижной в акриламидном геле по сравнению с полной конструкцией (фиг. 14, дорожки 1 и 3), предположительно из-за полного ферментативного разрушения конструкции между остатками глутамина и изолейцина, которые, как полагают, представляют собой сайт расщепления целевого субстрата (Kridel, Steven J., et al. "Substrate hydrolysis by matrix metalloproteinase-9. Journal of Biological Chemistry 276.23 (2001): 20572-20578). Инкубация неактивной MMP9 с идентичной конструкцией не приводила к какому-либо сдвигу между образцами в геле (данные не показаны), что указывало на то, что изменение в электрофоретической подвижности, наблюдаемое на дорожке 2, происходило исключительно благодаря протеолитической активности представляющей интерес протеазы ММР9.

Затем тестировали способ в соответствии с настоящим изобретением выявления с помощью нанопоры расщепления ММР9 своего целевого субстрата SGKGPRQITA в 300-bp конструкции ДНК:слияние:нагрузка (называемой в настоящем документе ДНК:нагрузка). Сначала тестировали 300-bp каркас ДНК отдельно при 0,4 нМ с использованием поры диаметром 15 нм (100 мВ, 1 М LiCl), обеспечивающей 146 событий за 30 минут только лишь с 5,5% превышением длительности 0,1 мс (фиг. 19а, b). Затем тестировали молекулу ДНК:нагрузка, которая не подвергалась активности ММР9. Этот образец обеспечивал 49 событий за 30 минут с 16,3% превышением длительности 0,1 мс (фиг. 19а, b). Далее после периода инкубации молекулы ДНК:нагрузка и ММР9, как описывалось ранее, реакционную смесь тестировали в поре при эквивалентной концентрации молекулы ДНК:нагрузка 1,2 нМ с получением 327 событий за 30 минут. Если ММР9 разлагает достаточно большую часть субстрата (т.е. расщепляемого линкера), реакционная смесь будет содержать ДНК отдельно и молекулярный груз отдельно, и в результате будет уменьшаться процентное отношение событий, превышающих 0,1 мс по длительности, по сравнению с неразложенной молекулой ДНК:нагрузка. Это было фактически так: 7,6% событий, превышающих 0,1 мс для молекулы ДНК:нагрузка после разложения с помощью ММР9, снижение от 16,3% для молекулы ДНК:нагрузка без разложения (фиг. 19а, b). График Q(p)±Q_sd(p) как функция времени регистрации показан для каждого типа реагента (фиг. 19b).

Затем осуществляли описанный выше способ для определения статистической значимости выявления путем анализов с помощью нанопоры. В частности, с помощью уравнения (2) можно косвенным образом выявлять активность ММР9 путем тестирования на предмет отсутствия молекулярной конструкции ДНК:нагрузка с использованием данных, обеспеченных реакционной смесью молекулы ДНК:нагрузка и ММР9. В этом случае молекула ДНК:нагрузка являлась молекулой 2 типа, подлежащей определению, и минимальную длительность события 0,1 мс выбирали в качестве критерия установления 2 типа. В контрольном эксперименте с молекулой ДНК:нагрузка, которая, как известно, присутствовала (без ММР9), устанавливали значение Q(p*)=0,163. Затем, рассматривая молекулу ДНК:нагрузка после активности ММР9 как «неизвестные» данные, применяли уравнение (2). Результат равнялся 0,0765+0,038=0,117<0,163, что означало, что можно заключить, что молекулы 2 типа (ДНК:нагрузка) отсутствовали с 99% достоверностью. Как указано, отсутствие молекулы ДНК:нагрузка косвенным образом показывало, что ММР9 разрушала достаточное процентное отношение молекул, содержащих ее субстрат. Результат активности протеазы ММР9 с применением уравнения (2) представлен на фиг. 19с.

Пример 5. Разложение чувствительной к ММР9 молекулярной конструкции в присутствии повышающейся концентрации мочи

Было обнаружено, что ММР9 надэкспрессируется и является гиперактивной в моче при ряде злокачественных новообразований человека, в том числе в моче при злокачественной опухоли яичника (Coticchia, Christine М., et al. "Urinary MMP-2 and MMP-9 predict the presence of ovarian cancer in women with normal CA125 levels." Gynecologic oncology 123.2 (2011): 295-300). По этой причине получали несколько коммерчески доступных наборов (GE Healthcare, R&D Systems, Abeam) для анализа концентрации и/или уровней активности ММР9, присутствующей в моче человека. В данном примере способность ММР9 разрушать конструкцию каркас:слияние:нагрузка в присутствии повышающейся концентрации мочи анализировали с помощью EMSA в геле.

Конъюгация молекулы расщепляемый линкер:нагрузка с модифицированным DBCO каркасом ДНК, как описано в примере 2, давала в результате > 75% конечного продукта (фиг. 16, дорожка 5, верхняя полоса). Затем обеспечивали инкубацию этого очищенного образца с ММР9 в присутствии повышающихся количеств мочи человека. В нормальном буфере для определения ферментативной активности полное расщепление конструкции наблюдали посредством исчезновения верхней полосы конъюгата (дорожка 1). По мере повышения концентрации мочи установили, что полное ингибирование фермента происходило при > 15% мочи в растворе (фиг. 16, дорожки 3 и 4), а умеренную активность фермента выявляли в растворе с 5% мочи (фиг. 16, дорожка 2). Механизм ингибирования протеазы не исследовали, но он может быть обусловлен несколькими факторами, в том числе без ограничения изменением рН, присутствием нативных ингибиторов в моче или опосредованным мочевиной разворачиванием третичной структуры белка.

Пример 6. Гидролиз чувствительной к эндонуклеазе конструкции с последующим выявлением с помощью нанопоры

В бактериальной клетке рестрикционные эндонуклеазы действуют как важный защитный механизм против поглощения чужеродной ДНК. Эндонуклеазы распознают и разрушают определенные последовательности ДНК, защищая «себя» путем уничтожения потенциально вредной чужеродной ДНК, например, в случае вирусной инфекции. Staphylococcus aureus является патогенной бактерией, которая, как было обнаружено, вызывает широкий ряд инфекций человека, которые варьируются от поверхностных поражений кожи до серьезных системных заболеваний. В этом примере сначала создавали модифицированную DBCO 500-bp ДНК (содержащую каркас и часть слияния), которая включает в себя последовательность распознавания рестрикционным ферментом SauI - CC/T(N)AGG (N представляет собой С, G, Т или A). SauI представляет собой эндонуклеазу, которая, как было установлено, присутствует во всех изолятах Staphylococcus aureus (Veiga, Helena, and Mariana G. Pinho. "Inactivation of the Saul type I restriction-modification system is not sufficient to generate Staphylococcus aureus strains capable of efficiently accepting foreign DNA." Applied and environmental microbiology 75.10 (2009): 3034-3038). Эту часть слияния ДНК затем конъюгировали с молекулярным грузом. Из-за ограниченной доступности SauI у коммерческих поставщиков использовали эндонуклеазу, способную к гидролитическому расщеплению по той же последовательности распознавания - Eco81I.

Для оценивания способности Eco81I разрушать сконструированную конструкцию каркас ДНК:слияние:нагрузка обеспечивали их совместную инкубацию при 37°С на протяжении ночи для гарантии завершения специфического в отношении последовательности ДНК гидролиза (20 Ед. Eco81I в 1X буфере Tango, Thermo Scientific). После инкубации эндонуклеазы с конструкцией каркас:слияние:нагрузка выполняли EMSA в геле для анализа полученных в результате продуктов ферментативной реакции. Образец конъюгированного каркаса ДНК, инкубированного без Eco81I (фиг. 15, дорожка 1), демонстрировал верхнюю полосу, представляющую интактную конструкцию, и нижнюю полосу ДНК, которая не была конъюгирована с молекулярным грузом. Однако, если обеспечивали инкубацию образца дорожки 1 с Eco81I, то наблюдали полное разложение ДНК (фиг. 15, дорожки 3). Поскольку последовательность распознавания Eco81I лежит на расстоянии в 194 bp от 3'-конца каркаса ДНК и не зависит от расщепляемого протеазой линкера, кодируемого молекулярным грузом, то как конъюгированный, так и неконъюгированный материалы (фиг. 15, дорожка 1, верхняя и нижняя полосы) гидролизовались под действием Eco81I. Ожидаемые продукты 304 и 196 bp после гидролитической реакций Eco81I с ДНК видны на дорожке 3.

После подтвержденного на геле опосредованного Eco81I разложения чувствительной к эндонуклеазе конструкции проводили анализ с помощью нанопоры для оценивания токового импеданса полученных в результате фрагментов. Из-за присутствия молекулярного груза теоретический токовый импеданс предсказывал больший сигнал для полной конструкции по сравнению с полученными в результате продуктами. Чтобы проверить эту гипотезу с использованием 500-bp ДНК, конструкцию каркас:слияние:нагрузка (ниже называемую конструкцией ДНК:нагрузка) загружали в нанопору с 1 М LiCl и сравнивали до и после опосредованного Eco81I разложения (фиг. 20).

В анализе с помощью нанопоры сначала тестировали 1 нМ неконъюгированную 500-bp ДНК отдельно с использованием поры диаметром 18 нм (100 мВ, 1 М LiCl). Этот образец давал 530 событий за 32 минуты только лишь с 7,5% превышением длительности 0,06 мс (фиг. 20а, b). Затем конструкцию ДНК:нагрузка тестировали при 0,2 нМ с получением 117 событий за 31 минуту с 22,2% превышением длительности 0,06 мс (фиг. 20а, b). Далее после периода инкубации конструкции ДНК:нагрузка и Eco81I, как описано ранее, реакционную смесь тестировали в поре при эквивалентной концентрации конструкции ДНК:нагрузка 0,2 нМ с получением 52 событий за 40 минут. Если Eco81I расщепляла достаточно большую часть расщепляемого линкера, то реакционная смесь содержала бы ДНК отдельно и нагрузку отдельно, и в результате наблюдали бы снижение процентного отношения событий, превышающих длительность 0,06 по сравнению с неразложенной конструкцией ДНК:нагрузка. На самом деле было так: 7,7% событий, превышающих 0,06 мс для конструкции ДНК:нагрузка после разложения Eco81I, уменьшение с 22,2% для конструкции ДНК:нагрузка без разложения (фиг. 20а, b). График Q(p)±Q_sd(p) как функция времени регистрации показан для каждого типа реагента (фиг. 20b).

Снова выполняли способ, описанный ранее при определении статистической значимости для анализа выявления с помощью нанопоры. В частности, с помощью уравнения (2) можно выполнять выявление активности Eco81I путем тестирования на предмет отсутствия молекулярной конструкции ДНК:нагрузка с использованием данных, полученных с помощью реакционной смеси конструкции ДНК:нагрузка и Eco81I. В этом случае конструкция ДНК:нагрузка являлась молекулой 2 типа, подлежащей определению, а минимальную длительность события 0,06 мс выбирали как критерий установления 2 типа. В контрольном эксперименте с конструкцией ДНК:нагрузка, которая, как известно, присутствует (без Eco81I), устанавливали Q(p*)=0,222. Затем, рассматривая конструкцию ДНК:нагрузка после активности Eco81I как «неизвестные» данные, применяли уравнения (2). Результат равнялся 0,0769+0,0951=0,172<0,222, что позволяло утверждать, что молекулы 2 типа (ДНК:нагрузка) отсутствуют с 99% достоверностью. Как указано, отсутствие конструкции ДНК:нагрузка косвенным образом показывало, что Eco81I разрушала достаточное процентное отношение расщепляемых линкеров. Результат эндонуклеазной активности Eco81I с применением уравнения (2) показан на фиг. 20с.

Группа изобретений относится к области аналитической химии. Раскрыт способ выявления присутствия или отсутствия целевой молекулы в образце, предусматривающий введение образца в контакт с молекулой, содержащей расщепляемый линкер, при этом указанный расщепляемый линкер специфически расщепляется в присутствии указанной целевой молекулы; загрузку указанного образца в устройство, содержащее нанопору; создание конфигурации устройства с возможностью пропускания каркаса, выбранного из нуклеиновых кислот, пептидной нуклеиновой кислоты (PNA), дендримеров, линеаризованных белков или пептидов, через указанную нанопору, расщепляемого линкера, содержащего первый домен, который связывается с указанным каркасом, и второй домен, который связывается с молекулярным грузом, тем самым образуя комплекс, и при этом устройство содержит датчик для измерения тока; и определение с помощью датчика, был ли расщепляемый линкер расщеплен путем выявления индивидуальной сигнатуры тока при транслокации указанного комплекса через нанопору. Также раскрыты альтернативные способы выявления целевой молекулы, способ количественного определения целевой молекулы и набор для осуществления указанных способов. Группа изобретений позволяет осуществить одномолекулярный способ выявления присутствия любого активного фермента, который расщепляет ассоциированный с ним специфически расщепляемый линкер, а также обеспечивает упрощение выявления активности фермента, поскольку добавленная масса в виде молекулярного груза создает четкую разницу сигнатур между комплексом, каркасом и нагрузкой. 7 н. и 72 з.п. ф-лы, 20 ил., 6 пр.

1. Способ выявления присутствия или отсутствия целевой молекулы, как предполагается, присутствующей в образце, предусматривающий:

введение образца в контакт с молекулой, содержащей расщепляемый линкер, при этом указанный расщепляемый линкер специфически расщепляется в присутствии указанной целевой молекулы;

загрузку указанного образца в устройство, содержащее нанопору, при этом указанная нанопора соединяет два объема внутреннего пространства устройства;

создание конфигурации устройства с возможностью пропускания каркаса, выбранного из нуклеиновых кислот, пептидной нуклеиновой кислоты (PNA), дендримеров, линеаризованных белков или пептидов, через указанную нанопору, расщепляемого линкера, содержащего первый домен, который связывается с указанным каркасом, и второй домен, который связывается с молекулярным грузом, тем самым образуя комплекс, и при этом устройство содержит датчик для измерения тока; и

определение с помощью датчика, был ли расщепляемый линкер расщеплен путем выявления индивидуальной сигнатуры тока при транслокации указанного комплекса через нанопору, причем индивидуальная сигнатура тока для указанного комплекса отличается от индивидуальной сигнатуры тока от указанного каркаса и указанного молекулярного груза, с выявлением тем самым присутствия или отсутствия целевой молекулы в указанном образце.

2. Способ по п. 1, при котором введение образца в контакт с указанной молекулой, содержащей расщепляемый линкер, выполняют перед загрузкой указанного образца в указанное устройство.

3. Способ по п. 1, при котором загрузку указанного образца в указанное устройство выполняют перед введением образца в контакт с указанной молекулой, содержащей расщепляемый линкер.

4. Способ по п. 1, при котором указанная молекула, содержащая расщепляемый линкер, содержит домен, который связывается с указанным каркасом.

5. Способ по п. 4, дополнительно предусматривающий введение образца в контакт с указанным каркасом.

6. Способ по п. 4, дополнительно предусматривающий связывание указанного каркаса с указанным доменом, который связывается с каркасом.

7. Способ по п. 6, при котором указанный каркас связывается с указанным доменом, который связывается с каркасом, посредством ковалентной связи, водородной связи, ионной связи, силы Ван-дер-Ваальса, гидрофобного взаимодействия, катион-пи-взаимодействия, плоскостного стэкинг-взаимодействия или металлической связи.

8. Способ по п. 4, при котором указанный домен, который связывается с каркасом, содержит азидную группу.

9. Способ по п. 4, при котором указанный домен, который связывается с каркасом, выбран из группы, состоящей из ДНК, РНК, PNA, полипептида, гибрида холестерин/ДНК и гибрида ДНК/РНК.

10. Способ по п. 4, при котором указанный домен, который связывается с каркасом, выбран из группы, состоящей из запертой нуклеиновой кислоты (LNA), мостиковой нуклеиновой кислоты (BNA), эффекторной нуклеазы, подобной активаторам транскрипции (TALEN), кластерного короткого палиндромного повтора, разделенного регулярными промежутками (CRISPR), аптамера, связывающего ДНК белка и фрагмента антитела.

11. Способ по п. 10, при котором указанный связывающий ДНК белок включает в себя белок типа «цинковый палец».

12. Способ по п. 10, при котором указанный фрагмент антитела включает в себя связывающий антиген (Fab) фрагмент.

13. Способ по п. 4, при котором указанный домен, который связывается с каркасом, содержит химическую модификацию.

14. Способ по п. 1, при котором указанная молекула, содержащая расщепляемый линкер, содержит домен связывания с молекулярным грузом.

15. Способ по п. 14, дополнительно предусматривающий введение образца в контакт с молекулярным грузом.

16. Способ по п. 14, дополнительно предусматривающий связывание указанного молекулярного груза с указанным доменом связывания с молекулярным грузом.

17. Способ по п. 16, при котором указанный молекулярный груз связывается с указанным доменом связывания с молекулярным грузом посредством ковалентной связи, водородной связи, ионной связи, силы Ван-дер-Ваальса, гидрофобного взаимодействия, катион-пи-взаимодействия, плоскостного стэкинг-взаимодействия или металлической связи.

18. Способ по п. 14, при котором указанный домен связывания с молекулярным грузом содержит DBCO.

19. Способ по п. 1, при котором указанная молекула, содержащая расщепляемый линкер, содержит домен, который связывается с указанным каркасом, и домен связывания с молекулярным грузом.

20. Способ по п. 1, при котором указанный первый домен указанной молекулы, содержащей расщепляемый линкер, связывается непосредственно или опосредованно с указанным каркасом посредством ковалентной связи, водородной связи, ионной связи, силы Ван-дер-Ваальса, гидрофобного взаимодействия, катион-пи-взаимодействия, плоскостного стэкинг-взаимодействия или металлической связи.

21. Способ по п. 1, при котором указанный второй домен указанной молекулы, содержащей расщепляемый линкер, связывается непосредственно или опосредованно с указанным молекулярным грузом посредством ковалентной связи, водородной связи, ионной связи, силы Ван-дер-Ваальса, гидрофобного взаимодействия, катион-пи-взаимодействия, плоскостного стэкинг-взаимодействия или металлической связи.

22. Способ по п. 1, при котором указанный молекулярный груз или указанный каркас связывается с указанной молекулой, содержащей расщепляемый линкер, посредством прямого ковалентного связывания.

23. Способ по п. 22, при котором указанная молекула, содержащая расщепляемый линкер, содержит соединитель для прямого ковалентного связывания указанного каркаса с указанным расщепляемым линкером.

24. Способ по п. 1, при котором указанный каркас содержит указанную молекулу, содержащую расщепляемый линкер.

25. Способ по п. 1, при котором указанное выявление предусматривает определение с помощью датчика, связывается ли каркас с молекулярным грузом через молекулу, содержащую расщепляемый линкер.

26. Способ по п. 1, при котором указанный датчик выявляет электрический сигнал в указанной нанопоре.

27. Способ по п. 26, при котором указанным электрическим сигналом является электрический ток.

28. Способ по п. 1, при котором указанной целевой молекулой является гидролаза или лиаза.

29. Способ по п. 1, при котором указанный расщепляемый линкер выбран из группы, состоящей из дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), рибонуклеиновой кислоты (РНК) и полипептида.

30. Способ по п. 1, при котором указанный расщепляемый линкер выбран из группы, состоящей из азосоединения, дисульфидного мостика, сульфона, этиленгликольдисукцината, гидразона, ацеталя, имина, винилового эфира, вицинального диола и сложного пиколинатного эфира.

31. Способ по п. 1, при котором указанная целевая молекула специфически расщепляет связь в указанном расщепляемом линкере, выбранную из группы, состоящей из связи углерод-кислород, связи углерод-сера, связи углерод-азот и связи углерод-углерод.

32. Способ по п. 1, при котором указанный каркас содержит молекулу, выбранную из группы, состоящей из дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), дендримера, пептидной нуклеиновой кислоты (PNA), рибонуклеиновой кислоты (РНК), полипептида, гибрида холестерин/ДНК и гибрида ДНК/РНК.

33. Способ по п. 1, при котором указанный молекулярный груз выбран из группы, состоящей из дендримера, двухнитевой ДНК, однонитевой ДНК, аптамера ДНК, флуорофора, белка, полипептида, фуллерена, молекулы PEG, липосомы и гибрида холестерин/ДНК.

34. Способ по п. 1, при котором датчик содержит электродную пару, при этом указанная электродная пара прилагает разность потенциалов между двумя объемами и выявляет протекание тока через нанопору.

35. Способ по п. 1, при котором молекула, содержащая расщепляемый линкер, содержит два или более расщепляемых линкера.

36. Способ по п. 1, при котором указанное устройство дополнительно содержит по меньшей мере одну нанопору, соединенную последовательно с указанной нанопорой, при этом указанный каркас одновременно захватывается и выявляется в указанных по меньшей мере двух нанопорах.

37. Способ по п. 36, при котором транслокацию указанного каркаса контролируют путем приложения единого напряжения на каждую из указанных нанопор.

38. Способ выявления присутствия или отсутствия целевой молекулы, которая обеспечивает разрушение связей в расщепляемом линкере, как предполагается, присутствующей в образце, предусматривающий:

введение образца в контакт с молекулой, содержащей расщепляемый линкер, при этом указанный расщепляемый линкер специфически расщепляется в присутствии указанной целевой молекулы;

загрузку указанного образца в устройство, содержащее нанопору, при этом указанная нанопора соединяет два объема внутреннего пространства устройства;

создание конфигурации устройства с возможностью пропускания каркаса, выбранного из нуклеиновых кислот, пептидной нуклеиновой кислоты (PNA), дендримеров, линеаризованных белков или пептидов, через указанную нанопору, расщепляемого линкера, содержащего первый домен, который связывается с указанным каркасом, и второй домен, который связывается с молекулярным грузом, тем самым образуя комплекс, и при этом устройство содержит датчик, выполненный с возможностью измерения тока; и

определение с помощью датчика, был ли расщепляемый линкер расщеплен, путем выявления индивидуальной сигнатуры тока при транслокации указанного комплекса через нанопору, причем индивидуальная сигнатура тока для указанного комплекса отличается от индивидуальной сигнатуры тока от указанного каркаса и указанного молекулярного груза, с выявлением тем самым присутствия или отсутствия целевой молекулы в указанном образце.

39. Способ выявления присутствия или отсутствия целевой молекулы, которая обеспечивает разрушение связей в расщепляемом линкере, как предполагается, присутствующей в образце, предусматривающий:

введение образца в контакт с молекулой, содержащей расщепляемый линкер, каркасом, выбранным из нуклеиновых кислот, пептидной нуклеиновой кислоты (PNA), дендримеров, линеаризованных белков или пептидов, и молекулярным грузом, при этом указанная целевая молекула специфически расщепляет указанный расщепляемый линкер, при этом указанная молекула, содержащая расщепляемый линкер, содержит первый домен, который связывается с указанным каркасом, и второй домен, который связывается с молекулярным грузом, тем самым образуя комплекс;

загрузку указанной молекулы, содержащей расщепляемый линкер, указанного каркаса, указанного молекулярного груза и указанного образца в устройство, содержащее нанопору, при этом указанная нанопора соединяет два объема внутреннего пространства устройства;

создание конфигурации устройства с возможностью прохождения указанного комплекса через указанную нанопору, при этом устройство содержит датчик для измерения тока; и

определение с помощью датчика, расщеплен ли расщепляемый линкер, путем выявления индивидуальной сигнатуры тока при транслокации через нанопору, причем индивидуальная сигнатура тока нерасщепленного каркаса отличается от индивидуальной сигнатуры тока расщепленного каркаса, с выявлением тем самым присутствия или отсутствия целевой молекулы.

40. Способ по п. 39, при котором целевая молекула включает в себя гидролазу или лиазу.

41. Способ по п. 39, при котором целевая молекула химически расщепляет расщепляемый линкер путем воздействия на указанный расщепляемый линкер реагента, выбранного из группы, состоящей из нуклеофильного реагента, основного реагента, электрофильного реагента, кислотного реагента, восстановителя, окислителя и металлорганического соединения.

42. Способ по п. 39, при котором в по меньшей мере одном из указанных двух объемов в указанном устройстве обеспечивается связывание указанной молекулы, содержащей расщепляемый линкер, с указанным каркасом и связывание указанной молекулы, содержащей расщепляемый линкер, с указанным молекулярным грузом.

43. Способ по п. 39, при котором указанная молекула, содержащая расщепляемый линкер, связывается с указанным каркасом и указанным молекулярным грузом перед введением образца в контакт с указанной молекулой, содержащей расщепляемый линкер.

44. Способ по п. 39, при котором указанная молекула, содержащая расщепляемый линкер, связывается с указанным каркасом и указанным молекулярным грузом перед загрузкой указанной молекулы, содержащей расщепляемый линкер, в указанное устройство.

45. Способ по п. 39, при котором в одном или более объемах в указанном устройстве обеспечивается расщепление указанного расщепляемого линкера указанной целевой молекулой, как предполагается, присутствующей в указанном образце.

46. Способ по п. 39, при котором введение образца в контакт с указанной молекулой, содержащей расщепляемый линкер, выполняют перед загрузкой указанного образца в указанное устройство.

47. Способ по п. 39, при котором загрузку указанного образца в указанное устройство выполняют перед введением образца в контакт с указанной молекулой, содержащей расщепляемый линкер.

48. Способ по п. 39, при котором указанный каркас содержит молекулу, выбранную из группы, состоящей из дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), дендримера, пептидной нуклеиновой кислоты (PNA), рибонуклеиновой кислоты (РНК), полипептида, гибрида холестерин/ДНК и гибрида ДНК/РНК.

49. Способ по п. 39, при котором расщепляемый линкер выбран из группы, состоящей из дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), рибонуклеиновой кислоты (РНК) и полипептида.

50. Способ по п. 39, при котором указанная целевая молекула специфически расщепляет связь в указанном расщепляемом линкере, выбранную из группы, состоящей из связи углерод-кислород, связи углерод-сера, связи углерод-азот и связи углерод-углерод.

51. Способ по п. 39, при котором указанный расщепляемый линкер выбран из группы, состоящей из азосоединения, дисульфидного мостика, сульфона, этиленгликольдисукцината, гидразона, ацеталя, имина, винилового эфира, вицинального диола и сложного пиколинатного эфира.

52. Способ по п. 39, при котором молекулярный груз выбран из группы, состоящей из дендримера, двухнитевой ДНК, однонитевой ДНК, аптамера ДНК, флуорофора, белка, полипептида, фуллерена, молекулы PEG, липосомы и гибрида холестерин/ДНК.

53. Способ по п. 39, при котором указанный каркас и указанная молекула, содержащая расщепляемый линкер, связываются посредством ковалентной связи, водородной связи, ионной связи, силы Ван-дер-Ваальса, гидрофобного взаимодействия, катион-пи-взаимодействия, плоскостного стэкинг-взаимодействия или металлической связи.

54. Способ по п. 53, при котором указанный каркас и указанная молекула, содержащая расщепляемый линкер, связываются посредством прямого ковалентного связывания.

55. Способ по п. 53, при котором указанная молекула, содержащая расщепляемый линкер, содержит соединитель для прямого ковалентного связывания с указанным каркасом, при этом соединитель связывается с указанным расщепляемым линкером.

56. Способ по п. 55, при котором указанный соединитель содержит полиэтиленгликоль.

57. Способ по п. 53, при котором указанная молекула, содержащая расщепляемый линкер, содержит домен, который связывается с указанным каркасом, выбранный из группы, состоящей из ДНК, РНК, PNA, полипептида, гибрида холестерин/ДНК и гибрида ДНК/РНК.

58. Способ по п. 53, при котором указанная молекула, содержащая расщепляемый линкер, выбрана из группы, состоящей из запертой нуклеиновой кислоты (LNA), мостиковой нуклеиновой кислоты (BNA), эффекторной нуклеазы, подобной активаторам транскрипции (TALEN), кластерного короткого палиндромного повтора, разделенного регулярными промежутками (CRISPR), аптамера, связывающего ДНК белка и фрагмента антитела.

59. Способ по п. 58, при котором указанный связывающий ДНК белок включает в себя белок типа «цинковый палец».

60. Способ по п. 58, при котором указанный фрагмент антитела включает в себя связывающий антиген (Fab) фрагмент.

61. Способ по п. 53, при котором указанная молекула, содержащая расщепляемый линкер, содержит химическую модификацию.

62. Способ по п. 39, при котором расщепляемый линкер и молекулярный груз связываются непосредственно или опосредованно посредством ковалентной связи, водородной связи, ионной связи, силы Ван-дер-Ваальса, гидрофобного взаимодействия, катион-пи-взаимодействия, плоскостного стэкинг-взаимодействия или металлической связи.

63. Способ по п. 39, при котором датчик содержит электродную пару, при этом указанная электродная пара прилагает разность потенциалов между двумя объемами и выявляет протекание тока через нанопору.

64. Способ по п. 39, при котором молекула, содержащая расщепляемый линкер, дополнительно содержит один или более расщепляемых линкера.

65. Способ выявления целевой молекулы, которая обеспечивает разрушение связей в расщепляемом линкере, как предполагается, присутствующей в образце, предусматривающий:

введение образца в контакт с каркасом, выбранным из нуклеиновых кислот, пептидной нуклеиновой кислоты (PNA), дендримеров, линеаризованных белков или пептидов, при этом каркас содержит расщепляемый домен, при этом указанный расщепляемый домен специфически расщепляется в присутствии указанной целевой молекулы;

загрузку указанного каркаса и указанного образца в устройство, содержащее нанопору, при этом указанная нанопора соединяет два объема внутреннего пространства устройства;

создание конфигурации устройства с возможностью прохождения указанного каркаса через указанную нанопору, при этом устройство содержит датчик для измерения тока, напряжения, значения рН, оптического признака или времени пребывания, ассоциированного с указанным каркасом; и

определение с помощью датчика наличия или отсутствия транслокации нерасщепленного каркаса через нанопору, для определения, был ли расщепляемый домен расщеплен, с выявлением тем самым присутствия или отсутствия целевой молекулы в указанном образце.

66. Способ по п. 65, при котором указанный каркас содержит молекулу, выбранную из группы, состоящей из дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), дендримера, пептидной нуклеиновой кислоты (PNA), рибонуклеиновой кислоты (РНК), полипептида, гибрида холестерин/ДНК и гибрида ДНК/РНК.

67. Способ по п. 65, при котором расщепляемый домен выбран из группы, состоящей из дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), рибонуклеиновой кислоты (РНК) и полипептида.

68. Способ по п. 65, при котором целевая молекула специфически расщепляет связь указанного расщепляемого домена, выбранного из группы, состоящей из связи углерод-кислород, связи углерод-сера, связи углерод-азот и связи углерод-углерод.

69. Способ по п. 65, при котором расщепляемый домен химически расщепляется в присутствии указанной целевой молекулы, и при котором расщепляемый домен выбран из группы, состоящей из азосоединения, дисульфидного мостика, сульфона, этиленгликольдисукцината, гидразона, ацеталя, имина, винилового эфира, вицинального диола или сложного пиколинатного эфира.

70. Способ по п. 65, при котором указанное устройство дополнительно содержит по меньшей мере одну нанопору, соединенную последовательно с указанной нанопорой, и при котором указанный каркас в ходе транслокации находится одновременно в указанных по меньшей мере двух нанопорах.

71. Способ количественного определения целевой молекулы, которая обеспечивает разрушение связей в расщепляемом линкере, как предполагается, присутствующей в образце, предусматривающий:

введение образца в контакт с молекулой, содержащей расщепляемый линкер, каркасом, выбранным из нуклеиновых кислот, пептидной нуклеиновой кислоты (PNA), дендримеров, линеаризованных белков или пептидов, и молекулярным грузом, тем самым образуя комплекс, при этом указанный расщепляемый линкер специфически расщепляется в присутствии указанной целевой молекулы, и при этом указанный расщепляемый линкер содержит первый домен, который связывается с указанным каркасом, и второй домен, который связывается с молекулярным грузом;

загрузку указанной молекулы, содержащей расщепляемый линкер, указанного каркаса, указанного молекулярного груза и указанного образца в устройство, содержащее нанопору, при этом указанная нанопора соединяет два объема внутреннего пространства устройства;

создание конфигурации устройства с возможностью прохождения указанного комплекса через указанную нанопору, при этом устройство содержит датчик для измерения тока;

определение с помощью датчика, расщеплен ли расщепляемый линкер, путем выявления индивидуальной сигнатуры тока при транслокации через нанопору, причем индивидуальная сигнатура тока нерасщепленного каркаса отличается от индивидуальной сигнатуры тока расщепленного каркаса, с выявлением тем самым присутствия или отсутствия целевой молекулы; и

оценивание концентрации или активности целевой молекулы, как предполагается, присутствующей в образце, с использованием измерений указанного датчика.

72. Способ по п. 71, при котором указанное определение концентрации или активности предусматривает задание числового уровня достоверности для выявления целевой молекулы, как предполагается, присутствующей в образце.

73. Способ по п. 71, при котором указанные стадии введения образца в контакт с указанной молекулой, содержащей расщепляемый линкер, загрузки указанной молекулы, содержащей расщепляемый линкер, указанного каркаса, указанного молекулярного груза и указанного образца в устройство, создания конфигурации устройства и определения, связывается ли каркас с молекулярным грузом, повторяют с варьированием концентраций или активности одного или более из указанного каркаса, указанной молекулы, содержащей расщепляемый линкер, указанного молекулярного груза или указанной целевой молекулы в указанном образце.

74. Способ количественного определения целевой молекулы, которая обеспечивает разрушение связей в расщепляемом линкере, как предполагается, присутствующей в образце, предусматривающий:

введение образца в контакт с молекулой, содержащей расщепляемый линкер, при этом указанный расщепляемый линкер специфически расщепляется в присутствии указанной целевой молекулы;

загрузку указанного образца в устройство, содержащее нанопору, при этом указанная нанопора соединяет два объема внутреннего пространства устройства;

создание конфигурации устройства с возможностью пропускания каркаса, выбранного из нуклеиновых кислот, пептидной нуклеиновой кислоты (PNA), дендримеров, линеаризованных белков или пептидов, через указанную нанопору, расщепляемого линкера, содержащего первый домен, который связывается с указанным каркасом, и второй домен, который связывается с молекулярным грузом, тем самым образуя комплекс, и при этом устройство содержит датчик для измерения тока;

определение с помощью датчика, был ли расщепляемый линкер расщеплен, путем выявления индивидуальной сигнатуры тока при транслокации через нанопору, причем индивидуальная сигнатура тока нерасщепленного каркаса отличается от индивидуальной сигнатуры тока расщепленного каркаса, с выявлением тем самым присутствия или отсутствия целевой молекулы в указанном образце; и

оценивание концентрации целевой молекулы, как предполагается, присутствующей в образце, с использованием измерений указанного датчика.

75. Способ по п. 74, при котором указанное определение концентрации предусматривает задание числового уровня достоверности для выявления целевой молекулы, как предполагается, присутствующей в образце.

76. Способ по п. 74, при котором указанные стадии введения образца в контакт с указанной молекулой, содержащей расщепляемый линкер, загрузки указанного образца в устройство, создания конфигурации устройства и определения, был ли расщепляемый линкер расщеплен, повторяют с варьированием концентраций одного или более из указанного каркаса, указанной молекулы, содержащей расщепляемый линкер, указанного молекулярного груза или указанной целевой молекулы в указанном образце.

77. Набор для выявления присутствия или отсутствия целевой молекулы, как предполагается, присутствующей в образце, содержащий:

устройство, содержащее нанопору, при этом указанная нанопора соединяет два объема внутреннего пространства устройства, а конфигурация устройства обеспечивает прохождение каркаса, выбранного из нуклеиновой кислоты, пептидной нуклеиновой кислоты (PNA), дендримеров, линеаризованных белков или пептидов, расщепляемого линкера, содержащего первый домен, который связывается с указанным каркасом, и второй домен, который связывается с молекулярным грузом, тем самым образуя комплекс, через одну или более пор, при этом устройство содержит датчик для каждой поры, выполненный с возможностью измерения тока и выявления индивидуальной сигнатуры тока при транслокации указанного комплекса через нанопору;

молекулу, содержащую расщепляемый линкер, при этом указанный расщепляемый линкер специфически расщепляется в присутствии целевой молекулы;

молекулярный груз;

каркас, выбранный из нуклеиновых кислот, пептидной нуклеиновой кислоты (PNA), дендримеров, линеаризованных белков или пептидов,

причем указанная нанопора выполнена с возможностью обеспечения транслокации указанного комплекса через нанопору, и

инструкции по применению для выявления присутствия или отсутствия указанной целевой молекулы в образце.

78. Набор по п. 77, в котором указанная молекула, содержащая расщепляемый линкер, связывается с указанным молекулярным грузом.

79. Набор по п. 77, в котором указанная молекула, содержащая расщепляемый линкер, связывается с указанным каркасом.