Способ иммуноферментной диагностики иерсиниозов Советский патент 1992 года по МПК G01N33/535 

Изобретение относится к медицине, предназначено для серологической диагностики иерсиниозов (иерсиниоза и псевдотуберкулеза) в иммуноферментном анализе.

Целью изобретения является упрощение диагностики за счет экспресс-диагностики.

Способ осуществляют следующим образом.

Для получения протеинового антигена, свободно секретируемого в культуральную среду, используют любую культуру патогенных иерсиний, в частности y.pseudotu- berculorls 01. Вирулентность возбудителя контролируют в тесте аутоагглютинабельнс- сти или по плазмидному спектру (наличие Са -зависимой плазмиды вирулентности). Суточную культуру с агара Хоттингера (рН 7,0-7,4) пересевают в бульон Хоттингера в соотношении 1:40, содержащий 20 мМ/л хлорида магния. Для создания оптимальных условий синтеза протеинового антигена, ассоциированного с плазмидой вирулентности, предварительно бульон Хоттингера обрабатывают оксалатом натрия (20 мМ/л) с целью удаления ионов Са . Через 12-16 ч бактериальные клетки удаляют центрифугированием (7000 д, 4°С , 20 мин). Для осаждения продуцируемого в среду протеинового антигена в супернатант добавляют сульфат аммония из расчета 40 гр на 10 мл. Далее, через 8-12 ч инкубации при температуре 4°С, центрифугированием собирают коричнево-желтый осадок протеинового антигена. Полученный антиген диализуют в течение 2 сут против водопроводной воды и сутки против дистиллированной воды.

Постановку ИФА осуществляют в стандартном непрямом варианте. Первоначально готовят рабочее разведение протеинового антигена - 12,5-25,0 мкг/мл (по белку) в 0,1 М карбонат-бикарбонатном буфере (рН 8,0-9,0). Сенсибилизацию полистироловых планшет протеиновым антигеном проводят в течение 16 часов при 4°С. После инкубации планшеты тщательно отсл

с

х|

О

XJ

N

СО СЯ

мывают от несвязавшегося антигена забу- ференным физиологическим раствором (ЗФР) с 0,05% твином-20. Затем в парные лунки полистироловых планшет вносят исследуемые образцы сыворотки крови в раз- ведении 1:400 (скрининг-титр) в ЗФР с 0,05% твином-20 по 100 мкл. Инкубируют при температуре 37°С в течение 1 ч. После отмывки несвязавшихся нтител ЗФР-ром с твином в л чки вносят конЗюгат антител к иммуноглобулинам человека, меченных пе- роксидазой в рабочем разведении и оставляют при 37°С еще на 1 ч. После отмывки планшет в лунки вносят субстратную смесь, состоящую из 10 мг орто-фенилендиамина, 0,35 мл 3% перекиси водорода на 25 мл цитратного буфера (ph 5,0). Через 10 минут ферментативную реакцию останавливают добавлением 10% раствора серной кислоты по 50 мкл в лунку. Учет реакции проводят на вертикальном фотометре при длине волны 492 нм, предварит ел ьно выставив бланк на приборе. Результаты реакции выражают в единицах иммуноферментного анализа (ЕД ИФА), рассчитываемых по формуле (Бюлл. ВОЗ, 1985):

ЕД ИФА - , иДо

где ОДх - средняя оптическая плотность лунок с исследуемы: i образцом;

ОД0- средняя оптическая плотность лунок с пулом донорских сывороток.

Для учета уровня популяционного иммунитета, при выработке контрольных показателей, предварительно проводят обследование не менее 30 практически здоровых лиц, проживающих на территории, где проводится исследование.

При анализе сывороток крови больных за положительные принимаются показате- ли (в ЕД ИФА), превышающие значения контроля на удвоенное среднее квадра- тическое отклонение (И.В.Поляков и соавт. Практическое пособие по медицинской статистике, Л., 1975).

Поскольку протеиновый антиген впервые использовали для определения специфических антител в иммуноферментном анализе, предварительно был проведен ряд модельных опытов по оптимизации условий реакции. Дозу сенсибилизации полистирола подбирали экспериментально в диапазоне концентраций протеинового антигена 100,0-50,0-25,0-12,5-6,25-3,12 мкг(по белку) на 1 мл буфера. В качестве комплексую- щих буферов испытаны карбонат-бикар- бонатный (рН 8,0-9,0-10,0) и фосфатный (рН 7,0). Первоначальное разведение протеинового антигена (100 мкг/мл) титровали в 2-х

кратном интервале до конечной концентрации 3,12 мкг/мл комплексующего о/фера. Сенсибилизацию полистирола проводили протеиновым антигеном в концентрации от 3,12 до 100,0 мкг/мл в течение 16 часов при 4°С и при значении рН буфера 7,0-8,0- 9,0-10,0. После инкубации планшеты тщательно отмывали и в каждую лунку вносили по 100 мкл кроличьей антисыворотки к в разведении 1:400 (скрининг-титр). После добавления конъюгата и проявления реакцию учитывали на вертикальном фотометре МР- 590 Dynatech, Результаты выражали в единицах ИФА по отношению оптической плотности лучок с гипериммунной сывороткой к оптической плотности пула 10 кроличьих неиммунных сывороток. Для учета возможных погрешностей измерения для каждой концентрации протеинового антигена и рН буфера проводились исследования по 8 лункам, рассчитывалась средняя арифметическая и ее ошибка.

Показано, что увеличение сенсибилизирующей концентрации протеинового антигена от 3,12 до 12,5 мкг/мл буфера приводило к повышению чувствительности тест-системы, которая в последующем оставалась примерно на одном уровне независимо от роста концентрации антигена.

Изучение зависимости чувствительности тест-системы от рН комплексующего буфера выявило, что наиболее высокие результаты соответствуют рН 8,0-9,0 (808- 898), что достоверно выше, чем при значениях рН 7,0 и 10,0, при одинаковой сенсибилизирующей концентрации антигена.

Таким образом, наилучшие условия, обеспечивающие максимальную чувствительность тест-системы на основе протеинового антигена наблюдались при дозе сенсибилизации 12,5 и более мкг/мл карбо- нат-бикарбонатного буфера рН 8,0-9,0.

Все дальнейшие исследования и клинические испытания диагностической системы проводили с учетом выбранных оптимальных условий сенсибилизации, т.е. концентрации антигена 12,5 мкг/мл на кар- бонат-бикарбонатном комплексующем буфере, рН 8,0.

Специфичность и чувствительность тест-системы в отношении антител к иерси- ниям других серотипов, оценивали путем исследования комерческих агглютинирующих сывороток против бруцели, сальмонелл, шигелл, нормальной кроличьей сыворотки, а также кроличьих антисывороток к Y.pseudotuberculorls I, III, IV; lenterocolltica 0,3,05.27,09. Антииерсиниоз- j-fbie сыворотки были получены в лаборатории сапронозоь ЦНЙИ Э Ш СССР после трехкратной и,,.,низации животных культурами иерсиний, инактивированными 50% раствором спирта. Активность полученных сывороток контролировали в реакции имму- нодиффузии в геле.

За диагностически значимь-е принимали показатели оптической плотности лунок с антисывороткой, превышающие не менее чем в 2 раза значения оптической плотное л лунок с нормальной кроличьей сывороткой в одинаковых разведениях. Из представленных данных видно, что диагностическая система выявляла антитела по всех антисыворотках к иерсиниям, независимо от вида и серотипа иерсиний в титрах 1:6400 - 1:25600. Положительных результатов при испытании антисывороток к другим энтеро- бактериям в разведении 1:200 (минимальное разведение) и выше обнаружено не было.

Таким образом, в предварительных опытах было показано что при выбранных условиях сенсибилизации антигена на твердой фазе тест-система обладает специфичностью по отношению к антииерсиниозным антителам и достаточно чувствительна (1:6400-1:25600).

Клинические испытания предложенного способа проводились на базе серологиче- ской лаборатории и диагностического отделения инфекционной больницы Ns 1 г. Иркутска с сентября 1989 г по май 1990 г. За это время были исследованы сыворотки крови 256 больных, направленных на обследование и лечение в ГИБ № 1 с подозрением на иерсиниоз и псевдотуберкулез. Возраст больных варьировал на иерсиниоз и псевдотуберкулез. Возраст больных варьировал от 15 до 69 лет, из них женщин было 148, мужчин - 108. Диагноз иерсиниоза или псевдотуберкулеза был подтвержден у 78 из 256 обследуемых больных на основании кли- нико-эпидемиологических данных и результатов бактериологического исследования, Причем, псевдотуберкулез, вызванный 1 се- ротипом возбудителя, выявлен у 49 больных, иерсиниоз, вызванный 03 серотипом - у 5,05.27серотипом-у4и09-у 12 человек. У остальных 178 больных (вторая группа) оказались инфекционные заболевания неи- ерсиниозной этилогии (вирусный гепатит А - 54 человека, вирусный гепатит В - 24, сальмонеллез - 14, трихинеллез - 12, пищевые токсико-инфекции -11, бруцеллез - 11, острая дизентерия - 10, острые респира- торно-вирусные инфекции - 10, ангина - 7, клещевой сыпной тиф Северной Азии № 6, брюшной тиф - 6, корь - 4, клещевой энце-, фалит - 4, хронический гепатит - 3, серозный менингит- 1, лекарственная болезнь - 1). Исследования сывороток на антитела к иерсиниям проводились п обеих группах на 2-4 неделе заболевания как с использованием прототипа, так и предлагаемого способа (табл 1).

Сравнительная оценка эффективности прототипа и разработанного способа диагностики иерсиниозов показаны в таблице.

Как видно из приведенных данных, пу тем известного способа диагностики (прото- тип) специфические антитела были обнаружены в диагностическом уровне у 62

из 78 больных иерсиниозами (79,5±4,6%) и у 18 больных с другими заболеваниями (10,1 ±2,2%) втом числе у 5 больных бруцеллезом. Положительные результаты реакции с сывороткой крови больных бруцеллезом

служат подтверждением известного факта существования в высокой степени тождественных детерминант полиполисахаридов иерсиний серотипа 09 и различных видов бруцелл, что определяет ложноположительные реакции.

При использовании разработанного способа эффективность диагностики, т.е. процент подтверждения диагноза в группе больных иерсиниозами был несколько выше (84,б±4,2%), хотя статистически разли- чия недостоверны, р 0,1. Положительные реакции в группе больных с другими инфек- ционными заболеваниями составили 7,9±2,0% (р 0,1), в том числе только у

одного больного бруцеллезом. Таким образом, предлагаемый способ диагностики иерсиниозов не уступает rtdэффективности прототипу и позволяет ТлоД- твердить диагноз у 84,6% больных

иерсиниозами (иерсиниозом и псевдотуберкулезом)., Пример 1. Готовят рабочее разведе- ние протеинового антигена - 12,5 кмг/мп (по белку) в 0,1 М карбонат-бикарбонатном

буфере, рН 8,0. Сенсибилизацию планшет, протеиновым антигеном проводят в течение 16 ч при 4°С. После инкубации планшеты тщательно отмывают от несвязавшегося антигена забуференным физиологическим

раствором с твином-20. Затем в 8 лунок полистироловых планшет вносят гипериммунную кроличью сыворотку к 1. Сыворотку получают путем внутривенной 3-х кратной иммунизацией животных спиртовым антигеном. Сыворотку вносят в разведении 1:400 по 100 мкл в лунку. В качестве контроля в парные лунки вносят пул из 10 нормаль- ных кроличьих сывороток в том же разведении. Инкубируют в течение 1 часа

при температуре 37°С. После отмывки не- св язавшихся антител в лунки вносят конъю- гат антител к иммуноглобулинам человека, меченных пероксидазой в рабочем разведении и оставляют при 37°С еще на час. После отмывки планшет в лунки вносят субстратную смесь, состоящую из 10 мг ортофени- лендиамина, 0,35 мл 3% перекиси водорода и 25 мл цитратного буфера (рН 5,0), Через 10 минут реакцию останавливают добавлением 10% раствора серной кислоты по 50 мкл в лунку. Учет реакции проводят на вертикальном фотометре при длине волны 492 нм. Результаты реакции выражают в единицах иммуноферментного анализа (ЕД ИФА, которые рассчитываются как отношение оптической плотности лунки с гипериммунной кроличьей сывороткой к средней (по двум лункам) оптической плотности лунок с пулом неиммунной кроличьей сыворотки, умноженное на 100. Поданным 8 измерений вычисляют среднюю арифметическую и ее ошибку, которые составляют ЕД ИФА. Это достоверно выше, чем при дозе сенсибилизации 6,25 мкг/мл (530±36) и при рН комплексующегося буфера 7,0 (537 ±46) и 10,0 (644±47).

Основное преимущество разработанного способа заключается в уменьшении трудоемкости исследования. Так, при использовании традиционного способа диагностики иерсиниозов (прототипа) 256 исследуемых сывороток последовательно анализировали на наличие антител к типо- специфическим антигенам каждого из 8 известных возбудителей заболевания. Всего было проведено 2048 исследований с общей затратой времени 16-20 ч. Проведение работы потребовало использова0

5

0

5

0

5

ния 45 планшет для иммунологических реакций (одноразовых), 224 мг хромогена - ортофенилендиамина и 560 мл конъюгата кроличьих антител к иммуноглобулинам человека.

Применение предлагаемого способа с использованием одной тест-системы, выявляющей антитела к иерсиниям независимо от вида и серотипа возбудителя, позволяет сократить в 8 раз объем исследований, время анализа, расход реактивов и полистироловых планшет без ущерба для эффективности диагностики. Кроме этого, сокращение времени проведения анализа уменьшает длительность контактирования с хромогеном-ортофенилендиамином, который является потенциальным канцерогеном, что также является положительной стороной предлагаемого способа.

Изобретение может найти применение в производстве диагностических препаратов, в лабораторной диагностике иерсиниозов, в научно-исследовательской работе.

Формула изобретения Способ иммуноферментной диагностики иерсиниозов путем иммобилизации антигена на полистирол микрокамер для иммунологических реакций с последующим выявлением антител с помощью ферментной метки, отличающийся тем, что, с целью ускорения способа, для иммобилизации на полистирол используют протеиновый антиген микробов рода Gersinia в концентрации 12,5 мкг/мл на карбонатном буфере рН 8,0-9,0 и при повышении специфических антител по сравнению со здоровыми лицами диагностируют иерсиниоз.

Изобретение относится к области медицины, предназначено для серологической диагностики иерсиниозов (иерсиниоза и псевдотуберкулеза) в иммуноферментном анализе. Цель - упрощение способа за счет экспресс-диагностики. В исследуемой сыворотке крови определяют антитела к общему для рода протеиновому антигену роде Gersinia и при значении реакции, превышающем средние значения обследования практически здоровых лиц на удвоенное среднее квадратичное отклонение, диагностируют заболевание. За положительные принимают значения реакции в ЕД ИФА более 235,4. 1 табл.