СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ИЕРСИНИОЗОВ Российский патент 2000 года по МПК G01N33/569 G01N33/535 A61K39/02 

Описание патента на изобретение RU2152037C1

Изобретение относится к области ветеринарии и может быть использовано в медицинской практике для иммуноферментной серодиагностики кишечного иерсиниоза, вызванного различными серовариантами Yersinia enterocolitica.

Известен способ диагностики иерсиниозов, в частности реактивного артрита у людей, включающий сенсибилизацию полистироловой планшеты липополисахаридным антигеном (ЛПС), выделенным из клеток Yersinia enterocolitica серотипа 0:3, последующую отмывку его от несвязавшегося антигена и выявление антител в сыворотках крови с помощью ферментной метки (коммерческая ИФА тест-система DAKO производство Дании) (1).

Недостатком данного способа является менее высокая чувствительность к выявлению иерсиниозов, вызванных серотипами 0:5, 0:7, 0:8. Кроме того для выполнения способа требуется очищенный антиген, на получение которого затрачивается значительное время, что усложняет его.

Известен также способ диагностики иерсиниозов (иерсиниоза и псевдотуберкулеза у людей), включающий сенсибилизацию полистироловой планшеты протеиновым антигеном, свободно секретируемым в культуральную среду патогенными иерсиниями, в частности Y. pseudotuberculosis 01, с последующим выявлением антител в сыворотках крови с помощью ферментной метки (2).

Недостатком данного способа является также менее высокая чувствительность и специфичность. Способ не позволяет с высокой достоверностью диагностировать иерсиниоз, вызванный Y. enterocolitica серотипа 0:9 ввиду общей антигенной детерминанты их ЛПС (4,6-дезокси-4-формамидо-L-D-маннопиранозила), присущей данному серотипу и различным видам бруцелл. Кроме того, способ более трудоемок в исполнении и на получение используемого антигена требуются значительные затраты времени и средств.

Целью изобретения является повышение чувствительности и специфичности способа иммуноферментной диагностики иерсиниозов, а также его упрощение. Поставленная цель достигается тем, что в качестве антигена для сенсибилизации полистироловой планшеты используют инактивированный корпускулярный антиген из штамма Y. enterocolitica сероварианта 0:3 в забуференном физиологическом растворе (ЗФР) с pH 7,3 с оптической плотностью 0,1 о.е. мутности, устанавливаемой при длине волны 540 нм в кювете толщиной 10 мм, а сенсибилизацию полистироловой планшеты указанным антигеном осуществляют путем ее инкубации при 37oC в течение 15 мин.

Для осуществления способа иммуноферментной диагностики иерсиниозов используют инактивированный иерсиниозный антиген из референтного штамма Y. enterocolitica сероварианта 0:3, выращенного на агаре Хоттингера.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Изучают влияние сенсибилизирующей дозы инактивированного корпускулярного антигена из штамма Y. enterocolitica сероварианта 0:3 на величину показателей Единиц ИФА (БД ИФА) гипериммунной сыворотки к Y. enterocolitica 0:3 при постановке твердофазного ИФА, осуществляемого в стандартном непрямом варианте. Для постановки ИФА используют разведения указанного антигена в забуференном физиологическом растворе (ЗФР, pH 7,3) со следующими значениями оптической плотности, измеренной при длине волны 540 нм в кювете толщиной 10 мм, (ОП540): 0,5; 0,2; 0,1; 0,05 и 0,01 о.е. мутности. Антиген вносят в микротитраторную полистироловую планшету по 100 мкл/лунку и осуществляют ее сенсибилизацию при инкубации в течение 60 мин при 37oC. Планшету отмывают от неприсоединившегося антигена трижды холодной водопроводной водой и 1 раз ЗФР и тщательно стряхивают. Затем в лунки вносят гипериммунную кроличью антииерсиниозную (0:3), а в другие, в качестве контроля, отрицательную (от здорового кролика) сыворотки, взятые в разведении 1:25 600. Инкубацию с сыворотками проводят 1 час при комнатной температуре. После отмывки лунок от несвязавшихся антител в них добавляют антикроличий пероксидазный конъюгат в подобранном рабочем разведении. Инкубируют 1 ч при комнатной температуре. Отмывают. Тщательно стряхивают и добавляют по 100 мкл/лунку субстратной смеси ОФД (орто-фенилендиамин 10 мг, 40 мкл 3% перекиси водорода и 20 мл цитратно-фосфатного буфера, pH 5,5). Через 10 - 20 мин ферментативную реакцию останавливают добавлением 25 мкл/лунку 0,5М серной кислоты (H2SO4). Учет реакции проводят на вертикальном фотометре MicroELISA Auto Reader MR 580 (Dynatech, США) при длине волны 490 нм (ОП490), прибор бланкируют по воздуху. Результаты реакции выражают в единицах иммуноферментного анализа (ЕД ИФА). Данный показатель рассчитывают по формуле:

где ОПх - средняя оптическая плотность лунок с исследуемым образцом;
ОПо - средняя оптическая плотность лунок с отрицательной контрольной сывороткой. За положительные принимают значения ОП490 испытуемой сыворотки не менее, чем в 2 раза превышающие ОП490 отрицательного контроля, выраженные в процентах плюс удвоенное среднее квадратическое отклонение (т.е. ЕД ИФА+2 σ). В нашем исследовании этот показатель равен 244. Результаты представлены в табл. 1.

Из табл. 1 следует, что оптимальной сенсибилизирующей дозой антигена является суспензия клеток с ОП540, равной 0,1 о.е. При этом разведении позитивная сыворотка дает достаточно высокие показатели ЕД ИФА, тогда как в последующих разведениях происходит их снижение.

Пример 2. Изучают влияние времени инкубации на адсорбцию корпускулярного инактивированного антигена из штамма Y. enterocolitica сероварианта 0:3 в лунках полистироловых планшет с использованием оптимальной концентрации микробных клеток (ОП540 0,1 о.е в ЗФР с pH 7,3). Сенсибилизацию лунок проводят в течение 5, 10, 15, 30, 60 и 120 минут при 37oC.

После сенсибилизации в лунки вносят по 100 мкл гипериммунной кроличьей анти-0: 3 сыворотки а в другие, в качестве контроля, отрицательную сыворотку здоровых животных, взятых в одном разведении (1:12800). Далее опыт проводят как описано в примере 1 с момента внесения сывороток. Результаты представлены в табл. 2.

Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что оптимальным режимом сенсибилизации полистироловых планшет корпускулярным иерсиниозным антигеном из штамма Y. enterocolitica сероварианта 0:3 является инкубация их при 37oC в течение 15 минут. Сенсибилизация лунок в течение 5 и 10 минут несколько снижает чувствительность реакции по сравнению с 15-минутной инкубацией. Тогда как увеличение времени инкубации более 15 минут не приводит к сколько-нибудь значительному росту интенсивности окраски конечного продукта реакции и показателей ЕД ИФА.

Пример 3. Изучают влияние pH буферных растворов: фосфатный буфер (pH 5,8 и 8,2), карбонат-бикарбонатный буфер (pH 9,8), ЗФР (pH 7,3), используемых для разведения инактивированного корпускулярного антигена из штамма Y. enterocolitica сероварианта 0:3, на показатели ОП490 конечных продуктов реакции, выраженных в ЕД ИФА. Сенсибилизацию проводят в подобранных оптимальных условиях (ОП540 0,1 о.е., 15 мин при 37oC). После сенсибилизации и отмывки в лунки вносят по 100 мкл положительной анти-иерсиниозной (0:3) сыворотки и отрицательной сыворотки здоровых животных, взятых в одном разведении (1: 25600) в буферном растворе с аналогичным значением pH. Далее опыт проводят как описано в примере 1 с момента добавления сыворотки. Результаты представлены в табл. 3.

Результаты, представленные в табл. 3, свидетельствуют о том, что оптимальным значением pH комплексирующего буфера для разведения антигена при сенсибилизации полистироловых планшет является значение 7,3. При использовании буфера с pH 6,1 в лунках с отрицательной сывороткой наблюдается значительное окрашивание (фон), т.е. понижается специфичность реакции. При использовании буферов с pH 8,2 и 9,8 понижается чувствительность реакции, что выражается в некотором снижении ОП490 положительной сыворотки. В обоих случаях происходит уменьшение величин ЕД ИФА.

Все дальнейшие испытания в предлагаемой диагностической системе проводят на планшетах, сенсибилизированных инактивированным корпускулярным антигеном из штамма Y. enterocolitica сероварианта 0:3, с учетом подобранных оптимальных условий: концентрация антигена по ОП540 0,1 о.е. мутности в ЗФР с pH 7,3 в течение 15 мин при 37oC.

Пример 4. Специфичность и чувствительность различных тест-систем оценивают путем сравнения ЕД ИФА гипериммунных кроличьих сывороток, полученных к различным серовариантам Y. enterocolitica 0:3, 0:5, 0:6, 0:7, 0:8, 0:9; коммерческих сывороток к бруцелле, сальмонеллам, шигеллам, E.coli; нормальных кроличьих и КРС сывороток. Гипериммунные антииерсиниозные сыворотки получают после 3-кратной иммунизации кроликов культурами иерсиний, инактивированными 50% раствором этилового спирта. Активность полученных сывороток контролируют в РА.

Полистироловые планшеты сенсибилизируют инактивированным корпускулярным иерсиниозным антигеном из штамма Y. enterocolitica сероварианта 0:3 в оптимальном отработанном режиме. Для сравнения используют планшеты, сенсибилизированные протеиновым антигеном, полученным из культуральной ростовой среды Y. enterocolitica 0:3 по способу, описанному в прототипе и планшеты из коммерческой тест-системы DAKO (Дания), сенсибилизированные ЛПС Y. enterocolitica 0: 3 (аналог). Исследуют сыворотки: гипериммунные кроличьи к иерсиниям различных серовариантов (0: 3, 0:5, 0:6, 0:7, 0:8, 0:9), антииерсиниозные крупного рогатого скота (КРС) к 0:9 сероварианту, позитивные антибруцеллезные КРС (национальная бруцеллезная стандартная) и кроличьи и нормальные сыворотки кролика и КРС в разведении 1:400 в ЗФР+0,5% Твина 20 (ЗФРТ), вносимых на планшету в трех повторностях. Инкубируют 1 ч при комнатной температуре. Далее опыт проводят как описано в примере 1 с момента добавления сыворотки. Результаты представлены в табл. 4.

Как следует из табл. 4 предложенный способ является более чувствительным и специфичным, поскольку все исследованные гипериммунные кроличьи сыворотки, полученные к различным серовариантам иерсиний, дают на корпускулярном иерсиниозном антигене из штамма Y. enterocolitica сероварианта 0:3 положительные результаты (ЕД ИФА>244); ЕД ИФА анти-бруцеллезных сывороток и антисывороток к другим энтеробактериям были отрицательными (<244).

Из данных, приведенных в примерах, можно сделать вывод, что предлагаемая ИФА тест-система имеет ряд преимуществ перед описанными в аналоге и прототипе.

1. Уменьшение трудоемкости исследования в результате использования в качестве антигена целых клеток культур - Y. enterocolitica 0:3, а не очищенных клеточных или внеклеточных субстанций.

2. Сокращение времени сенсибилизации полистирола антигенами.

3. Предлагаемая ИФА-тест-система обладает более широкой сероварспецифичностью при диагностике Y. enterocolitica по сравнению с аналогом и прототипом. Все проверенные в ней гипериммунные сыворотки, полученные к серовариантам 0:3, 0:5, 0:6, 0:7, 0:8 и 0:9 дают на иерсиниозном антигене положительный результат, тогда как ни одна позитивная бруцеллезная, сальмонелезная, шигеллезная или эшерихиозная сыворотки не реагируют на нем положительно.

Похожие патенты RU2152037C1

название год авторы номер документа
СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ БРУЦЕЛЛЕЗА 1999
  • Богаутдинов З.Ф.
  • Вылегжанина Е.С.
  • Кузьмина В.Б.
  • Астахова Т.С.
  • Ниязов У.Э.
  • Шумилов К.В.
RU2152035C1
ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS. MUSCULUS L., ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К CHLAMYDIA 1998
  • Нагиева Ф.Г.
  • Груздев К.Н.
  • Обухов И.Л.
  • Баркова Е.П.
  • Никулина В.Г.
RU2158760C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ДЛЯ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ПАРАТУБЕРКУЛЕЗА У ЖВАЧНЫХ ЖИВОТНЫХ 1996
  • Тырина В.С.
  • Попова Г.Г.
RU2118538C1
ШТАММ CORONAVIRUS CANINE, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ КОНТРОЛЯ ИММУНОГЕННОЙ АКТИВНОСТИ ВАКЦИН И ПОЛУЧЕНИЯ СЫВОРОТОК ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И ДИАГНОСТИКИ КОРОНАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ СОБАК 1996
  • Ольшанская А.А.
  • Уласов В.И.
  • Захарова Е.Д.
RU2100433C1
ШТАММ BRUCELLA ABORTUS, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ И ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ БИОПРЕПАРАТОВ ПРОТИВ БРУЦЕЛЛЕЗА ЖИВОТНЫХ 1997
  • Калмыков В.В.
  • Шумилов К.В.
RU2130068C1
ШТАММ PESTIVIRUS, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ЛАПИНИЗИРОВАННОЙ ВИРУСВАКЦИНЫ ПРОТИВ КЛАССИЧЕСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ 1996
  • Мищенко Н.К.
  • Груздев К.Н.
RU2096454C1
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИММУНОГЕННОЙ АКТИВНОСТИ АНТИГЕНА ВИРУСА СИНДРОМА СНИЖЕНИЯ ЯЙЦЕНОСКОСТИ - 76 В АССОЦИИРОВАННОЙ ЭМУЛЬСИОННОЙ ИНАКТИВИРОВАННОЙ ВАКЦИНЕ 2001
  • Смоленский В.И.
  • Кочеткова Е.С.
  • Парфенова И.Л.
RU2215293C2
ШТАММ "БГ" ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОЙ БУРСАЛЬНОЙ БОЛЕЗНИ ПТИЦ И ВАКЦИНА ПРОТИВ ИНФЕКЦИОННОЙ БУРСАЛЬНОЙ БОЛЕЗНИ ПТИЦ 1997
  • Борисов А.В.
  • Кузнецов В.Н.
  • Гусев А.А.
  • Кузнецов Ю.В.
  • Смоленский В.И.
  • Норкина С.Н.
RU2127602C1
ШТАММ FELINE CALICIVIRUS, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ КОНТРОЛЯ ИММУНОГЕННОЙ АКТИВНОСТИ ВАКЦИН, ИЗГОТОВЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ И ДИАГНОСТИЧЕСКИХ БИОПРЕПАРАТОВ 2001
  • Рахманина М.М.
  • Элизбарашвили Э.И.
  • Уласов В.И.
RU2184567C1
ВАКЦИНА ПРОТИВ БРУЦЕЛЛЕЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА 1997
  • Калмыков В.В.
  • Шумилов К.В.
RU2108110C1

Иллюстрации к изобретению RU 2 152 037 C1

Реферат патента 2000 года СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ИЕРСИНИОЗОВ

Изобретение предназначено для иммуноферментной серодиагностики (ИФА) кишечного иерсиниоза, вызванного различными серовариантами Yersinia enterocolitica. Для сенсибилизации полистироловой планшеты берут инактивированный корпускулярный антиген из штамма Y. enterocolitica сероварианта 0:3. Антиген используют в забуференном физрастворе с рН 7,3 с оптической плотностью 0,1 о. е. мутности, устанавливаемой при длине волны 540 нм в кювете толщиной 10 мм. Сенсибилизацию полистироловой планшеты осуществляют путем ее инкубации в течение 15 мин при 37oC. Для проверки специфичности и чувствительности тест-системы вносят гипериммунные кроличьи сыворотки различных серовариантов (0: 3, 0: 5, 0:6, 0:7, 0:8, 0:9), антииерсиниозные сыворотки крупного рогатого скота (КРС) к сероварианту 0:9, позитивные антибруцеллезные КРС и кролика, нормальные сыворотки кролика и КРС в разведении 1:400. Инкубируют 1 ч при комнатной температуре. Добавляют антикроличий пероксидазный конъюгат. После инкубации вносят субстратную смесь для ИФА. Через 10 - 20 мин реакцию останавливают серной кислотой. Учет реакции проводят фотометрически. Новая тест-система иммуноферментной диагностики кишечного иерсиниоза является более чувствительной, с более широкой специфичностью, а также менее трудоемкой в проведении исследований. Изобретение позволит повысить эффективность проводимых исследований на иерсиниоз. 4 табл.

Формула изобретения RU 2 152 037 C1

Способ диагностики иерсиниозов, включающий сенсибилизацию полистироловой планшеты антигеном с последующим выявлением антител в сыворотках крови с помощью ферментной метки, отличающийся тем, что в качестве антигена для сенсибилизации полистироловой планшеты используют инактивированный корпускулярный антиген из штамма Y. enterocolitica сероварианта 0:3, в забуференном физиологическом растворе с pH 7,3 с оптической плотностью 0,1 о.е. мутности, устанавливаемой при длине волны 540 нм в кювете толщиной 10 мм, а сенсибилизацию полистироловой планшеты осуществляют путем ее инкубации в течение 15 мин при 37oC.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2000 года RU2152037C1

Способ иммуноферментной диагностики иерсиниозов 1990
  • Малов Игорь Владимирович
  • Рубцов Игорь Васильевич
  • Ющенко Галина Васильевна
  • Леоненко Вячеслав Викторович
SU1767435A1
СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ИЕРСИНИОЗА 1992
  • Яшина Н.В.
  • Дулатова М.В.
  • Фиш Н.Г.
  • Прокопов Н.И.
  • Черкасов В.Р.
  • Кравцов Э.Г.
  • Янина Т.Н.
  • Грицкова И.А.
RU2087913C1
ГОЛОВКА КОЛОННАЯ ТЕРМОСТОЙКАЯ 2003
  • Антониади Д.Г.
  • Власюк А.Е.
  • Волонтырец В.Н.
  • Гилаев Г.Г.
  • Дорошенко В.В.
  • Кузнецов М.В.
  • Паливода М.Д.
  • Цыбин А.В.
RU2234587C1
US 4831126 А, 16.05.1989
Granfors K., Ogasawara M., Hill J.L., Lahesmaa - Rantala R., Toivanen A., Yu DTY
Analysis of IgA antibodies to lipopolysaccharide in Yersiniatriggered reactive arthritis
J.Infect
Dis., 1989, v.159, p.1142-1147.

RU 2 152 037 C1

Авторы

Богаутдинов З.Ф.

Вылегжанина Е.С.

Кузьмина В.Б.

Астахова Т.С.

Ниязов У.Э.

Шумилов К.В.

Даты

2000-06-27Публикация

1999-08-18Подача