СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ БРУЦЕЛЛЕЗА Российский патент 2000 года по МПК G01N33/535 A61K39/00 A61K39/10 

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к иммуноферментной диагностике сельскохозяйственных животных.

Известен способ диагностики бруцеллеза сельскохозяйственных животных, включающий сенсибилизацию полистироловых иммунологических планшет инактивированным корпускулярным антигеном из штамма Br.abortus 19. Адсорбцию антигена ведут в фосфатном буфере с pH 7,2-7,4 в течение 16 ч при 37^oC, производя двукратные разведения, начиная с 1:2 до 1:4098. После отмывки в лунки вносят положительную бруцеллезную или отрицательную контрольную сыворотки крови крупного рогатого скота (КРС) в разведении 1:50 и титруют методом шахматного титрования с двукратных разведений. Инкубируют 1 ч при 37^oC. Отмывают и снова инкубируют с пероксидазным конъюгатом 1 ч при 37^oC.

Результаты выражают либо по оптической плотности образовавшегося реакционного продукта, либо по 4-х крестовой системе визуально. За титр бруцеллезных антител принимают последнее разведение сыворотки, где наблюдается окрашивание конечного продукта с оптической плотностью на 0,10 о.е., превышающее окрашивание отрицательного контроля в этом же разведении (1).

Недостатком данного способа является его невысокая эффективность из-за малой специфичности ввиду одновременного выявления больных животных, реагирующих на бруцеллез и на иерсиниоз, вызванный Y. enterocolitica сероварианта 0:9.

Известен также способ диагностики бруцеллеза сельскохозяйственных животных, включающий сенсибилизацию полистироловой планшеты инактивированным корпускулярным антигеном из штамма Br. abortus 19, разведенным в 0,05М карбонатном буфере, pH 9,6. Антиген сорбируют на планшетах при 4^oC в течение 16 ч. Затем вносят контрольные и испытуемые сыворотки, в которых выявляют антитела с помощью ферментной метки. Субстратом для этого служит орто-фенилендиамин (ОФД) (2).

Недостатком данного способа является менее высокая чувствительность и специфичность.

Целью изобретения является повышение эффективности способа иммуноферментной диагностики бруцеллеза.

Указанная цель достигается тем, что для сенсибилизации полистироловой планшеты дополнительно используют инактивированный корпускулярный антиген из штамма Y. enterocolitica сероварианта 0:3, причем данный антиген, также как и инактивированный корпускулярный антиген из штамма Br. abortus 19, вносят в лунки полистироловой планшеты каждый на одну из ее половин, в забуференном физиологическом растворе, pH 7,3, с оптической плотностью 0,1 о.е. мутности, устанавливаемой при длине волны 540 им в кювете толщиной 10 мм, а сенсибилизацию полистироловой планшеты осуществляют путем ее инкубации при температуре 37^oC в течение 15 мин.

Для осуществления способа используют инактивированный корпускулярный антиген из штамма Br. abortus 19 (единый бруцеллезный антиген для РА, РСК, РДСК) и инактивированный корпускулярный антиген из штамма Y. enterocolitica сероварианта 0:3, выращенный на агаре Хоттингера при 22^oC в течение 2-х суток.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Изучают влияние сенсибилизирующей дозы инактивированных корпускулярных антигенов из штаммов Br. abortus 19 и Y. enterocolitica сероварианта 0:3 на величину показателей Единиц ИФА (ЕД ИФА) анти-бруцеллезных и анти-иерсиниозных положительных сывороток при постановке твердофазного ИФА, осуществляемого в стандартном непрямом варианте. Для постановки ИФА используют разведения указанных антигенов в забуференном физиологическом растворе (ЗФР, pH 7,3) со следующими значениями оптической плотности, измеренной при длине волны 540 нм в кювете толщиной 10 мм, (ОП₅₄₀): 0,5; 0,2; 0,1; 0,05 и 0,01 о. е. мутности. Антигены вносят в лунки полистироловой планшеты по 100 мкл/лунку по следующей схеме: одну половину планшеты (ряды с 1 по 6) заполняют иерсиниозным антигеном; вторую (ряды с 7 по 12) - бруцеллезным и осуществляют се сенсибилизацию, инкубируя в течение 60 мин при 37^oC. Планшету отмывают от неприсоединившегося антигена трижды холодной водопроводной водой и 1 раз ЗФР и тщательно стряхивают. Затем в лунки обоих половин планшеты вносят параллельно на каждый из антигенов положительную анти-бруцеллезную и нормальную сыворотки КРС в разведении 1:1600 в ЗФР с твином (ЗФРТ), а также гипериммунную кроличью анти-иерсиниозную (0:3) и отрицательную (от здорового кролика) сыворотки, взятые в разведении 1:25 600. Инкубацию с сыворотками проводят 1 час при комнатной температуре. После отмывки лунок от несвязавшихся антител в них добавляют анти-кроличий и анти-КРС пероксидазные конъюгаты в подобранных рабочих разведениях. Инкубируют 1 ч при комнатной температуре. Отмывают. Тщательно стряхивают и добавляют по 100 мкл/лунку субстратной смеси ОФД (орто-фенилендиамин 10 мг, 40 мкл 3% перекиси водорода и 20 мл цитратно-фосфатного буфера, pH 5,5). Через 10-20 мин ферментативную реакцию останавливают добавлением 25 мкл/лунку 0,5М серной кислоты (H₂SO₄). Учет реакции проводят на вертикальном фотометре MicroELISA Auto Reader MR 580 (Dynatech, США) при длине волны 490 нм (ОП₄₉₀), прибор бланкируют по воздуху. Результаты реакции выражают в единицах иммуноферментного анализа (ЕД ИФА). Данный показатель рассчитывают по формуле

где ОП_х - средняя оптическая плотность лунок с исследуемым образцом;
ОП_о - средняя оптическая плотность лунок с отрицательной контрольной сывороткой. За положительные принимают значения ОП₄₉₀ испытуемой сыворотки, не менее чем в 2 раза превышающие ОП₄₉₀ отрицательного контроля, выраженные в процентах плюс удвоенное среднее квадратическое отклонение (т.е. ЕД ИФА+2σ). В нашем исследовании этот показатель равен 244. Результаты представлены в табл. 1.

Как следует из табл. 1, наиболее предпочтительной для сенсибилизации полистироловой планшеты дозой использованных в опыте бруцеллезного и иерсиниозного антигенов является суспензия клеток с оптической плотностью (ОП₅₄₀), равная 0,1 о.е. При этом разведении антигенов позитивные сыворотки дают наиболее высокие значения ОП₄₉₀ при наименьшем фоне негативных сывороток и как следствие более высокие значения ЕД ИФА.

Пример 2. Изучают влияние времени инкубации на адсорбцию корпускулярных инактивированных антигенов из штаммов Br.abortus 19 и Y.enterocolitica сероварианта 0:3 в лунках полистироловых планшет с использованием оптимальной концентрации микробных клеток (ОП₅₄₀ 0,1 о.е в ЗФР с pH 7,3). Антигены вносят на одну полистироловую планшету каждый на свою половину. Сенсибилизацию лунок проводят в течение 5, 10, 15, 30, 60 и 120 минут при 37^oC.

После сенсибилизации в лунки вносят параллельно на оба антигена по 100 мкл положительной анти-бруцеллезной и нормальной сыворотки КРС в разведении 1: 1600 в ЗФРТ, а также гипериммунной кроличьей анти-0:3 сыворотки, а в качестве контроля, отрицательной сыворотки здоровых кроликов, взятых в одном разведении (1:12800). Далее опыт проводят, как описано в примере 1, с момента внесения сывороток. Результаты представлены в табл. 2.

Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что оптимальным режимом сенсибилизации полистироловых планшет корпускулярными антигенами из штаммов Br. abortus 19 и Y. enterocolitica сероварианта 0:3 является инкубация их при 37^oC в течение 15 минут. Сенсибилизация лунок в течение 5 и 10 минут несколько снижает чувствительность реакции по сравнению с 15-минутной инкубацией. Тогда как увеличение времени инкубации более 15 минут не приводит к сколько-нибудь значительному росту интенсивности окраски конечного продукта реакции и показателей ЕД ИФА.

Пример 3. Изучают влияние pH буферных растворов: фосфатный буфер (pH 5,8 и 8,2), карбонат-бикарбонатный буфер (pH 9,8), ЗФР (pH 7,3), используемых для разведения инактивированных корпускулярных антигенов из штаммов Br. abortus 19 и Y. enterocolitica сероварианта 0:3, на показатели ОП₄₉₀ конечных продуктов реакции, выраженных в ЕД ИФА. Антигены вносят на одну полистироловую планшету каждый на свою половину. Сенсибилизацию проводят в подобранных оптимальных условиях (ОП₅₄₀ 0,1 о.е., 15 мин при 37^oC). После сенсибилизации и отмывки в лунки вносят параллельно на оба антигена по 100 мкл положительной анти- бруцеллезной и нормальной сыворотки КРС в разведении 1: 1600, а также положительной анти-иерсиниозной (0:3) сыворотки и отрицательной сыворотки здоровых кроликов, взятых в одном разведении (1:25600) в ЗФРТ с аналогичным значением pH. Далее опыт проводят, как описано в примере 1, с момента добавления сыворотки. Результаты представлены в табл. 3.

Результаты, представленные в табл.3, свидетельствуют о том, что оптимальным значением pH комплексирующего буфера для разведения антигенов при сенсибилизации полистироловых планшет является значение 7,3. При использовании буфера с pH 6,1 в лунках с отрицательной сывороткой наблюдается значительное окрашивание (фон), т.е. понижается специфичность реакции. При использовании буферов с pH 8,2 и 9,8 понижается чувствительность реакции, что выражается в некотором снижении ОП₄₉₀ положительной сыворотки. В обоих случаях происходит уменьшение величин ЕД ИФА.

Пример 4. Специфичность и чувствительность предложенного способа оценивают путем сравнения ЕД ИФА положительных анти-бруцеллезных сывороток КРС, анти-иерсиниозных к 0:9 сероварианту сывороток КРС, гипериммунных кроличьих сывороток, полученных к различным серовариантам Y. enterocolitica 0:3, 0:5, 0:6, 0:7, 0:8, 0:9; нормальных кроличьих и КРС сывороток. Гипериммунные антииерсиниозные сыворотки получают после 3-кратной иммунизации кроликов культурами иерсиний, инактивированных 50% раствором этилового спирта. Активность полученных сывороток контролируют в РА.

Полистироловые планшеты сенсибилизируют инактивированными корпускулярными антигенами из штаммов Br. abortus 19 и Y. enterocolitica сероварианта 0: 3, нанесенными каждый на свою половину, при концентрации антигенов по ОП₅₄₀-0,1 о.е. мутности в ЗФР с pH 7,3, в течение 15 мин при 37^oC. Сыворотки вносят в лунки планшеты в разведении 1:400 в ЗФРТ в трех повторностях. Инкубируют 1 ч при комнатной температуре. Далее опыт проводят, как описано в примере 1, с момента добавления сыворотки. Результаты представлены в табл.4. Результаты табл.4 свидетельствуют о том, что предложенный способ ИФА диагностики бруцеллеза является чувствительным и специфичным. Средние значения ЕД ИФА положительных анти-бруцеллезных и анти-иерсиниозных сывороток были положительными (>244) на гомологичных антигенах и отрицательными (<244) - на гетерологичных. Положительные сыворотки КРС, полученные от животных, зараженных Y. enterocolitica 0:9, дают положительные ЕД ИФА (>244) на обоих антигенах.

Пример 5. Исследуют 10 сывороток крови КРС из неблагополучного по бруцеллезу хозяйства. Планшету сенсибилизируют инактивированными корпускулярными антигенами из штаммов Br. abortus 19 и Y. enterocolitica сероварианта 0: 3 также, как в примере 4. Сыворотки крови КРС из неблагополучного по бруцеллезу хозяйства, а также положительную анти-бруцеллезную и анти-иерсиниозную 0: 9 и нормальную разводят 1:400 в ЗФРТ и вносят в количестве 100 мкл/лунку в тройной повторности на каждый антиген. Реакцию ИФА проводят, как описано в примере 1, с момента внесения сывороток. Результаты представлены в табл. 5.

Положительные результаты (БД ИФА > 244), полученные в ИФА на поле планшеты, сенсибилизированном инактивированным корпускулярным бруцеллезным антигеном с сыворотками крови животных из неблагополучного по бруцеллезу хозяйства, в 100% случаев были подтверждены результатами РА и РСК с Единым бруцеллезным антигеном, и ни одна из них не реагировала положительно на иерсиниозном антигене, что свидетельствует о высокой чувствительности и специфичности предложенного способа.

Пример 6. Исследуют 10 сывороток крови КРС из благополучного по бруцеллезу хозяйства, давшие ложноположительные результаты на бруцеллез в РА и РСК с единым бруцеллезным антигеном. Планшету сенсибилизируют инактивированными корпускулярными антигенами из штаммов Br. abortus 19 и Y. enterocolitica сероварианта 0:3 также как в примере 4. Исследуемые сыворотки крови КРС, а также положительные анти-бруцеллезную и анти-иерсиниозную 0:9 и нормальную сыворотку КРС разводят 1: 400 в ЗФРТ и вносят в количестве 100 мкл/лунку в тройной повторности на каждый антиген. Реакцию ИФА проводят, как описано в примере 1, с момента внесения сывороток. Результаты представлены в табл. 6.

Сыворотки из благополучных по бруцеллезу хозяйств, показавшие ложноположительные реакции в РА на бруцеллез с единым бруцеллезным антигеном, не дали положительных результатов на бруцеллезном антигене в предложенном способе ИФА диагностики (ЕД ИФА < 244), исключив таким образом диагноз бруцеллез. На иерсиниозном антигене всего две из шести проверенных сывороток были отнесены к иерсиниозным по показателю ЕД ИФА (> 244). Сыворотки крови быков, зараженных Y. enterocolitica сероварианта 0:9, показали позитивную реакцию на обоих антигенах
Из данных, приведенных в примерах, можно сделать вывод, что предлагаемая ИФА тест-система имеет ряд преимуществ перед описанными в аналоге и прототипе.

1. Увеличение экспрессности метода за счет дифференциальной диагностики бруцеллеза и кишечного иерсиниоза.

2. Сокращение времени сенсибилизации полистирола антигенами.

3. Проведение всех операций после добавления сывороток при комнатной температуре, что может иметь преимущество при полевых исследованиях сывороток крови животных.

Предложенный способ диагностики бруцеллеза является более чувствительным и специфичным и менее трудоемким. Дает возможность предложить для ветеринарной практики новую тест-систему ИФА, позволяющую дифференцировать бруцеллез крупного рогатого скота от кишечного иерсиниоза, вызываемого Yersinia enterocolitica сероварианта 0:9. Использование предложенного способа в ветеринарной практике позволит повысить эффективность проводимых исследований на бруцеллез.

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к способу иммуноферментной диагностики бруцеллеза сельскохозяйственных животных. Способ осуществляется следующим образом: для сенсибилизации полистироловой планшеты дополнительно используют инактивированный корпускулярный антиген из штамма Y. enterocolitica сероварианта 0:3, причем данный антиген, также как и инактивированный корпускулярный антиген из штамма Br. abortus 19, вносят в лунки полистироловой планшеты, каждый на одну из ее половин, в забуференном физрастворе с рН 7,3 с оптической плотностью 0,1 о.е. мутности, устанавливаемой при длине волны 540 нм в кювете толщиной 10 мм, а сенсибилизацию полистироловой планшеты осуществляют путем ее инкубации при 37°C в течение 15 мин. Новая тест-система иммуноферментной диагностики бруцеллеза является более чувствительной, специфичной и менее трудоемкой. Дает возможность дифференцировать бруцеллез крупного рогатого скота от кишечного иерсиниоза, вызываемого Yersinia enterocolitica сероварианта 0:9. Использование предложенного способа в ветеринарной практике обеспечивает повышение эффективности проводимых исследований на бруцеллез. 6 табл.

Способ диагностики бруцеллеза сельскохозяйственных животных, включающий сенсибилизацию полистироловой планшеты инактивированным корпускулярным антигеном из штамма Br. abortus 19 с последующим выявлением антител в сыворотках крови с помощью ферментной метки, отличающийся тем, что для сенсибилизации полистироловой планшеты дополнительно используют инактивированный корпускулярный антиген из штамма Y. enterocolitica сероварианта 0:3, причем антигены вносят каждый на свою половину полистироловой планшеты в забуференном физиологическом растворе, pH 7,3 с оптической плотностью 0,1 о.е. мутности, устанавливаемой при длине волны 540 нм в кювете толщиной 10 мм, а сенсибилизацию полистироловой планшеты осуществляют путем ее инкубации в течение 15 мин при 37°С.